18种天然氨基酸分析

18种天然氨基酸分析(异硫氰酸苯酯柱前衍生法)

——序列号: D024 1 适用范围

该方法适用于氨基酸注射液、动植物性食品和饲料中Asp(天冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(丝氨酸)、Gly(甘氨酸)、His(组氨酸)、Arg(精氨酸)、Thr(苏氨酸)、Ala(丙氨酸)、Pro(脯氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(缬氨酸)、Met(蛋氨酸)、Cys(胱氨酸)、Ile(异亮氨酸)、Leu(亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Trp(色氨酸)、Lys(赖氨酸)等18种天然氨基酸的检测

2 溶液配制

氨基酸储备液：称取一定量氨基酸标准品，用0.1 mol/L HCl水溶液溶解，

胱氨酸为0.01 mol/L，酪氨酸为0.02 mol/L，其他氨基酸

为0.05 mol/L

氨基酸使用液：将储备液用0.1 mol/L HCl水溶液稀释，得到浓度为0.002

mol/L的氨基酸单标和混标

内标液：以正亮氨酸作为内标物。称取一定量正亮氨酸，溶于0.1

mol/L HCl水溶液，得到0.02 mol/L的正亮氨酸内标液异硫氰酸苯酯溶液：将250 μl异硫氰酸苯酯用乙腈乙腈定容至10 ml，得到

0.2 mol/L异硫氰酸苯酯溶液

三乙胺溶液：将1.4 ml三乙胺用乙腈定容至10 ml，得到1.0 mol/L三

乙胺溶液

3 衍生化

3.1 样品溶液衍生化

量取200 μl样品溶液(蛋白质水解液或游离氨基酸溶液)[1]，置于1.5 ml塑料离心管中，加入20 μl正亮氨酸内标溶液[2]，混匀，再加入100 µl 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 µl 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1小时，然

后加入400µl正己烷，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 µl下层溶液与800 µl水混合[3]，0.22 µm针式过滤器过滤，待分析。

3.2 标准溶液衍生化

量取200 µl氨基酸混合标准溶液(每种组分浓度均为0.002 mol/L)，置于1.5 ml 塑料离心管中，准确加入20 μl正亮氨酸内标溶液[2]、100 µl 1 mol/L三乙胺乙腈溶液和100 µl 0.2 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈溶液，混匀，室温反应1小时，然后加入正己烷400 µl，旋紧盖子后剧烈振荡5~10 s，静置分层，取200 µl下层溶液与800 µl水混合[3]，0.22 µm针式过滤器过滤，待分析。

注：

[1] 通过控制原始样品质量或稀释等方法，使样品溶液中的氨基酸总量不超过0.04 mol/L或3.0 g/L(两者中取最小值)

[2] 只有采用内标法分析时，才需要加入正亮氨酸作为内标物

[3] 衍生得到的样品溶液中含有50%的乙腈，这与流动相溶剂体系存在较大差距，因而需要加水稀释，否则会引起峰前沿或分叉

4 分析条件

色谱柱: Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250×4.6 mm，5 μm

流动相A: 0.05 mol/L乙酸钠水溶液(冰乙酸调节pH值为6.50 ± 0.05)

流动相B: 甲醇: 乙腈: 水=20 : 60 : 20(V : V : V)

流速: 1.0 ml/min

柱温: 35 ℃

进样体积: 10 μl

梯度程序

二元高压HPLC系统

比如Shimadzu 10A、20 A、Agilent 1200，双泵后配备1.7～2.6 ml涡流混合器

10

20

3040

Time (min)

12

3

4567

8

910

11

1213

14

1516

171819

20

18种天然氨基酸、正亮氨酸以及NH 3(氨)-异硫氰酸苯酯衍生物的液相色谱图

3的20种化合物完全得到分离，相邻色谱峰的分离度大于2.0。