《生物实验技术》第七章 特殊制片方法

第七章
第二节 线粒体制片法
成纤维细胞线条状线粒体 家兔肝脏细胞颗粒状线粒体
分布：除红细胞外的所有健 康动植物细胞
数量：与细胞代谢活动相关 大小：直径0.1~2μm
蝙蝠肝脏细胞棒状线粒体
第七章
第二节 线粒体制片法
材料：新鲜的肝、小肠或胰腺
注意事项： （1）选择年轻、健康的动物； （2）取材要迅速，不用麻醉剂，药物会损坏线粒体 （3）固定液：硝酸钴 0.5g，40%甲醛7.5ml，蒸馏水
解剖镜下定位包埋
第七章
第六节 胚胎定位包埋连续切片法
2、卵胚琼脂定位包埋法 材料：需要定位或较小的卵胚
第七章
第六节 胚胎定位包埋连续切片法
玻璃球针
注意事项
1.2%琼脂
定位
鱼卵
1~1.5mm
无脊椎动物卵胚
0.5~0.8mm
贴片
切角标记背腹
修
和切面
块
酒精脱水、苯透明、渐浸蜡
法透蜡、切片时定位要准确
所有切片均保留, 注意贴片方向
50ml （4）掌握好标本在酒精中的时间，酒精能溶解大部分
类脂质，线粒体是类脂质； （5）切片厚2-3μm。
第七章
第三节 高尔基体制片法
电镜图
绿色荧光探针显示人成纤维细胞中的 高尔基体(荧光显微镜观察)
第七章
第三节 高尔基体制片法
材料：中枢神经、神经节、腺体或其他致密脏器
注 1. 制片成功的关键在于取材固定，材料新鲜 意：2. 组织块薄而小
第七章 特殊制片方法
第一节 细胞分裂制片法
第二节 线粒体制片法 第三节 高尔基体制片法 第四节 肝糖制片法(自学) 第五节 结缔组织制片法（自学） 第六节 胚胎定位包埋连续切片法 第七节 细胞和组织化学制片法
掌握各种 制片法的 注意事项； 制片原理 （第七节）
第八节 免疫酶细胞化学技术
第九节 间接免疫荧光抗体技术（补充）
一、福尔根(Feulgen)反应显示DNA(去氧核糖核酸)法
1.原理：
切片组织DNA 水解 HCl
释出 嘌呤碱基
醌型
游离醛基
J加成反应
SO2
苯型
DNA存在的部 位呈现紫红色
无色亚硫酸品红（Schiff试剂）
碱性品红分子结构图
（对醌基被破坏,呈无色）
（发色团为对醌基，呈紫红色）
第七章
第七节 细胞和组织化学法
5. 反应结果要有重复性。
第七章
第七节 细胞和组织化学法
一、福尔根(Feulgen)反应显示DNA(去氧核糖核酸)法
1.原理： 腺嘌呤
N-糖苷键在强酸溶液中不稳定， 用盐酸水解核酸，可断裂DNA 分子中嘌呤碱基与脱氧核糖之 间的糖苷键，使嘌呤碱释出而 暴露出游离醛基。
DNA结构
鸟嘌呤
第七章
第七节 细胞和组织化学法
中午12~13点；夜里23~24点 （2）植物含水量多，易发生质壁分离，用纳瓦兴液固定； （3）植物中气体多，抽气固定； （4）酒精脱水的梯度要密； （5）用氯仿代替二甲苯透明； （6）用渐浸蜡法浸蜡； （7) 透明时材料易碎，不能用镊子夹取，可将材料放在
擦镜纸或筛绢折叠的纸袋中。
第七章
第二节 线粒体制片法
第七章
第一节 细胞分裂制片法
细胞分裂制片法：主要观察动物和植物细胞有丝分裂过程 中细胞核（染色体）的变化。
材料：洋葱根、蚕豆根、百合根，马蛔虫卵、蝗虫精巢、 对虾精巢等。
例：洋葱根尖细胞分裂制片
根尖部位
远离根尖部位
洋葱根尖细胞的有丝分裂
第七章
第一节 细胞分裂制片法
注意事项： （1）取材部位及时间（选分裂相多时取材），
阴暗冷凉处24h后，染液褪至无色或 淡黄色，密封保存于0~4℃暗处。保 存使用数日，用时升至室温。
第七章
第七节 细胞和组织化学法
一、福尔根(Feulgen)反应显示DNA(去氧核糖核酸)法
4. Feulgen反应程序：
（1）切片脱蜡，经各级酒精下行至水。 （2）入60℃的1N HCl中水解（在温箱内进行）
一、福尔根(Feulgen)反应显示DNA(去氧核糖核酸)法
2. 注意事项：
福尔根反应条件要求严格：Carnoy：
• 试剂需用分析纯 • 水解时间和温度
-70℃，固定7天, 水解：6min 4℃，固定24h, 水解：4min
不同固定液固定的标本水解时间不同P101
与材料的固定时间及固定温度有关
• 反应的时间和温度要掌握准确
• Schiff试剂的配制是染色成功的关键
第七章
第七节 细胞和组织化学法
一、福尔根(Feulgen)反应显示DNA(去氧核糖核酸)法
3. Sቤተ መጻሕፍቲ ባይዱhiff试剂的配制：
沸腾的蒸馏水200ml 冷却至50℃
1N HCl 20ml
碱性品红1g
冷却至25℃时 加无水偏重亚硫酸钠 或无水偏重亚硫酸氢钾 1~3g（产生SO2）
3. 固定液充足
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第四节 肝糖制片法(自学)
Best 洋红法示肝糖
第七章
第六节 胚胎定位包埋连续切片法
胚胎制片要求： • 定期观察，分期、连续固定标本 • 据所需切面准确定位包埋、切片 • 保留所有连续切片，如有失落要空出位置 斑马鱼胚胎早期发育图谱
第七章
第六节 胚胎定位包埋连续切片法
1、鱼卵解剖镜定位包埋法 材料： 较大的卵胚如蛙类和一些鱼类的卵胚
第七章
第七节 细胞和组织化学法
（Cytochemistry and histochemistry ）
以细胞学、组织学为基础，给予组织标本某种化学处 理，使细胞内的一定成分产生化学变化，在原位形成可见 的最终有色产物，并对其进行定性、定位、定量，研究生 物在生理或病理状态下细胞组织的代谢、机能及形态变化 规律。
Bouin氏液固定6~12h ，70%Alc冲洗 ，去酒精后，5%Formalin保存
脱水：50%Alc→70%Alc, 各5~10min， →甲脱水剂(纯酒精6份+氯仿3份+冰醋酸1份)，15~30min →乙脱水剂(正丁醇6份+氯仿3份+冰醋酸1份)，10~20min
松油醇透明15~30min 浸蜡：1/2松油醇1/2石蜡，5~10min→纯石蜡Ⅰ、Ⅱ，各10min
显微镜细胞组织化学 电镜细胞组织化学 免疫电镜细胞化学 免疫组织化学 酶组织化学
第七章
第七节 细胞和组织化学法
组织化学制片法的基本要求：
1. 保持组织细胞良好的形态结构。 2. 具备高度的特异性，可借助于阴性及阳性对照来证实
方法的特异性。
3. 应有一定的灵敏性，才能显示含量极微的物质 （10-9-10-12g）。 4. 生成的反应产物在原位沉淀、深色、不溶（或不被电子 穿过），为细小沉淀或结晶，定位精确并具有稳定性， 便于重复观察。