叶绿素的提取分离及含量测定

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叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定

取鲜叶3-5g+95%乙醇15-25ml（逐步加入）,磨成匀浆

过滤入三角瓶中
观察荧光现象透射光色，反射光光。
定性实验无需移液管量皂化反应(约1ml)
加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和H2O 1ml 分层后观察上层呈吸收下层呈吸收色，为光。色,为光。， ,
取代反应（约1mL）
在400-700nm处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰
• 3．叶绿素定量分析：
称取鲜叶0.1g，加1.9mlH2O，磨成匀浆，取2份 0.2ml 分别加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心 5min, 上清液在 649 ， 652 ， 665 测定 OD ，计算 Chla,Chlb 和Chl总量的值。
5、定量分析：叶绿素吸收红光和兰紫光，红
光区可用于定量分析，其中665 和649用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量测定
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 400 500 Waverlength(nm) 600 700
a
b
• 实验步骤 1．定性分析：
加醋酸约1ml，变褐为_________叶绿素 , 取1/2加醋酸铜粉,加热变色，为叶绿素。
2、叶绿素和类胡萝ຫໍສະໝຸດ 素的吸收光谱测定：皂化反应的上层黄色石油醚溶液弃上层，反复用石油醚萃取,直到无类胡萝卜素, 得叶绿素(盐)
（稀释470nm OD 0.5-1）（稀释，665nm OD 0.5-1）
• 五、实验数据记录和处理
• Ca(mg/L)=13.95A665-6.88 A649 • Cb (mg/L) =24.96A649-7.32 A665 • CT (mg/L) = Ca+ Cb 或A6521000/34.5

叶绿素的提纯实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 了解叶绿素的结构和性质。

2. 掌握叶绿素的提取和提纯方法。

3. 学习利用有机溶剂提取叶绿素，并通过色谱法进行分离和纯化。

二、实验原理叶绿素是绿色植物中进行光合作用的重要色素，主要由叶绿素a和叶绿素b组成。

叶绿素不溶于水，但可溶于有机溶剂，如乙醇、丙酮等。

通过提取和提纯，可以得到高纯度的叶绿素，为进一步研究其性质和作用提供条件。

实验过程中，首先将植物叶片用有机溶剂提取叶绿素，然后通过层析法分离叶绿素和其他色素，最后收集纯化的叶绿素。

三、实验器材1. 新鲜植物叶片（如菠菜、青菜等）2. 研钵、研杵3. 乙醇、丙酮（分析纯）4. 层析柱、层析板5. 滤纸、脱脂棉6. 移液管、滴管7. 恒温水浴锅8. 显微镜9. 紫外-可见分光光度计四、实验步骤1. 提取叶绿素（1）取新鲜植物叶片，用剪刀剪碎，放入研钵中。

（2）加入适量乙醇和丙酮（体积比1:1），研磨至匀浆。

（3）将匀浆倒入分液漏斗，静置分层。

（4）收集有机层，用无水硫酸钠干燥。

（5）过滤，得到叶绿素提取液。

2. 分离叶绿素（1）将层析板放入层析柱中，在底部铺一层脱脂棉。

（2）取适量叶绿素提取液，用移液管滴加于层析板上，确保液面低于层析板边缘。

（3）选择合适的溶剂系统，如正己烷-乙酸乙酯（体积比4:1）。

（4）将溶剂滴加于层析板上，观察层析过程，直至溶剂前沿到达预定位置。

（5）取出层析板，用铅笔标记层析结果。

3. 收集纯化叶绿素（1）用移液管收集叶绿素层，倒入小烧杯中。

（2）加入少量乙醇，搅拌均匀。

（3）用滤纸过滤，收集滤液。

（4）将滤液倒入蒸发皿中，用恒温水浴锅蒸干。

（5）用少量乙醇溶解残留物，得到纯化叶绿素。

五、实验结果与分析1. 叶绿素提取：通过有机溶剂提取，可以得到绿色叶片提取物，表明叶绿素已从植物叶片中提取出来。

2. 叶绿素分离：通过层析法，可以将叶绿素与其他色素分离，证明叶绿素具有独特的性质。

3. 叶绿素纯化：通过蒸发和溶解，可以得到纯化的叶绿素，说明实验过程中叶绿素得到了有效的纯化。

叶绿素的提取与分析测定

植物叶绿体色素的分析一、实验目的：1、学会叶绿体色素的分离方法。

2、掌握叶绿素的定量测定。

一、3、了解高等植物叶绿体色素的种类组成、性质。

二、实验原理：1、叶绿体色素的提取：（1）原理：叶绿体色素是植物捕获太阳能进行光合作用的重要物质，高等植物的叶绿体色素一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。

叶绿体色素的提取是利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,将待测的植物叶片用研钵研磨让植物组织破碎，利用丙酮的溶解能力将叶绿体色素溶于丙酮中，通过用滤纸过滤分离植物组织碎片，即可以得到叶绿体色素的丙酮粗提液。

（2）步骤：称取新鲜的植物叶子(菠菜等)4g，放入研体中加5ml80%丙酮，少许碳酸钙和石英砂,研磨成匀浆,再加入20ml丙酮，以漏斗过滤到棕色瓶中备用2、叶绿体色素的分离：（1）原理：叶绿体色素的分离提纯一般用层析的方法，其中纸层析是最简单的一种。

当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，引起它们的移动速度不同，因而使混合物分离。

（2）步骤：1）取滤纸条(6.5×30cm),在离纸边1.5cm处用铅笔划一直线，在另一端两角分别拴上一根线(见图1)，用毛细管取吸绿素提取液沿着铅笔线划一条样带，使样带宽度在3mm以内，如色素过淡用电吹风吹干后再点数次，直到样带呈深绿色为止。

2）在层析缸中加入四氯化碳20ml及少许无水硫酸钠,然后将滤纸吊在层析缸中,使下端浸入溶剂中,色素点要略高于液面,滤纸条边缘不可碰到层析缸璧(如图2)用聚乙烯薄膜两层封住层析缸,直立于暗处层析。

3）0.5小时后，观察色素带分布(最上端是橙黄色的胡萝卡素，其次是黄色的叶黄素，然后是兰绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b)，记录色谱图。

如图所示：3、叶绿体色素的性质（一）荧光现象：叶绿体色素在吸收光能以后可以从基态跃迁到激发态，当处于第一单线态（激发态）的电子再回到基态时其携带的能量将以光的形式放射出来产生荧光，叶绿素荧光的颜色是红色的。

实验四叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定

实验四：叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定实验目的1、了解叶绿素分离与提取的原理和方法2、了解它们的光学特性和理化性质3、了解叶绿素a、b含量测定的方法。

实验原理1.脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

2.分离：（1）叶绿体色素的分离＜纸层析法＞因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。

纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。

由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。

（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离<皂化反应>叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。

3.叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比，即：A=φCL(φ为吸光系数) 因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。

测定663nm 和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。

其校正过的公式为：Ca＝12.7A663－2.69A645 Ca:叶绿素a浓度,mg/LCb＝22.9A645－4.68A663 Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT＝Ca + Cb CT:叶绿素总浓度,mg/L实验器材：1、仪器：剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、天平、研钵、滤纸2、试剂：石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液3、材料：菠菜实验步骤：1、叶绿素的提取称取去中脉叶片2g左右，剪碎放入研钵中加丙酮5ml，少许碳酸钙和石英砂，研磨成浆，再加入丙酮10ml，用漏斗过滤即为色素提取液，暗处备用。

叶绿体色素的提取、分离及定量测定

叶绿体色素的提取、分离及定量测定一、实验结果1、滤纸带纸层析：2、圆形滤纸层析：3、叶绿素a 、b 含量的测定Ca=12.7A663—2.69A645 Cb=22.9A645—4.68A663推动剂边缘胡萝卜素叶黄素叶绿素a （蓝绿色）叶绿素b （黄绿色）叶绿素b （黄绿色）叶绿素a （蓝绿色）叶黄素胡萝卜素推动剂边缘次数组数Ca=31.35（稀释后数据计算）Cb=15.04（稀释后数据计算）二、问题思考1、大部分植物依靠光合作用合成自身生长繁殖所需的有机物。

光合作用所需色素主要有类胡萝卜素和叶绿素。

其中直接参与光合的是叶绿素a，中心色素，其余为天线色素。

2、叶绿素为双羧酸的酯，一个羧基被甲醇酯化，另一个羧基被叶绿醇酯化。

不溶于水而溶于有机溶剂如酒精、丙酮、石油醚。

叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色。

结构的基本特点为拥有一个卟啉环头部及一条叶醇链尾部。

其卟啉环头部由四个甲烯基和四个吡咯环连接而成，大环中央有一个镁原子和四个氮原子结合。

镁原子带正电荷，相连的氮原子偏于带负电荷，因此卟啉环呈极性亲水，可以与蛋白质结合。

尾部叶醇基具有疏水性，为脂溶性物质。

叶绿素a、b结构基本相同，以-CHO代替CH3即为叶绿素b。

叶绿素吸收光谱3、纸层析可行原因：a、色素可提取b、色素可以溶解于某些溶剂中c、不同类型色素在同一溶剂中溶解度不同d、色素分子不会吸附滤纸纤维上e、色素分子可以在体外条件下稳定存在4、本次实验叶绿素a、b含量比值偏低，说明实验有误差。

而由于叶绿素a含有醛基，易于被氧化，亦可导致a的含量下降。

同时由于实验在11月末进行，植物中叶绿素含量下降，a，b的比值可能会受影响。

5、实验注意事项：a、叶片要选取绿色较深的部位，去除叶脉；b、尽量先剪碎，便于之后的研磨；c、研磨前加入二氧化硅和碳酸钠，注意用量。

量少研磨不充分，叶绿素会被液泡中的有机酸破坏；量大不易过滤完全且会使色素层析时颜色变淡；d、过滤时所用棉花不可过多，否则滤液完全被棉花吸收。

叶绿体色素的提取、分离及含量测定

叶绿体色素的提取、分离及含量测定实验目的叶绿素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。

叶绿素a与叶绿素b是高等植物叶绿体色素的重要组分，约占到叶绿体色素总量的75%左右。

叶绿素在光合作用中起到吸收光能、传递光能的作用(少量的叶绿素a还具有光能转换的作用)，因此叶绿素的含量与植物的光合速率密切相关，在一定范围内，光合速率随叶绿素含量的增加而升高。

另外，叶绿素的含量是植物生长状态的一个反映，一些环境因素如干旱、盐渍、低温、大气污染、元素缺乏都可以影响叶绿素的含量与组成，并因之影响植物的光合速率。

因此叶绿素含量a与叶绿素b含量的测定对植物的光合生理与逆境生理具有重要意义。

实验原理从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。

利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇提取。

分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。

纸层析是其中最简单的一种。

当溶剂不断地从层析滤纸上流过时，由于混合色素中各种成分在两相(即流动相和固定相)间具有不同的分配系数，它们的移动速度不同，使样品中的各种成分得到分离。

强光可以破坏离体的叶绿素，因为植物体内本来有还原酶，可以破坏光产生的强氧化物质。

而离体的叶绿素提取液中不含有还原酶，光产生的强氧化物质会破坏叶绿素。

叶绿素提取液中同时含有叶绿素a和叶绿素b，二者的吸收光谱虽有不同，但又存在着明显的重叠，在不分离叶绿素a和叶绿素b的情况下同时测定叶绿素a和叶绿素b的浓度，可分别测定在663nm和645nm（分别是叶绿素a和叶绿素b在红光区的吸收峰）的光吸收，然后根据Lambert-Beer定律，计算出提取液中叶绿素a和叶绿素b的浓度。

A663=82.04Ca+9.27Cb（1）A645=16.75Ca+45.60Cb（2）公式中Ca为叶绿素a的浓度，Cb为叶绿素b浓度（单位为g/L），82.04和9.27分别是叶绿素a和叶绿素b在663nm下的比吸收系数（浓度为1g/L，光路宽度为1cm时的吸光度值）；16.75和45.60分别是叶绿素a和叶绿素b在645nm下的比吸收系数。

植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定

植物生理学实验报告叶绿体色素的提取分离理化性质和叶绿素含量的测定引言：叶绿体是植物细胞中的一个重要细胞器，其中主要存在着叶绿素等色素，它们在光合作用中起着重要的作用。

研究叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定，对于了解光合作用的机理以及研究植物生理生化过程具有重要意义。

本实验旨在通过实验手段提取叶绿体色素，进行色素的分离、理化性质的研究和叶绿素含量的测定。

材料与方法：材料：菠菜叶片、研钵、磨杵、丙酮、乙醇、石油醚、叶绿素提取液、测色皿、高锰酸钾溶液、浓硫酸。

方法：1.取适量菠菜叶片放入研钵中，加入适量丙酮，用磨杵捣碎成糊状。

2.将捣碎的菠菜糊状物转移到玻璃漏斗中，用石油醚冲洗3次，使叶绿体附着物进一步析出。

3.将漏斗中的上清液收集，并加入适量乙醇，振摇混合，使叶绿素慢慢析出。

4.将释放出的叶绿体颗粒通过离心机离心沉淀10分钟，收集沉淀。

5.取收集到的叶绿体沉淀，加入适量叶绿素提取液，用乳钙酸钠解离剂进行叶绿素含量的测定。

6.将其中一部分叶绿体溶液加入高锰酸钾溶液，观察颜色变化。

7.将其余叶绿体溶液与浓硫酸混合，观察颜色变化。

结果与讨论：通过上述方法，我们成功地提取并分离出菠菜叶片中的叶绿体色素。

加入石油醚可以去除一部分杂质，使叶绿体进一步纯化。

加入乙醇可以使叶绿素从叶绿体中溶出。

通过离心沉淀，我们收集到了叶绿体的沉淀物。

叶绿体的提取液与高锰酸钾溶液反应后呈现蓝色或紫色，这是由于高锰酸钾通过氧化反应将一些具有现菌酮结构的物质氧化为合成叶绿素的前体物质所引起的。

这种反应也证实了叶绿体的存在。

叶绿体溶液与浓硫酸混合后呈现蓝绿色，这是由于浓硫酸通过剥离叶绿体周围的蛋白质和其他有机物质，将叶绿素分子释放出来，产生颜色变化。

叶绿素的含量测定是通过与乳钙酸钠解离剂反应来进行的。

乳钙酸钠解离剂能够与叶绿体中的叶绿素结合，并形成稳定的叶绿素-乳钙酸钠络合物。

这种络合物通过光密度的测定，可以根据比色法来测量叶绿素的含量。

叶绿素的提取、分离和测定

OD663=82.04Ca+9.27Cb
Ca=12.7OD663-2.69OD645 Cb=22.9OD645-4.68OD663 Ct=Ca+Cb=20.2D645+8.02D663
解方程式得
(二）步骤
称取0.5g叶片，剪碎后置于玻璃匀浆器中加纯丙酮5mL，研成匀浆，用80%丙酮10mL洗匀浆器，用80%丙酮定容到25mL，避光静置5min。用移液管吸取上面的绿色清液1mL置于一大试管中，加入丙酮4ml稀释，摇动试管，作测定用。
测量光密度值取上述提取液以80%丙酮作为空白对照，于663及645nm下读取光密度值
计算结果代入公式求出各来自绿素的含量（单位mg/L）最后计算时需考虑稀释因子
叶绿素a含量（mg/g鲜重）=CA*5 *25*2/1000 =0.25CA
叶绿素b的含量（mg/g鲜重）=0.25CB
研钵、吸管、小烧杯、试管、培养皿等
01
95%酒精、石油醚
02
碳酸钙
03
（二）仪器和药品
（三）步骤
用天平称取15g鲜叶，剪碎放入研钵中，加少量的CaCO3粉末及95%酒精5-10mL研成糊状，再加95%酒精20mL，充分混匀以提取叶片匀浆中的色素，5-10分钟后，过滤入三角烧瓶中加塞待用。
取一张色层分析纸或定性滤纸代用，剪成圆形，直径应略大于培养皿的直径；将圆形滤纸平放在培养皿上，用滴管吸取叶绿素提取液，滴在滤纸的中心位置，稍干后，再重复操作几次；然后取另一滴管吸取石油醚，慢慢地推动叶绿素提取液，不久即可看到分离的各种色素的同心圆环,由内到外依次为：叶绿素a为蓝绿色、叶绿素b为黄绿色、叶黄素呈鲜黄色、胡萝卜素为橙黄色。
叶绿素a、b在长波方面的最大吸收峰分别为为663nm和645nm。

叶绿素分离,提取与含量测定

叶绿素提取、分离与测定曹志凡141140003一．实验目的1、了解叶绿体色素的构成；2、了解叶绿素的某些物理及化学性质，掌握提取叶绿素及分离叶绿素的原理；3、了解纸层析法分离色素的实验原理4、学会用纸层析的方法分离叶绿体色素；5、初步学习用分光光度计测定叶绿素ab含量。

二．实验原理1.植物叶绿体色素是吸收太阳光能,进行光合作用的重要物质.它一般由叶绿素a,叶绿素b,胡萝卜素和叶黄素组成，它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体。

2.绿色素（包括叶绿素a蓝绿色和叶绿素b黄绿色）和黄色素（包括胡萝卜素黄色和叶黄素橙黄色）这两类色素都很难溶于水，而易溶于有机溶剂,故可用乙醇,丙酮等有机溶剂提取。

3.由于光合色素位于叶绿体中的类囊体上，要把它提取出来必须破坏叶表皮、细胞壁和细胞膜、叶绿体的双层膜，所以要剪碎后加二氧化硅研磨，以便充分提取色素。

4.叶绿素是一种含镁的化合物，其中的镁易被H+、Cu2+、Zn2+等取代。

当被H+取代后，就形成去镁叶绿素，呈黄褐色。

虽然研磨过程中不发生产生大量H+的化学反应，但液泡中常含有多种有机酸。

一般认为，碳酸钙的作用在于中和研磨过程中产生的H+，以防止叶绿素被破坏。

5.纸层析法又称纸色谱法。

以纸为载体的色谱法，固定相一般为纸纤维上吸附的水分，流动相为不与水相溶的有机溶剂；也可使纸吸留其他物质作为固定相，如缓冲液，甲酰胺等。

根据不同色素在层析液中的溶解度不同造成随层析液扩散速度不同这一原理进行分离。

6.当层析溶剂不断从纸上流过时,由于混合物(叶绿素提取液)中各种成分在固定相和流动相间溶解度和吸附能力不同而具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后,可将各种色素分开，其中胡萝卜素在层析液中的溶解度最高，扩散速度最快，其次是叶黄素、叶绿素a，叶绿素b溶解度最低，扩散得最慢。

7.分光光度计就是利用分光光度法对物质进行定量定性分析的仪器，分光光度法则是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度，样品的吸光值与样品的浓度成正比。

叶绿体色素实验

叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定实验一、叶绿体色素的提取、分离1.实验名称叶绿体色素的提取、分离实验2.实验原理叶绿体中色素与内囊体膜结合成为色素蛋白复合体。

这些色素不溶于水，而溶于有机溶剂，可用乙醇等有机溶剂提取。

提取液用薄层色谱法加以分离和鉴别。

本实验采用酒精提取。

层析法原理： K=Cs/Cm。

3.实验试剂与材料新鲜菠菜叶体积分数百分之九十五的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1）天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸4.实验步骤1．叶绿体色素的提取（1）取菠菜或其他植物新鲜叶片4~5片（2g左右），洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。

（2）研钵中加入少量石英砂及碳酸钙粉，加2~3ml 95%乙醇，研磨至糊状，再加10ml 95%乙醇，暗处放置3~5min，上清液过滤于三角瓶中，残渣用10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。

2.色素分离：取硅胶预制板一个，用毛细管吸取提取液，在板短边据下端1厘米处划一细线，待干后再次划线，重复3,4次。

在层析缸中加入层析液，高度0.5厘米，将预制板放入层析液中进行层析。

改好缸盖。

待色素较好分离后，取出硅胶预制板，迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。

5.实验结果与分析滤纸条上出现4条色素带，从上到下依次是：橙黄色胡萝卜素（最快）黄色叶黄素蓝绿色叶绿素a（最多）黄绿色叶绿素b（最慢）二.理化性质1.实验目的验证叶绿素的理化性质。

2.实验原理叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。

叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

叶绿素含量的测定方法

叶绿素含量的测定方法
叶绿素含量的测定方法有多种，下面列举几种常用的方法：
1. 酸醇提取法：将待测样品中的叶绿素提取到酸醇溶液中，然后用紫外可见分光光度计测定其吸光度，根据叶绿素和酸醇溶液之间的摩尔吸光系数，计算出叶绿素的含量。

2. 差示吸光度法：将待测样品中的叶绿素提取到有机溶剂中，然后用紫外可见分光光度计分别测定样品在630 nm和680 nm两个波长下的吸光度差，再根据已知浓度的标准曲线进行计算。

3. 荧光法：通过叶绿素在受激发时发射的荧光进行测定。

将待测样品中的叶绿素悬浮于缓冲溶液中，用荧光分光光度计测定其发射光谱，根据标准曲线计算叶绿素的含量。

4. 高效液相色谱法（HPLC）：将待测样品经过酸醇提取或其他方式提取叶绿素，然后用高效液相色谱进行分离和定量分析。

这些方法各有优缺点，选择合适的方法需要根据实际的研究目的和实验条件来确定。

植物生理学实验报告叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定

实验报告课程名称：植物生理学及实验实验类型：探索、综合或验证实验项目名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质和叶绿素含量的测定一、实验目的和要求掌握植物中叶绿体色素的提取分离和性质鉴定、定量分析的原理和方法二、实验内容和原理以青菜为材料，提取和分离叶绿体色素并进行理化性质测定和叶绿素含量分析。

原理如下：1.叶绿素和类胡萝卜素均不溶于水而溶于有机溶剂.常用95%的乙醇或80%的丙酮提取。

2.皂化反应。

叶绿素是二羧酸酯，与强碱反应，形成绿色的可溶性叶绿素盐，就可与有机溶剂中的类胡萝卜素分开。

3.取代反应。

在酸性或加温条件下，叶绿素卟啉环中的Mg2+可依次被H+和Cu2+取代形成褐色的去镁叶绿素和绿色的铜代叶绿素。

H+取代Mg2+, Cu2+ (Zn2+)取代H+。

4.叶绿素受光激发，可发出红色荧光，反射光下可见红色荧光。

透射光下呈绿色，反射光下呈红色。

5.光谱分析。

叶绿素吸收红光和兰紫光，红光区可用于定量分析，其中645和663用于定量叶绿素a,b及总量，而652可直接用于总量分析。

三、主要仪器设备1.天平（万分之一）、可扫描分光光度计（UV-1240）、离心机2.研具、各种容（量）器、酒精灯等四、操作方法与实验步骤1.定性分析a)称取鲜叶3-5g，并逐步加入乙醇15ml，磨成匀浆取匀浆过滤，并倒入三角瓶中，同时观察荧光现象。

b)取三角瓶中约1ml溶液于小试管。

加KOH数片剧烈摇均，加石油醚1ml和HO 1ml分层后观察。

2c)取代反应：加醋酸约1ml，取1/2加醋酸铜粉加热。

观察颜色变化。

2. 叶绿素和类胡萝卜素的吸收光谱测定：a) 取皂化反应的上层黄色石油醚溶液→稀释（470nm OD 0.5-1） b) 取下层绿色溶液（留1/3），反复用石油醚粹取,直到无类胡萝卜素,离心得叶绿素(盐)→稀释（663nm OD 0.5-1）c) 两者在400-700nm 处扫描光谱，分别测定类胡萝卜素和叶绿素的吸收峰3. 叶绿素定量分析：鲜叶0.1g ，加1.9mlH 2O ，磨成匀浆，取2份0.2ml 加95%酒精4.8ml,摇匀，8000转离心5min,上清液在645，652，663测定OD ，计算Chla,Chlb 和Chl 总量的值。

实验一_叶绿素的提取、理化性质和含量测定

一、实验原理叶绿素是植物光合作用色素，主要有chla chlb ，不溶于水,可溶于酒精.丙酮和石油醚。

叶绿素是叶绿酸的酯，叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶醇酯化，能发生皂化反应。

叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和一个叶绿醇( 植醇，phytol) 的“尾巴”。

卟啉环中的镁原子可被H＋、Cu2 ＋、Zn2 ＋所置换。

用酸处理叶片，H＋易进入叶绿体，置换镁原子形成去镁叶绿素，使叶片呈褐色。

去镁叶绿素易再与铜离子结合，形成铜代叶绿素，颜色比原来更稳定。

人们常根据这一原理用醋酸铜处理来保存绿色植物标本。

叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色，这种现象称为叶绿素荧光现象。

原因是当叶绿素分子吸收光量子后，就由最稳定的、能量的最低状态－基态（ground state）上升到不稳定的高能状态－激发态（excited state）。

叶绿素荧光指被激发的叶绿素分子从第一单线态回到基态所发射的光。

寿命很短。

处于第一三线态的叶绿素返回到基态所发射的光称为叶绿素磷光。

二、实验目的1．学会提取和分离叶绿体中色素的方法。

2．观察叶绿体中的各种色素。

3．掌握叶绿素的物理和化学性质三、实验用品1．材料与试剂：菠菜、脱脂棉等、固体碳酸钠或碳酸钙、丙酮、石油醚、蒸馏水、饱和NaCL水溶液、醋酸铜结晶、KOH-甲醇溶液等。

2．仪器设备：载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、解剖刀、玻璃漏斗、分液漏斗中、研钵、试管、具塞锥形瓶等等。

四、方法和步骤1、叶绿体色素的提取• 将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去叶柄及中脉，称取10g 去中脉的叶片，剪碎置研钵内，加入少许固体碳酸钠或碳酸钙和10 mL丙酮，迅速研磨成匀浆，再加15 mL丙酮充分研磨提取叶绿素。

• 在玻璃漏斗底部垫一小团脱脂棉，将匀浆通过脱脂棉过滤到已装有15 mL石油醚的分液漏斗中，再用少量丙酮冲洗叶片残渣和研钵，合并滤液。

• 沿分液漏斗的壁小心加入30mL蒸馏水，轻轻转动加入4 -8mL饱和NaCl水溶液，静止几分钟待分层清楚后，弃去下面的丙酮一水层。

叶绿素含量的测定

植物叶绿体色素的提取、分离、及含量测定（一）叶绿体色素的提取一、实验目的1．掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。

2．了解皂化-萃取提取β−胡萝卜素原理。

3. 了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素原理。

二、实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象，它是人类所利用能量的主要来源。

在把光能转化为化学能的光合作用过程中，叶绿体色素起着重要的作用。

高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类，主要包括叶绿素a、叶绿素b、β−胡萝卜素和叶黄素四种。

它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表12.1。

叶绿素(chlorophylls)是叶绿酸的酯，它在植物进行光合作用中吸收可见光，并将光能转变为化学能。

叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。

在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a（C55H72O5N4Mg）和叶绿素b（C55H70O6N4Mg）两种结构相似的形式存在，其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。

叶绿素的基本结构见图47.1。

在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环，它们由四个甲烯基联结成卟啉环，在卟啉环中央有一个镁原子，它以两个共价键和两个配位键与四个吡咯环的氮原子结合成内配盐，形成镁卟啉。

在叶绿素分子中还有两个羧基，其中一个与甲醇酯化成COOCH3，另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。

类胡萝卜素(carotenoids)是一类不饱和的四萜类碳氢化合物（例如胡萝卜素，carotenes)，或它们的氧化衍生物（例如叶黄素类，xanthophylls)。

所有的类胡萝卜素均源于非环状的C40H56结构。

类胡萝卜素在强光下可防止叶绿素的光氧化；在弱光下，可作为辅助色素吸收光能并传递给叶绿素分子。

胡萝卜素有三种异构体，即α−、β−和γ−胡萝卜素，其中β−胡萝卜素含量最多，也最为重要。

β−胡萝卜素还具有维生素A的生理活性，其结构是由两分子维生素A 在端链失去两分子水结合而成。

叶绿体色素的提取理化性质与含量测定

低温下发生皂化反应旳叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。
2）取代反应
卟啉环中旳Mg处于不稳定旳状态，可被H+、Cu2+ 、Zn2+等离子取代。稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，Mg能够被H+所取代而成褐色旳去镁叶绿素，去镁叶绿素遇Cu2+则成为深绿色旳铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。
7. 思索题
1）用不含水旳有机溶剂提取植物材料尤其是干材料旳叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？
2）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？ 3）叶绿素a、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸
收峰波长进行叶绿素a、叶绿素b旳定量分析？为何？
加入少许碳酸钙旳目旳是为了预防在研磨过程中，叶绿素受到破坏。详细旳情况是这么旳：叶绿体中旳色素所处旳环境具微碱性，试验中，因为研磨会使细胞构造遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性旳细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素旳分子构造遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液旳酸性，可起到保护叶绿素旳作用。
5. H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+旳取代作用
1）吸收叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入36%乙酸数滴，摇匀，观察溶液颜色旳变化。（成果与分析4.1）
2）当溶液变褐色后，倾出二分之一于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉，水浴加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同步加热）旳一管相比较。（成果与分析4.2）
试验叶绿体色素旳提取、理化性质与含量测定
1. 试验目旳及意义
➢ 提取叶绿体色素 ➢ 分析叶绿素旳物理、化学性质 ➢ 测定叶绿素旳含量 ➢ 提取和测定植物组织中旳光合色素是研究光

实验八叶绿体色素的提取、分离及定量测定

胡萝卜素实验八叶绿体色素的提取、分离及定量测定一、实验结果叶绿素提取液在在纸带上层析的结果图叶绿素提取液在圆纸片上层析扩散图测量结果叶黄素叶绿素a叶绿素b胡萝卜素叶黄素叶绿素a叶绿素b稀释前：在波长为663 时吸光度为3.303 波长为645时为3.230稀释后：在波长为663时吸光度为1.529（平均）波长为645时为0.529（平均）计算结果：稀释前：Ca=12.7*3.303-2.69*3.230=33.26mg/lCb=22.9*3.230-4.68*3.303=58.51mg/lCa:Cb=0.55:1稀释后;Ca=12.7*1.529-2.69*0.529=18.00mg/lCb=22.9*0.529-4.68*1.529=4.96mg/lCa:Cb=3.63:1波长663吸光度数据：1.527 1.531 1.529 平均：1.529波长645吸光度数据：0.530 0.529 0.528 平均：0.529二、实验结论高等植物叶绿体体内的色素主要是叶绿素a,叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素。

叶绿素主要吸收蓝紫光和红光，将绿光反射出来，因而叶片颜色呈现出绿色。

胡萝卜素和叶黄素最大吸收带在蓝紫光的部分。

叶绿素和叶黄素胡萝卜素两种色素的总含量比大致为3：1，叶绿素a和叶绿素b比也大致为3：1.层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂，由于四种色素的化学组成和结构不同，因此每一种色素分子在层析液分子的作用下，向层析液中扩散的速度不同，即在层析液中的溶解度不同，因而四种色素随层析液在滤纸条上的扩散速度就不同，其中胡萝卜素在层析液中的溶解度最高，扩散速度最快，其次是叶黄素、叶绿素A，叶绿素B溶解度最低，扩散得最慢。

依据此原理使滤纸条上处于同一滤液细线上的四种色素在扩散中分离开来。

三、问题解答1.叶片选材有何要求？答：要选取新鲜的颜色较深的叶片，是因为以便使滤液中含较多的色素。

2.研磨时加入石英砂的目的是什么？答：研磨时加入石英砂的目的是为了研磨得充分，更有效地破坏细胞结构.3.研磨时加入碳酸钙的目的是什么？答：防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。