脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性检测方法

脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性检测方法

左　玉

（太原师范学院，　山西太原　030031）

摘　要：越来越多研究表明，很多疾病和衰老现象都与脂质过氧化有关。该文对近年脂质过氧化及抗氧化剂抗氧化活性检测方法作简单综述，包括气相色谱、液相色谱、质谱、化学发光法等，并对不同方法进行综合比较与评价。因各种检测技术对象各有不同，且各自各有优缺点，因此，要针对不同实验目的及条件以选择不同检测方法。关键词：脂质过氧化；抗氧化剂；抗氧化活性

The Detection methods of antioxidant activities of antioxidants

and lipids peroxidation

ZUO Yu 1

(Taiyuan Normal University, Taiyuan 030031, China)

Abstract ：Lipid peroxidation has received considerable attention because of its possible contribution to the potential damage of biological systems. The study on the mechanism and the protection of lipid peroxidation are concerned to our living and health. Lipids peroxidation and the methods of determination of peroxidation and antioxidant activities in biological systems were reviewed, including Gas chromatography, Liquid Chromatography, MS, Chemiluminescence and so on. Different methods are compared comprehensively and evaluated. A variety of detection technologies have different target clientele, but also have their own advantages and disadvantages. Therefore, it is necessary for different experimental purposes and conditions to choose a different detection method.Key word ：lipid peroxidation ；antioxidant ；antioxidant activity

中图分类号：TS201.2＋2 文献标识码：A 文章编号：1008―9578（2009）02―0039―04收稿日期：2009–01–08

在生物体内，很多脂类含有多不饱和脂肪酸，特别

在生物膜的磷脂中，多不饱和脂肪酸含量极高。由于不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，很易受到过氧化作用损伤，产生有细胞毒性的脂质过氧化物。这些化合物能破坏人体细胞正常生理功能，促使人体衰老和诱发癌症。目前国内外关于氧化应激、自由基损伤和生物抗氧化研究主要集中在食品、化妆品、及生理学、流行病学等领域，但从分子水平研究其作用机理、基元反应和结构/活性关系的工作尚不多见，许多基础理论问题尚待解决。因此，脂质过氧化检测方法在反应机理研究中就显得尤为重要。

各种抗氧化物质作用强弱，取决于其抗氧化能力（或称抗氧化活性，Antioxidant Activity）。抗氧化测定方法有许多种，有直接的，也有间接的，还有简便总抗氧化能力（TAC）试剂盒等。这些方法都有一定优缺点或局限性（或专用性），测定原理各不相同；因此，为能得出准确评价结论，还需综合评估各种方法，以获得满意结果〔1〕。

1 脂质过氧化反应机理

脂质过氧化作用（Lipid Peroxidation）是自由基生物学一个分支，系指脂类（RH）多不饱和脂肪酸（PUFA）与自由基反应，形成中间体自由基，再与分子氧化反应形成脂质过氧化自由基，引起酸败作用〔2〕。生物膜脂质中含有较多多不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化而损伤膜的功能与结构。正常生命过程产生自由基为维持生命所必须，但若浓度过高则对机体有害。体内自由基产生与清除处于动态平衡中，一旦平

衡破坏就会危害机体。环境中有多种因素促使自由基

产生，引起脂质过氧化，例如电离辐射、紫外线、臭氧、废气、杀虫剂、除草剂、光敏剂及金属离子等〔3〕。

自由基是指一类可独立存在含有未配对电子物质，包括分子、原子、原子团或离子。若这类物质含有不配对电子的含氧基团称为氧自由基（OFR），主要

包括超氧阴离子自由基（O 2–

）、过氧化氢（H 2O 2）、羟自

由基（HO·）、单线态氧（1

O 2）等。这些不成对电子使OFR 具有不稳定性和高反应活性〔4~5〕。

脂质过氧化是一个产生自由基和自由基参于链式反应过程，可分为三个阶段：（1）诱导阶段：RH →R·＋H·（2）传导阶段：R·＋O 2→ROO·

ROO·＋RH →ROOH ＋R·

生成ROOH 很容易发生各式各样分解反应，例如：

ROOH →RO·＋HO·

RO·和HO·都是非常活泼自由基，与RH 反应均能生成R·：

RO·＋RH →ROH ＋R·RH ＋HO·→H 2O ＋R·（3）终止阶段：

各种自由基在量增加后相互结合，链式反应终止：R·＋R·→RR

ROO·＋R·→ROOR

ROO·＋ROO·→ROOR＋O2

式中RH为参加反应油脂中不饱和底物，H是邻近双键两旁亚甲基上氢原子。反应过程中产生的R·、ROO·、RO·及HO·等自由基均可由自旋共振仪测定。

2 脂质过氧化检测

2.1 脂质过氧化底物检测

2.1.1 氧耗

不饱和脂肪酸发生脂质过氧化过程将伴随氧气消耗，因此氧耗也成为检测脂质过氧化指标之一。氧耗测定可采用Wills测压法及氧电极法，后者较为常用。且此法只需一个氧电极即可，利用氧电极能很方便测量溶液中氧浓度，因此，可用它检测一个反应体系中氧消耗，以研究自由基产生动力学过程。氧气吸收量用电子电位差计纪录，它还可连续检测脂质过氧化进程，但体系必须封闭。

最近，又发展一种自旋探针测氧法，系利用自旋探针ESR波谱超精细结构随氧浓度改变以测量一个反应体系氧浓度方法。氧气是一个顺磁性三重态分子，可与自旋探针未成对电子产生自旋相互作用，使自旋探针ESR波谱产生自旋―自旋增宽，使本来存在一些超精细结构无法分辨。利用超精细结构随氧气浓度改变就可测量该体系中浓度和氧消耗；但利用该法测量生物体系氧消耗时间不能太长，也不能有氧化还原反应。

2.1.2 增重法

脂质过氧化过程中必定要吸收一定的氧，底物吸氧后形成过氧化物增重。通过对氧化混合物作NMR 分析，由乙烯基质子峰面积可得出不饱和脂肪酸氧化随时间变化情况。此法只适于常温下反应，且底物体系中无易挥发物质。

2.2 脂质过氧化产物检测

2.2.1 脂自由基

在脂质过氧化进程中会产生许多自由基，如R·、ROO·、RO·、HO·等，这些自由基含有一个未成对电子，这就决定具有顺磁性和很高反应活性。所有检测自由基方法都根据自由基这两个特性发展起来的，这些方法可分为物理方法和化学方法两大类。所有检测自由基方法原则上都可检测氧自由基；但氧自由基具有其自己特性，所以还有一些检测氧自由基特殊方法。

电子自旋共振（electron spin resonance，ESR）又称电子顺磁共振（electron paramagneticreonance，EPR），是检测自由基最直接、最有效方法。根据共振条件hv=gβH，一个ESR波谱仪就是一套用来测量自由基时要满足这个共振条件设备。一般ESR波谱仪都是固定频率，改变磁场以满足共振条件，因此称为扫场式。由于高频微波热效应很大，特别对含水样品，水对微波吸收很厉害，所以，一般高频ESR波谱仪不能测量活体中自由基。最近发展低频L波段ESR波谱仪解决这一问题，一是热效应低，二是样品腔大，可容纳大体积样品，甚至活体动物。

近年发展自旋捕集技术具有更广应用空间。所谓自旋捕集技术就是为检测和辨认短寿命自由基，将一

种不饱和抗磁性物质（称自旋捕集剂，一般为氨酮和亚硝基化合物）加入要研究反应体系，生成寿命较长自旋加合物，可用ESR检测：

自旋捕集剂＋R·→自旋加合物

最常用自旋捕集剂tNB（nitrosotert–butane），DMPO （5，5–dimethyl–pyrroline–1–oxide），PBN（phenyl–tert–butynitrone），它们与自由基反应都可生成氮氧自由基，所得ESR波谱一级分裂都是氮原子引起三重分裂，这一点和自旋标记所得到ESR波谱很类似。但自旋加合物ESR波谱常常被分裂为二、三级更复杂图谱，由二、三级分裂峰制得数目和强度可推导出捕捉到自由基结构和性质。

2.2.2 共轭二烯氢过氧化物（CDHP）

不饱和脂肪酸侧链氧化过程中伴随有CDHP生成，该共轭二烯结构在紫外区234 nm附近具有很强特征吸收，因此可利用这一特征对脂质过氧化进行检测。该法操作简单，一个简单紫外分光光度计即可。该法适于检测纯度较高脂质过氧化反应，因反应体系中其它底物也可能在这个波长范围内有吸收；另一个误差来源于脂肪酸本身在紫外区（210 nm）吸收和CDHP（234 nm）吸收只差20 nm；且CDHP本身也是一个不稳定化合物。因此，CDHP含量多少不能准确反映脂质过氧化程度，它只能部分反映氧化初始阶段脂质过氧化程度。

2.3 脂质过氧化降解产物检测

脂质过氧化物很不稳定，可自发降解成小分子复杂产物，如醛、酮、烷烃、烯烃、酸及聚合物等。对这些降解产物检测被认为是最能有效反映脂质过氧化水平，其中丙二醛（MDA）是脂质过氧化最典型终产物。

2.3.1 化学发光（CL）法

发光是处于高能激发态分子或原子向基态跃迁时发射光子现象。化学发光法是由化学反应所引发，发射光可以是紫光，可见光或近红外光。能产生发光反应化合物（有机物或无机物）很多，典型反应可表示为：（*表示激发态）

A＋B —→C*＋DC* —→C＋光

化学发光法中，常用一些发光增强剂以提高检测灵敏度，常用试剂有鲁米诺（luminal）、洛粉碱（luphine）、光泽精（lucigenin）和过氧物（peroxyoxadate）等。

化学发光测定最大优点是不需对反应体系加热，因即使在室温条件下反应速度也非常快。将HPLC 分离与化学发光法联用，可将检测限达到皮摩尔级。采用HPLC柱后，检测技术还克服HPLC受抗氧化剂干扰缺点，从而可通过测定保留时间鉴定脂质氢过氧化物性质。0.01 nm脂质过氧化物很易检出，反相液相色谱能使氢过氧化物得到很好分离。化学发光法具有灵敏度高、安全性好、适用范围广、发射率易控制等优点，故已在分析化学中得到广泛应用；但也存在有些反应观察时间长、重现性差等缺点。

烃和脂被氧化时会发光，这与氧化过程中不同步骤产生自由基有关。化学发光强度越大，通常说明氧