第五课 DNA限制性内切酶酶切反应
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程
限制性内切酶酶切反应的标准操作规程（编号：007）1、目的及适用范围利用限制性内切酶在特异性的识别位点上或附近切割双链DNA分子，用于特定基因的克隆等分子生物学研究。
2、主要试剂及仪器微量移液器、恒温水浴锅、限制性内切酶 EcoR I, BamH I 等、通用缓冲液10× Buffer3、操作步骤按顺序加入下列反应物，放入37℃水浴锅内反应2h。
反应物体积（μL）灭菌水3DNA4010× Buffer K 5EcoR I1BamH I1总体积504、问题向导4.1 建立一个标准的酶切反应：目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。
通常，一个50μL的反应体系中，1μL的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1h即可降解1μg已纯化好的DNA。
如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16h）也可完全反应。
4.2 选择正确的酶：选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。
识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。
假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。
内切酶的产物可以是粘端的（3\'或5\'突出端），也可以是平端的片段。
粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。
4.3 内切酶：内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。
酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。
酶的用量视在底物上的切割频率而定。
例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。
21。
实验五 质粒DNA酶切(质粒限制性内切酶消化酶切)
属名
种名 株系
Haemophilus influenzae d
流感嗜血杆菌d株
HindⅡ HindⅢ
同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶
3) 类型
据限制性核酸内切酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活 性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三类。
4) 基本特性及用途
Ⅱ限制性核酸内切酶有严格的识别、切割顺序，它以核酸内切 方式水解DNA链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5′端为P，3′ 端为OH，识别序列一般为4～6个碱基对，通常是反转录重复 顺序，具有180°的旋转对称性即迴文结构。Ⅱ限制性核酸内切 酶切割双链DNA产生3种不同的切口。
思考题
如果一个DNA酶解液在电泳后发现 DNA未被酶切或者酶切不完全, 你认为可能 是什么原因？
高浓度甘油、高pH、低离子强度、巯基乙醇、DMSO、Mn2+ 等的存 在可能导致酶产生星活性。
6) Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项
①商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应 使用新的吸头去取酶；加入酶的体积应不超过总体积的10%， 否则酶液中的甘油浓度超过5%时酶易产生星活性。
②整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入 其它试剂之后，最后加入酶。
实验试剂：
① EcoR Ⅴ酶及其酶切缓冲液 ② 琼脂糖(Agarose)、TAE电泳缓冲液等
实验仪器
恒温水浴锅
实验步骤
EP管编号, 加样
质粒 （DNA）17.5μL
反应 10×缓冲液2μL
19μL + 0.5μL酶液
用移液枪轻轻吹打使溶液混匀，且使溶液集中在管底 混匀反应体系后，37℃水浴保温4-5h
③当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的 用量。
质粒DNA的限制性内切酶酶切分析
5. 酶切实验中的注意事项:
1) 反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时 应尽量缩短酶在温室的放置时间。
2) 反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内 切酶变性及DNA大分子的完整。
3) 反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于 管壁上的液滴全部沉至管底。
4) 终止酶反应可根据需要采用不同的方法：
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的 是4个或 6个核苷酸，少数也有识别 5个核苷 酸以及 7个、 8个、 9个、 10个和 11个核苷酸 的。这种酶的切割可以有两种方式：
粘性末端；是交错切割，结果形成两条单 链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形 成氢键，所以称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
五、质粒DNA的限制性内切酶酶切分析
1. 实验目的 学习和掌握限制性内切酶的特性. 掌握对质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 。
2. 实验原理
949bp 3kb
3. 相关基础知识
限制性核酸内切酶：是一类能识别双 链DNA 分子特异性核酸序列的 DNA 水解酶。 它是基因工程中用于体外剪切基因片段的 重要工具酶。
2) 质粒DNA的限制性内切酶酶解
Total ddH2O K Buffer XbaI 质粒DNA
20ml ？ml 2ml 1ml 1ml 5ml
置于 37 ℃水浴酶解 3h 以上。酶解完成后， 80℃灭活, 储存，备电泳分析。
克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK等。
第三类（III型）限制性内切酶也 有专一的 识别顺序 ，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定 位置上切割双链 。但这几个核苷酸对也不是特异 性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一 定长度 DNA片段，具有各种单链末端。因此也不 能应用于基因克隆。
05 实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳(λ DNA,Hind III)(考核15%)
理和适用范围有什么异同？
如果用EcoR
I酶解λ DNA，电泳后的胶
图会如何？
解释限制性核酸内切酶专一性的机理。
器材
电泳仪（DYY-2C），水平电泳槽 微量加液器（10 uL），枪头（10 离心管0.5 mL，离心管架 恒温水浴
uL）
凝胶成像仪（Gel Logic
Gold
淹没胶孔。
制样
1号样：2 uL λ DNA + 18 uL 蒸馏水 + 5 uL 加样缓冲液，混匀，取10 uL点样。 2号样：20 uL λ DNA酶切液 + 5 uL加样
缓冲液，混匀，取10 uL点样。
点样
吸取10
uL样液；
将枪头贴近样孔上沿，略微插入样孔；
（注意：枪头不要戳破胶孔底部）
212 PRO）
view溶液
10×Buffer（100 mmol/L Tris-HCl，pH7.5，
100 mmol/L MgCl2，10 mmol/L 二硫苏糖醇， 500 mmol/L NaCl ）
试 剂
5×TBE缓冲液：Tris[111] 54
g，硼酸
[61.83] 27.5 g，20 mL 0.5 mol/L EDTA
0.5×TBE电泳缓冲液：用5×TBE液稀释 Gold
View：每100 mL琼脂糖胶加5 uL
试 剂
加样缓冲液（5×）（Loading dye）
溴酚蓝 （300 bp） 二甲苯腈蓝 （4000 bp） 蔗糖（甘油） Tris-HCl
思考题
加样缓冲液中各个组分的作用是什么？ 琼脂糖电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的原
轻轻将样液一次连续注入样孔。
DNA限制性内切酶酶切分析
DNA限制性内切酶酶切分析一、原理限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。
限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。
与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。
把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。
如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。
把目的基因与切开的载体DN A混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。
进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。
特定的酶有其配套的缓冲液。
进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。
二、目的了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。
三、材料、试剂与器具1、DNA样品。
2、限制性内切酶。
3、10×限制性内切酶反应缓冲液。
4、无菌双蒸水。
5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。
6、10×TBE buffer。
7、琼脂糖。
8、溴化乙锭溶液。
9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。
10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。
11、10mg/ml Rnase。
四、操作步骤1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。
2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：DNA样品 0.1-2mg10×内切酶反应缓冲液 1ml内切酶1 1ml内切酶2 1ml加无菌水至 10ml3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。
用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。
4、在37℃温育60－120分钟。
实验五 DNA的限制性内切酶酶切反应(定稿)
实验五DNA的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。
二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。
Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。
Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ；3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' 。
Pvu I 的识别序列5'…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3' →5'…ＣＧＡＴＣＧ…3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社） Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在pUC18质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为1X）琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭：5×TBE 电泳缓冲液：（使用时稀释10倍）6×电泳载样缓冲液：五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl（1μg）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl（使总体积为19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。
DNA 的限制性内切酶酶切分析讲解
1. DNA中的中的DNase,蛋白,RNA, SDS ,EDTA,酚, 中的 ,蛋白, , , 氯仿和乙醇等
杂质都会影响酶切效果. 氯仿和乙醇等杂质都会影响酶切效果. 2. DNA中的杂中的杂DNA,蛋白可与非专一性结合使酶活中的杂 ,蛋白可与RE非专一性结合使
酶活性降低,另外杂DNA 也竞争酶的切口,往往造成切不也竞争酶的切口, 性降低,另外杂动. 3. DNA中的盐离子(如Mn2+,Cu2+,Co2+和Zn2+等) 中的盐离子( 中的盐离子与有机溶剂(如酚,氯仿和乙醇等) 与有机溶剂(如酚,氯仿和乙醇等)都可抑制限制酶的活性或使限制酶失活或造成DNA切不动或使限制酶的活性或使限制酶失活或造成切不动或使限制酶切割一些非特异序列(*活性活性) 切割一些非特异序列(*活性).
分子克隆
个体克隆多莉羊的克隆。
DNA的限制性内切酶酶切
DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。
2.了解限制性内切酶的特点。
实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。
根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。
绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。
实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。
实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。
（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。
（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。
实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。
（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。
（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。
注意事项（1）注意要在冰上操作。
（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。
实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。
思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。
ｄｎａ的限制性酶切反应
ＤＮＡ的限制性酶切反应实验目的学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性核酸内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
通过对DNA的酶切，学会设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
实验原理核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。
限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。
Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。
Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。
故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶。
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。
体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性核酸内切酶都不能在目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或者两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能够得到完整的目的基因。
其次，选择具有相应的单一酶切位点的质粒、噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
DNA 的限制性内切酶酶切分析
观察酶切后与未酶切质粒的DNA带位置。
100bp DNA Marker 未酶切质粒
已酶切质 粒
点样孔
3000bp 1500bp 1000bp
500bp
2.96kp 1.9kp
注意事项
1. 第一步确保样品加到反应体系中,若有粘壁，用掌型离心机离 心到底部!
EcoR I
Bcl-2 (1.9kb)
操作步骤（改动）
1.酶切:
20ul反应体系
组分
加入体积
灭菌双蒸水
11ul
10×buffer H(含BSA） 2ul
质粒DNA
5ul
10U/ul EcoRI 2ul
掌型离心机混匀，37℃水浴反应1h
2.制胶(0.8%)：称取0.48g琼脂糖倒入三角瓶中，加入1×TAE缓 冲液60ml，微波炉加热至沸腾，摇匀，至无颗粒。
3.倒胶：胶冷却至60℃左右(不烫手)，缓缓倒入电泳槽 (先胶布 封口，放好梳子)。 4.点样：1 ul含SYBR Green I的载样buffer
+5ul酶切产物 或+5ul 未酶切的质粒, 混匀。 （点样孔置负极端）
5.电泳：稳压条件下90V电泳，待染料(指示过5V/cm胶长度）
6.电泳时电场强度不超过5V/cm胶长
思考题：
1. DNA的纯度会不会影响酶切产物的质量？如果会，请 说明原因。
2. 比较本实验酶切后与未酶切质粒的电泳图谱，综合前 两个实验，分析可能的原因
2. 当样品在37℃ 水浴时，要盖紧盖子，否则水汽进入管内，使 反应体积大大增加，造成酶切失败
3. RE一定要在低温(－20℃)下贮存(含50％甘油) ，每次吸取后 应放在冰盒，用完后立即放在-20℃，新购的大包装酶应先分装
dna限制酶切反应和限制酶谱绘制
限制性核酸内切酶能够识别并切割 DNA分子中的特异序列，产生具有特 定末端的片段，这些片段可用于进一 步的分析和实验操作。
限制酶的分类与特性
分类
根据限制酶识别的DNA序列和切割位点的数量，可以将限制酶分为单切酶和双 切酶。
特性
限制酶具有高度的特异性，只切割DNA分子中的特异序列，对非特异性序列不 产生切割作用。此外，不同的限制酶具有不同的温度最适值、pH最适值等特性。
突变分析
通过测序技术检测酶切位 点附近是否存在基因突变， 了解酶切效率的影响因素。
酶切效率评估
通过定量分析酶切产物与 未酶切DNA的比例，评估 酶切效率。
酶谱绘制方法与步骤
进行酶切反应
设计实验
设计合适的酶切反应体系，包括 DNA模板、限制性内切核酸酶、 缓冲液等。
将DNA模板和限制性内切核酸酶 混合，进行酶切反应。
DNA限制酶切反应和限 制酶谱绘制
• DNA限制酶切反应概述 • DNA限制酶谱绘制 • DNA限制酶切反应的应用 • DNA限制酶切反应的挑战与展望 • 实验操作与注意事项
01
DNA限制酶切反应概述
定义与原理
定义
DNA限制酶切反应是指使用限制性 核酸内切酶对DNA分子进行特异性 切割，产生特定长度的DNA片段的 过程。
通过凝胶电泳技术，将酶 切反应产物在电场中分离， 根据条带大小判断酶切位 点。
染色检测
利用荧光染料或溴化乙锭 染色，观察酶切产物在紫 外灯下的荧光条带。
生物发光检测
利用荧光素酶标记DNA片 段，通过生物发光技术检 测酶切产物的荧光信号。
酶切位点分析已知序列进行比对， 确定酶切位点的位置。
生物工程与基因治疗
生物工程
DNA的限制性内切酶酶切分析
DNA的限制性内切酶酶切分析DNA限制性内切酶酶切分析（restriction enzyme digestion analysis）是一种常用的实验方法，用于分析DNA片段的长度及其在不同DNA样本中的存在与否。
本文将介绍DNA限制性内切酶的定义和分类、酶切分析的原理、实验步骤和结果的分析等内容。
DNA限制性内切酶（restriction enzyme）是一种能够识别特定的DNA序列并酶切它们的酶类。
它的发现和应用让分子生物学和遗传学研究取得了重要的突破。
限制性内切酶按照它们识别的DNA序列和酶切的方式可以分为以下几类：1. 四切酶（Type I）：这类酶不仅有切割DNA的酶活性，还有甲基转移酶活性。
它们通常是多亚基复合物，需同时与子基的甲基转移酶活性合作。
2. 六切酶（Type II）：这类酶是最常用的限制性内切酶，它们能够识别特定的DNA序列，并在识别序列中特定的位置切割DNA链。
这类酶可以以精确的方式酶切DNA，生成具有粘性末端或平滑末端的DNA片段。
3. 四切酶（Type III）：这类酶也是多亚基复合物，通常需要其中一种辅助因子才能发挥酶切活性。
4. 五切酶（Type IV）：这类酶的酶切方式和高度特异性尚不清楚。
在酶切分析实验中，我们通常选用能够产生可检测到的DNA片段的限制性内切酶进行反应。
实验步骤如下：1.提取DNA样本：从要分析的细胞或组织中提取总DNA。
2. 选择限制性内切酶：根据需求选择一种适合的限制性内切酶。
常用的限制性内切酶有EcoRI、HindIII、BamHI等。
3.DNA酶切反应体系的设置：配置适当的酶切反应缓冲液，加入所选的限制性内切酶和总DNA，进行适当的搅拌反应。
4.酶切反应的条件调整：根据所选酶切酶的最佳工作条件进行反应温度、反应时间等参数的调整。
5.停止酶切反应：加入适当的制动剂（如酶切反应停止缓冲液）终止酶切反应。
6.扩增和可视化：对酶切后的DNA样品进行聚合酶链反应（PCR）扩增或直接进行凝胶电泳检测，以确定DNA片段的长度和存在与否。
DNA的限制性酶切实验原理
（2）、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上 （如插在泡沫塑料板上）,37℃水浴保温1小时,使酶切反应完全。
４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ ２小时即可，充分酶解。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
23
Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间；
NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl)
中盐（50mM NaCl）
高盐（100mM NaCl）
不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
学习课程 项目教学 管理 心理学 生
物 计算机多媒体课件
22
五、注意事项——限制性内切酶酶切
五、注意事项——DNA凝胶电泳
• 1. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其 杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的 强度，应有选择地使用。
• 2. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽 中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避 免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出 现气泡，以免影响电泳结果。
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出；３’端突出和平末端。
正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能
第五课 DNA限制性内切酶酶切反应
一、核酸限制性内切酶
• II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制 性内切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶 和修饰酶组成。II型限制酶需要Mg2+作为催 化反应辅助因子，能识别双链DNA的特定序 列，一般为4-6个碱基的反转重复序列。II型 限制酶一般在识别序列内进行切割，产生特异 的DNA片断。 • II型修饰酶识别和II型限制酶一致的DNA序 列，但其作用是负责对识别序列的甲基化修饰。
二、限制性内切酶酶切反应
1.
① DNA：必须具备一定纯度，微量的酚、氯仿、大 于10mM的EDTA、去垢剂、及高盐的存在均将 影响限制性内切酶的活性。DNA碱基上的甲基化 修饰也是影响酶切的重要因素。 ② 反应缓冲液：不同厂家、不同的酶都有不同的最 佳反应条件。应严格按照产品说明书操作。双酶 切时要选择两种酶都具有最高活性的缓冲液。 ③ 反应容积：在DNA浓度<0.4μg/μl的情况下，根 据后续实验的要求选择合适的反应容积。过高浓 度的DNA会使溶液过于粘稠影响酶的扩散，并降 低酶活性。
二、限制性内切酶酶切反应
2. 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星 活性。
– 星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在 某些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的 现象。其结果是酶切条带增多。
星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘 油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
配制反应体系
二、限制性内切酶Biblioteka 切反应1. 配制反应体系④ 内切酶及使用的酶量
• • • • 根据实验要求选择限制性内切酶。 1个酶活力单位的定义：在50μl反应体系中， 1μgDNA在推荐的反应缓冲液和温度下反应1 个小时，被完全酶切所需要的内切酶的量。 过量的酶可缩短反应时间。但使用过多的酶将 导致识别序列特异性下降。一般采用2-10倍的 酶量。 加入酶的总容积不能超过反应体系总容积的 10%。否则甘油终浓度将达到5%以上，将抑 制酶的活性。
DNA酶切反应
DNA酶切反应一、 DNA 酶切反应1、将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml)编号，用微量移液枪分别加入D NA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。
此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。
使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴保温2-3小时，使酶切反应完全。
3、每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。
二、DNA 分子量标准的制备采用EcoRⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA 片段来作为电泳时的分子量标准。
λDNA 为长度约50kb的双链DNA 分子，其商品溶液浓度为0.5mg/ml，酶解反应操作如上述。
HindIII切割 DNA 后得到8个片段，长度分别为23.1， 9.4， 6.6， 4.4， 2.3，2.0， 0.56和0.12kb。
EcoRI切割lDNA 后得到6个片段，长度分别为21.2， 7.4，5.8， 5.6， 4.9和2.5kb。
三、琼脂糖凝胶的制备1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。
2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0.8％琼脂糖凝胶液。
加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。
加热时应盖上封口膜，以减少水份蒸发。
3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。
将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1m m左右的间隙。
实验五 DNA的限制性酶切和电泳
实验五 DNA的限制性酶切和电泳实验五 DNA的限制性酶切和琼脂糖电泳一、实验目的掌握DNA的限制性酶切的基本原理和琼脂糖凝胶电泳的基本操作技术二、实验原理 1、DNA的限制性酶切限制性内切酶是基因操作中不可缺少的工具酶，它能够识别双链DNA的特定位点并切开DNA，这个特定位点是一段具有旋转对称结构的DNA片段。
绝大多数的限制酶识别长度为4~8个核苷酸且呈二重对称的特异序列。
EcoRI的识别序列是G↓AATTC，BmHI的识别序列是G↓GATCC，HindIII的识别序列是A↓AGCTT。
每种限制性内切酶都有特定的反应条件，如特定的pH范围，缓冲液组分，温育温度等，具体的使用也可参考有关的工具书或文献或产品说明。
一般温度37℃，pH7.5~8.0对大多数酶来讲是适合的，但缓冲液的组分则变化很大，典型的组分应有Tris、NaCl、MgCl2，和巯基试剂(如巯基乙醇或二硫苏糖醇)。
典型的反应体系中包括lμg或更少的DNA和1单位酶以及合适的反应介质。
反应总体积通常控制在20和50μ之间，反应时间在1小时，而反应的终止则由EDTA溶液的加入完成，因为它能鳌合核酸酶活性所必需的金属离子。
2、DNA的琼脂糖电泳DNA的电泳有琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳，它们是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。
DNA的电泳原理与蛋白质的电泳原理基本相同。
在pH值为8.0－8.3时，核酸分子带负电，在电泳时由负极向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构像不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
琼脂糖凝胶电泳所需样品量仅0.5~1ug。
琼脂糖凝胶对DNA的分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。
而分离小片段DNA（5~500bp）则需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，其分辨力极高，能分离相差1bp的片段。
电泳过程中或电泳完毕直接利用低浓度的荧光染料EB（溴化乙啶）进行染色，EB是一种丫啶类染料，其分子呈扁平形，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。
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二、限制性内切酶酶切反应
2. 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星 活性。
– 星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在 某些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的 现象。其结果是酶切条带增多。
星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘 油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
第五课
DNA限制性内切酶酶切反应
一、核酸限制性内切酶
• 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA特定碱基序 列的核酸水解酶。这些酶都是在原核生物中发现的， 可以为宿主抵御外来DNA的侵袭。根据酶的切割特性、 催化条件及是否具有修饰性可分为I、II、III型三大 类。 • I型酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解 旋酶四种活性。其内切酶的识别位点和切割部位不一 致，无固定的切割位点，不产生特异片断。 • III型酶和I型酶类似，也有甲基化功能，但无ATP酶 和DNA解旋酶活性。此类酶可在DNA链的特异位点切 割，但切割位点在识别位点之外，对基因工程的意义 也不大。
一、核酸限制性内切酶
• II型限制酶切割DNA双链可产生三种不同的DNA末 端：平末端、5’端突出的粘性末端、和3’端突出的粘 性末端。
BamH I识别及切割位点： 5’…G↓GATC C…3’ 3’…C CTAG↑G…5’ ↓ 5’…G3’ 5’GATCC…3’ 3’…CCTAG5’ 3’G…5’ Xho I识别及切割位点：5’…C↓TCGA G…3’ – 3’…G AGCT↑C…5’
4. 酶切结果的鉴定 • 酶切完成后，取适量反应液进行琼脂糖凝胶 电泳观察酶切结果。
三、实验步骤
1. 按顺序，在1.5ml微量离心管中配制反应试剂：
① ② ③ ④ 10X Buffer 5μl DNA (~100ng/μl)（质粒或PCR产物） 44μl BamH I (15Units/μl) 0.5μl Xho I (10Units/μl) 0.5μl
• 1. 2. 3. 4. •
本周实验报告： 实验原理 实验步骤 实验结果 实验结果分析 下周请预习：离心吸附柱法从琼脂糖 凝胶中回收DNA
2. 混匀试剂。将离心管置37℃水浴，反应1小 时。
三、实验步骤
3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
① 制备1%琼脂糖凝胶。 ② 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓 冲液，混匀。 ③ 将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样 27.5μl。 ④ 135V衡压电泳30-40分钟。 ⑤ 在紫外灯下观察酶切条带。 ⑥ 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中 切割下来，装入1.5ml微量离心管中。 ⑦ 置-20℃保存。
配制反应体系
二、限制性内切酶酶切反应
1. 配制反应体系
④ 内切酶及使用的酶量
• • • • 根据实验要求选择限制性内切酶。 1个酶活力单位的定义：在50μl反应体系中， 1μgDNA在推荐的反应缓冲液和温度下反应1 个小时，被完全酶切所需要的内切酶的量。 过量的酶可缩短反应时间。但使用过多的酶将 导致识别序列特异性下降。一般采用2-10倍的 酶量。 加入酶的总容积不能超过反应体系总容积的 10%。否则甘油终浓度将达到5%以上，将抑 制酶的活性。
பைடு நூலகம்
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二、限制性内切酶酶切反应
3. 终止反应：可以通过以下3种方式终止酶切 反应：
① 若DNA在酶切后不进行进一步的酶反应时，可加 入EDTA至终浓度10mM，或加入0.1%SDS。 EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接 反应变得极为困难。 ② 若DNA在酶切后须进行下一步的酶反应，可将反 应产物置65℃或80℃加热20分钟。但有些酶加 热灭活不彻底。 ③ 用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀。
一、核酸限制性内切酶
• II型酶就是通常基因工程中使用的DNA限制 性内切酶。II型酶限制修饰系统分别由限制酶 和修饰酶组成。II型限制酶需要Mg2+作为催 化反应辅助因子，能识别双链DNA的特定序 列，一般为4-6个碱基的反转重复序列。II型 限制酶一般在识别序列内进行切割，产生特异 的DNA片断。 • II型修饰酶识别和II型限制酶一致的DNA序 列，但其作用是负责对识别序列的甲基化修饰。
二、限制性内切酶酶切反应
1.
① DNA：必须具备一定纯度，微量的酚、氯仿、大 于10mM的EDTA、去垢剂、及高盐的存在均将 影响限制性内切酶的活性。DNA碱基上的甲基化 修饰也是影响酶切的重要因素。 ② 反应缓冲液：不同厂家、不同的酶都有不同的最 佳反应条件。应严格按照产品说明书操作。双酶 切时要选择两种酶都具有最高活性的缓冲液。 ③ 反应容积：在DNA浓度<0.4μg/μl的情况下，根 据后续实验的要求选择合适的反应容积。过高浓 度的DNA会使溶液过于粘稠影响酶的扩散，并降 低酶活性。