第五课 DNA限制性内切酶酶切反应

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二、限制性内切酶酶切反应
3. 终止反应:可以通过以下3种方式终止酶切 反应:
① 若DNA在酶切后不进行进一步的酶反应时,可加 入EDTA至终浓度10mM,或加入0.1%SDS。 EDTA对酶的灭活彻底,但EDTA存在将使连接 反应变得极为困难。 ② 若DNA在酶切后须进行下一步的酶反应,可将反 应产物置65℃或80℃加热20分钟。但有些酶加 热灭活不彻底。 ③ 用酚/氯仿抽提,然后乙醇沉淀。
第五课
DNA限制性内切酶酶切反应
一、核酸限制性内切酶
• 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA特定碱基序 列的核酸水解酶。这些酶都是在原核生物中发现的, 可以为宿主抵御外来DNA的侵袭。根据酶的切割特性、 催化条件及是否具有修饰性可分为I、II、III型三大 类。 • I型酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解 旋酶四种活性。其内切酶的识别位点和切割部位不一 致,无固定的切割位点,不产生特异片断。 • III型酶和I型酶类似,也有甲基化功能,但无ATP酶 和DNA解旋酶活性。此类酶可在DNA链的特异位点切 割,但切割位点在识别位点之外,对基因工程的意义 也不大。
2. 混匀试剂。将离心管置37℃水浴,反应1小 时。
三、实验步骤
3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
① 制备1%琼脂糖凝胶。 ② 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓 冲液,混匀。 ③ 将样品平均加入2个加样孔内,每个孔加样 27.5μl。 ④ 135V衡压电泳30-40分钟。 ⑤ 在紫外灯下观察酶切条带。 ⑥ 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中 切割下来,装入1.5ml微量离心管中。 ⑦ 置-20℃保存。
配制反应体系
二、限制性内切酶酶切反应
1. 配制反应体系
④ 内切酶及使用的酶量
• • • • 根据实验要求选择限制性内切酶。 1个酶活力单位的定义:在50μl反应体系中, 1μgDNA在推荐的反应缓冲液和温度下反应1 个小时,被完全酶切所需要的wenku.baidu.com切酶的量。 过量的酶可缩短反应时间。但使用过多的酶将 导致识别序列特异性下降。一般采用2-10倍的 酶量。 加入酶的总容积不能超过反应体系总容积的 10%。否则甘油终浓度将达到5%以上,将抑 制酶的活性。
二、限制性内切酶酶切反应
1.
① DNA:必须具备一定纯度,微量的酚、氯仿、大 于10mM的EDTA、去垢剂、及高盐的存在均将 影响限制性内切酶的活性。DNA碱基上的甲基化 修饰也是影响酶切的重要因素。 ② 反应缓冲液:不同厂家、不同的酶都有不同的最 佳反应条件。应严格按照产品说明书操作。双酶 切时要选择两种酶都具有最高活性的缓冲液。 ③ 反应容积:在DNA浓度<0.4μg/μl的情况下,根 据后续实验的要求选择合适的反应容积。过高浓 度的DNA会使溶液过于粘稠影响酶的扩散,并降 低酶活性。
• 1. 2. 3. 4. •
本周实验报告: 实验原理 实验步骤 实验结果 实验结果分析 下周请预习:离心吸附柱法从琼脂糖 凝胶中回收DNA
4. 酶切结果的鉴定 • 酶切完成后,取适量反应液进行琼脂糖凝胶 电泳观察酶切结果。
三、实验步骤
1. 按顺序,在1.5ml微量离心管中配制反应试剂:
① ② ③ ④ 10X Buffer 5μl DNA (~100ng/μl)(质粒或PCR产物) 44μl BamH I (15Units/μl) 0.5μl Xho I (10Units/μl) 0.5μl
一、核酸限制性内切酶
• II型限制酶切割DNA双链可产生三种不同的DNA末 端:平末端、5’端突出的粘性末端、和3’端突出的粘 性末端。
BamH I识别及切割位点: 5’…G↓GATC C…3’ 3’…C CTAG↑G…5’ ↓ 5’…G3’ 5’GATCC…3’ 3’…CCTAG5’ 3’G…5’ Xho I识别及切割位点:5’…C↓TCGA G…3’ – 3’…G AGCT↑C…5’
一、核酸限制性内切酶
• II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制 性内切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶 和修饰酶组成。II型限制酶需要Mg2+作为催 化反应辅助因子,能识别双链DNA的特定序 列,一般为4-6个碱基的反转重复序列。II型 限制酶一般在识别序列内进行切割,产生特异 的DNA片断。 • II型修饰酶识别和II型限制酶一致的DNA序 列,但其作用是负责对识别序列的甲基化修饰。
二、限制性内切酶酶切反应
2. 酶切温度及时间:根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长,以免内切酶产生星 活性。
– 星活性(Star Activity):是指限制性内切酶在 某些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的 现象。其结果是酶切条带增多。
星活性除了与酶本身的性质有关外,与酶过量、甘 油浓度过高,pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
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