Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用PPT精选课件
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但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、 费用也比较高。
非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）
新3代基因组编辑工具
12
均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从
4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用
24
4.2 Cas9系统与病毒工具结合应用
25
B
4.2 Cas9系统与病毒工具结合应用
26
4.3 Cre-loxP、CRISPR-Cas9与病毒结合应用
2.4 CRISPR-Cas9技术优势
16
1. CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理论上基因组中每8 个碱基就能找到一个可用CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而 TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个 可用位点；
2. CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性：例如可以通过对 Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链， 这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的 染色体变异风险；此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白， 从而在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响；
2.3 CRISPR-Cas9技术流程
15
1. 靶基因分析：明确CDS外显子部分； 2. sgRNA位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要 结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确 定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果 是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成 熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。 3. Cas9载体构建：根据sgRNA序列，设计引物，合成带粘性末端的双链片段。对 表达载体先进行限制性内切酶酶切，得到线性化载体，再把前面得到的双链片段 连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定； 4. Cas9载体活性检测：转染细胞，采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理， 进行重组效率的检测。
3. CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步 就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，因此省时省力；
4. 可同时对多个基因进行操作而ZFNs和TALEN两项技术则 难以实现这种效果。
5. 多种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用 gRNA的靶向作用结合到dsDNA的任意位点，发挥人们预 期的功能。
Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。
Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp, 编码343个氨基酸, 38kDa, 单体蛋白。
Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能特异地在两个loxP位点
间发生基因重组。
Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、
而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰
2.1 CRISPR-Cas9技术来源
13
2.2 CRISPR-Cas9系统组成
14
DNA、RNA和蛋白质聚合物
Guide RNA:
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）
通过碱基配对与 tracrRNA （trans-
activating crRNA ）结合形成
3. 病毒载体
17
3.1 病毒载体比较
18
3.1 病毒载体比较
19
3.2 病毒载体应用
20 组成型启动子-感染特性决定表达分布
3.2 病毒载体应用
21 特异性启动子-空间和时间精细表达
4 组合应用示例——Cre-loxP与病毒工具结合
22
4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用
23
“条件性基因激活”模式
7
1.2 Cre-loxP技术应用——组织特异性应用
8 与组织特异性启动子结合应用，实现Cre转基因的空间控制
启动子
albumin insulin adipose protein 2 b-lactoglobin keratin 5 muscle creatine kinase
myosin protamine-1
tracrRNA/crRNA 复合物。通过人
工设计这两种 RNA，可以改造形成
具有引导作用的sgRNA （short
guide RNA ）
N代表任意DNA碱基
Cas9:
复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分，
Ruvc结构域剪切未配对的链。
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术 与病毒载体在基因敲除中的联用
2
Content
3
第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Cas9技术 第三节、病毒工具简介 第四节、组合应用示例
基因操作技术一览
4
1. Cre-loxP技术简介
5
Cyclization recombinase
环状甚至超螺旋DNA。
loxP位点，是locus of X-over P1的缩写，来自P1噬菌体。间隔序列决定loxP
的方向，如下所示： 13bp
8bp
13bp
ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-
TATACGAAGTTAT
1.1 Cre-loxP技术基本原理
6
1.2 Cre-loxP技术应用
诱导物
IFN tetracycline tamoxifen
Cre表达的靶组织
肝脏、免疫细胞 广泛表达 广泛表达
—MerCreMer重组蛋白
1.3 Cre-loxP技术仍有不足之处
10
Biblioteka Baidu
2. CRISPR-Cas9技术
传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替 11代靶基因片段，从而达到目的。
CD19 proximal lck Wnt-1 or engrailed-2
靶组织或细胞
肝脏 胰岛b细胞 脂肪细胞
乳腺 皮肤 骨骼肌
心脏 精子 B淋巴细胞 T淋巴细胞 神经系统
1.2 Cre-loxP技术应用——可诱导性应用
9 与诱导性表达启动子结合应用，对Cre转基因的表达进行控制
启动子
Mx1 CMV-tTA CMV-ER
非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）
新3代基因组编辑工具
12
均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从
4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用
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4.2 Cas9系统与病毒工具结合应用
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B
4.2 Cas9系统与病毒工具结合应用
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4.3 Cre-loxP、CRISPR-Cas9与病毒结合应用
2.4 CRISPR-Cas9技术优势
16
1. CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理论上基因组中每8 个碱基就能找到一个可用CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而 TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个 可用位点；
2. CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性：例如可以通过对 Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链， 这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的 染色体变异风险；此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白， 从而在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响；
2.3 CRISPR-Cas9技术流程
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1. 靶基因分析：明确CDS外显子部分； 2. sgRNA位点设计：确定待敲除位点，对于蛋白编码基因，如果该蛋白具有重要 结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确 定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果 是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成 熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。 3. Cas9载体构建：根据sgRNA序列，设计引物，合成带粘性末端的双链片段。对 表达载体先进行限制性内切酶酶切，得到线性化载体，再把前面得到的双链片段 连接入表达载体。再进行感受态细胞的转化和阳性转化子的鉴定； 4. Cas9载体活性检测：转染细胞，采用特异性片段扩增后进行的T7E1酶切处理， 进行重组效率的检测。
3. CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步 就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，因此省时省力；
4. 可同时对多个基因进行操作而ZFNs和TALEN两项技术则 难以实现这种效果。
5. 多种功能性蛋白都可以通过与Cas9蛋白融合，然后利用 gRNA的靶向作用结合到dsDNA的任意位点，发挥人们预 期的功能。
Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。
Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp, 编码343个氨基酸, 38kDa, 单体蛋白。
Cre重组酶不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能特异地在两个loxP位点
间发生基因重组。
Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、
而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰
2.1 CRISPR-Cas9技术来源
13
2.2 CRISPR-Cas9系统组成
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DNA、RNA和蛋白质聚合物
Guide RNA:
crRNA（ CRISPR-derived RNA ）
通过碱基配对与 tracrRNA （trans-
activating crRNA ）结合形成
3. 病毒载体
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3.1 病毒载体比较
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3.1 病毒载体比较
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3.2 病毒载体应用
20 组成型启动子-感染特性决定表达分布
3.2 病毒载体应用
21 特异性启动子-空间和时间精细表达
4 组合应用示例——Cre-loxP与病毒工具结合
22
4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用
23
“条件性基因激活”模式
7
1.2 Cre-loxP技术应用——组织特异性应用
8 与组织特异性启动子结合应用，实现Cre转基因的空间控制
启动子
albumin insulin adipose protein 2 b-lactoglobin keratin 5 muscle creatine kinase
myosin protamine-1
tracrRNA/crRNA 复合物。通过人
工设计这两种 RNA，可以改造形成
具有引导作用的sgRNA （short
guide RNA ）
N代表任意DNA碱基
Cas9:
复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分，
Ruvc结构域剪切未配对的链。
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术 与病毒载体在基因敲除中的联用
2
Content
3
第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Cas9技术 第三节、病毒工具简介 第四节、组合应用示例
基因操作技术一览
4
1. Cre-loxP技术简介
5
Cyclization recombinase
环状甚至超螺旋DNA。
loxP位点，是locus of X-over P1的缩写，来自P1噬菌体。间隔序列决定loxP
的方向，如下所示： 13bp
8bp
13bp
ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-
TATACGAAGTTAT
1.1 Cre-loxP技术基本原理
6
1.2 Cre-loxP技术应用
诱导物
IFN tetracycline tamoxifen
Cre表达的靶组织
肝脏、免疫细胞 广泛表达 广泛表达
—MerCreMer重组蛋白
1.3 Cre-loxP技术仍有不足之处
10
Biblioteka Baidu
2. CRISPR-Cas9技术
传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替 11代靶基因片段，从而达到目的。
CD19 proximal lck Wnt-1 or engrailed-2
靶组织或细胞
肝脏 胰岛b细胞 脂肪细胞
乳腺 皮肤 骨骼肌
心脏 精子 B淋巴细胞 T淋巴细胞 神经系统
1.2 Cre-loxP技术应用——可诱导性应用
9 与诱导性表达启动子结合应用，对Cre转基因的表达进行控制
启动子
Mx1 CMV-tTA CMV-ER