《现代分子生物学》第五章 3 真核生物的转录后加工

hnRNA以与蛋白质结合的状态存在，形成 hnRNP（核糖核蛋白颗粒）。体外研究表明， hnRNP的形状为一个球体和一个与之相连的 纤维状结构。 在RNA转录生成以后，在核内完成加帽和 加尾的同时，内含子的去除即剪切过程也 在进行。然后RNA转运到胞浆。
1. 核基因mRNA的剪接位点 核基因mRNA的剪接位点
二、真核生物的转录后加工
真核生物转录后加工除了mRNA外， tRNA和rRNA也要经过后加工的过程。 有关真核生物tRNA的加工处理了解还不 多，可能和原核生物有相似之处。
1. rRNA的转录后加工 rRNA的转录后加工
真核生物有4种rRNA，即5.8S rRNA、18S rRNA、28S rRNA和5S rRNA。其中前三者 的基因组成一个转录单位，产生47S的前 体，并很快转变成45S前体。 45S前体上有许多甲基化的位点，在转录 过程中或转录后被甲基化。甲基基团主要 是加在核糖上。甲基化是45S前体最终成 为成熟rRNA区域的标志。
左（5’）剪接点称为供体位点，右（3’）剪 接点称为受体位点。点突变研究证明，剪 接位点GT或AG的突变均可以阻止剪接的出 现。 几乎所有的真核细胞核基因的内含子均遵 循GU－AG规则，这也暗示这类内含子存在 着共同的剪接机制。但线粒体、叶绿体和 酵母tRNA的内含子不遵循这一规则。
核RNA的剪接点及周围并没有自身的互补序列， 5’剪接点总是能正确地与3’剪接点相连。 剪接位点具有通用性，而内含子的其他序列 （包括二级结构）不提供特定的信息，对剪接 不产生影响。剪接装置没有组织特异性，RNA 只要含有正确的剪接点，在任何细胞中都可以 正确地剪接。
第二个阶段，内含子的3’剪接点被切断 而内含子以套索状释放，与此同时右侧 外显子与左侧外显子连接在一起。 第三个阶段，内含子的套索被切断，形 成线状并很快被降解。
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参与真核细胞核mRNA前体拼接反应的顺式元件 前体拼接反应的顺式元件 参与真核细胞核
完成剪接所需要的条件只有三个序列，即 5’GT、3’AG和分支点序列。内含子和外显子 其他序列的缺失并不影响剪接。也说明剪接 过程不需要内含子或外显子的特定构象。 分支点周围的序列也有一定程度的保守性。 突变实验证明，分支点的作用是选择距之最 近的3’剪接点作为与5’剪接点相连的靶位点。
各种参与剪接的成分形成一个剪接体系， 称为剪接体（spliceosome）。该体系由 几种snRNP和大量的其他的蛋白质分子 组成，这些蛋白质分子称为剪接因子， 估计有40多种。 剪接点和分支点序列由剪接体识别， snRNA和蛋白质都参与了识别，特别是 snRNA之间以及与mRNA间的碱基配对 起重要作用。
Polyadenylation and termination
真核细胞mRNA前体加尾反应模式图 真核细胞 前体加尾反应模式图
RNA polII CTD的磷酸化与加尾和加帽反应的关系 的磷酸化与加尾和加帽反应的关系
poly（ A ）在分子生物学实验中有很大的 应用价值。 1. 应用mRNA的该特性，可用寡聚T（oligo dT）为引物，反转录合成cDNA。 2. 将oligo（ dT ）与介质相连，用于从总 RNA中分离纯化mRNA。
真核细胞中rRNA的加工途径 真核细胞中rRNA的加工途径
(1) 切除5′端的前导序列； (2) 从41S的中间产物中先切下18S的片段。 (3) 部分退火，形成发夹结构； (4) 最后修正。
真核细胞中rRNA的加工 真核细胞中rRNA的加工
目前还不清楚45S前体在剪切位点断裂后是否 就产生成熟的末端，还是要经进一步的加工。 整个加工过程需要蛋白质的参与，可能形成核 蛋白体的形式。 rRNA的加工过程还需要snoRNA （small nucleolar RNAs ）的参与。 真核生物的5S rRNA是和tRNA转录在一起的， 经加工处理后成为成熟的5S rRNA。
RNA印迹法（RNA blotting）可用于分析核 RNA剪接过程中的中间体，从而确定内含 子的去除顺序。 实验中可以发现含有不同内含子的中间产 物，因此内含子的去除似乎没有特定的顺 序，但也发现有一定的规律，说明剪接有 特定的途径。
剪接反应并不是按内含子在RNA前体上 的顺序进行的。 RNA的构象影响剪接点的选择。在去除 特定的内含子后，RNA的构象发生一定 的变化，再选择新的剪接点。
一、核基因mRNA的剪接 一、核基因mRNA的剪接
mRNA的基因在低等真核生物中只有少数含 有内含子，为不连续基因。随着进化程度的 增高，不连续基因的数目不断增加。 细胞核中有一类RNA，十分不稳定，平均长 度比mRNA要长，序列的复杂程度非常高， 称为核内不均一RNA（ heterogeneous nuclear RNA，hnRNA ）。
真核生物mRNA的稳定性可能取决于去稳定 元件（destablizing element）。将这一元件 与mRNA结合，可引起该mRNA的降解。 参与RNA降解的核酸酶类可能比参与RNA 成熟过程的核酸酶特异性差。
第六节 RNA的剪接 RNA的剪接
割裂基因（split gene）即不连续基因 （interrupted gene）是指编码某一RNA的基 因中有些序列并不出现在成熟RNA序列中， 成熟RNA的序列在基因中被其他的序列间隔 开，这些序列称为介入序列，又称为内含子 （intron）。被内含子隔开的、出现在成熟 RNA中的序列称为外显子（exon）。
核基因mRNA的剪接位点（splicing site） 是指内含子与外显子的断裂点以及相邻 外显子的连接点。 经过比较mRNA与其基因的序列发现， 在内含子两端分别有两个非常保守的碱 基，左剪接位点为GU，右剪接位点为 AG。内含子在剪接位点的这种特征称为 GU－AG规则（GU-AG role） 。
2. mRNA的转录后加工 mRNA的转录后加工
在真核生物中，几乎所有的成熟mRNA有 5’帽子（cap）结构，多数还有3’末端的 poly（A）尾巴。这些结构都是在转录后 经过修饰的结果。
（1）5’帽子结构 成熟真核生物的mRNA并没有游离的5’端， 而是一种被称为帽子的结构。 真核生物的帽子结构可归纳为三种： m7GpppX为帽子0 m7GpppXm为帽子1 m7GpppXmYm为帽子2
剪接过程中的反应为转酯（transesterification） 转酯（ 转酯 ） 反应，即酯键由一个位置转移到另一个位置。 反应 剪接点的识别是剪接过程中的关键问题。有两 种可能，一是通过酶来识别，一是通过RNA经 碱基配对的方式形成二级结构，而后由酶识别。 在后一种可能中，识别剪接点的RNA可以来源 于转录产物的本身，或来源于其他的RNA分子， 如snRNA和scRNA。
2. 核基因mRNA剪接的机制 核基因mRNA剪接的机制
核提取物能完成mRNA前体的剪接，说 明mRNA的剪接与转录过程无关。 mRNA的剪接与RNA的修饰状态也没有 关系，没有帽子结构或poly（A）尾巴的 RNA都能完成剪接。
剪接可以分为三个阶段进行： 第一阶段，内含子的5’端切开，形成游离的 左侧外显子和右侧的内含子和外显子分子。 左侧的外显子呈线状，而右侧的内含子和 外显子并不呈线状。与在距内含子的3’端约 30个碱基处有一个高度保守的A，称为分支 位点（branching site）。内含子游离的5’端 以5’-2’磷酸二酯键与A相连，形成一个套索 （lariat）结构。
有些mRNA的3’末端没有poly（A）尾巴， 如组蛋白的mRNA，其3’末端的正确形成 依赖于RNA本身形成的茎环结构，即转录 终止于此处。 对茎环结构进行突变，只要是维持其二级 结构，就不影响转录的终止。说明二级结 构所提供的信息比序列本身更重要。
加尾反应需要的顺式元件
1. CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) & CstF (cleavage stimulation factor) bind to the poly-A signal, leading to the RNA cleavage 2. Poly-A polymerase (PAP) adds ~ 200 As at the 3’ end of the RNA, using ATP as a substrate
真核细胞核mRNA的加帽反应 真核细胞核 的加帽反应
不同真核生物的mRNA可有不同的帽子结构， 同一种真核生物的mRNA也常有不同的帽子 结构。 帽子结构的作用： 1.为核糖体识别RNA提供信号 2.增加mRNA的稳定性 3.为mRNA向胞质的运输提供信号 4 与某些RNA病毒的正链RNA的合成有关。
1977年，Broker和Sharp等人发现了断裂基 因。现在已经知道绝大多数真核生物的基 因都是断裂基因。断裂基因是通过mRNA 与DNA杂交试验而发现的。 一个基因的外显子和内含子共同转录在一 条转录产物中，然后将内含子去除而把外 显子连接起来形成成熟的RNA分子，这一 过程称为RNA剪接（RNA splicing）。
RNA processing 1
5’ end capping
The “cap”: a methylated guanine joined to the RNA transcript by a 5’-5’ linkage The linkage contains 3 phosphates 3 sequential enzymatic reactions Occurs early
3 mRNA前体的可变剪接 mRNA前体的可变剪接
mRNA前体通过不同方式的剪接，可由 一个基因的转录产物产生出不同的成熟 mRNA，从而翻译出不同的蛋白质的过 程称为可变剪接（alternative splicing）或 选择性剪接。 来自一个基因的mRNA前体因可变剪接 产生多种成熟mRNA，翻译出不同的蛋 白质，或形成一组相似的蛋白质家族， 都可称为同工型蛋白质（isoform）。
3. 后加工与mRNA的稳定性 后加工与mRNA的稳定性
转录后加工是产生各种成熟RNA分子的重要 过程。 各种RNA分子的加工都是在特定的酶参与下 完成的，包括核酸内切酶和核酸外切酶。核 酸酶除了参与后加工过程外，还负责过剩 RNA的降解。
原核生物mRNA降解的方向为5’至3’ ，可能 由内切酶在最后一个核糖体后面发挥作用。 余下的片段由外切酶按3’至5’的方向水解成 核苷酸。 mRNA分子结构中的二级结构可以阻止外切 酶的作用。
套索是通过内含子5’的保守G与分支点A 之间形成磷酸二酯键而形成的，这两个 碱基在所有的真核生物中高度保守。 在剪接过程中，没有酶的参与，但存在 一种机制在反应前对上述保守的序列元 件进行检查。只有这些元件都存在的情 况下剪接反应才会开始，而任一元件的 严重缺失都会抑制剪接反应。
SR proteins, bound to exonic splicing enhancers (ESEs), interact with components of splicing machinery, recruiting them to the nearby splice sites.
剪接体Splicesome： snRNA：U1， U2， U4， U5， U6 snRNP：U＋蛋白 质
剪接体按一定的顺序组装，已分离到一些 组装的中间体。只有组装完整的剪接体才 有功能。在剪接反应中，剪接体还会释放 和添加某些成分。 转酯反应只是磷酸酯键的直接转移，没有 水解反应的出现，因此不需要外部的能量， 也不需要供能物质如ATP或GTP的参与。 剪接体中起催化转酯反应的成分尚未弄清 楚，也不知道是蛋白质还是RNA在起作用。
(2) 3’ poly(A)尾巴
多数真核生物（酵母除外）的mRNA 3’末端具 有长约200 bp的poly（A）尾巴。 poly（A）尾巴不是由模板DNA所编码，而是 在转录后由RNA末端腺苷酸转移酶（RNA terminal riboadenylate transferase）催化下，以 ATP为前体，添加到mRNA的3’末端形成的。