一例猪伪狂犬病病毒的诊断

糖蛋白 .R 该蛋白是一种主要的猪神经性因子 促 进细胞融合后导致 JKL 在动物机体有效扩散 现已 证实该蛋白在 JKL 入侵 血脑屏障和 疾病传播 中起 到重要作用 当前 在我国猪群中广泛使用猪伪狂犬病病毒 匈 牙 利 弱 毒 株 N,75A,*O'& 株 来 防 控 JKL 感 染 和 传播 使得 JK 曾经在我国得到有效控制 对 JKL 疫苗株 N,75A,*O'& 株进行基因组序列测定发现 该 株 表 现 为 .R 基 因 缺 失 基 因 缺 失 疫 苗 的 出 现 使 JKL 的血清学鉴别诊断成为可能 通过 .R 基因血 清学鉴别诊断试剂盒 多国已启动 JKL 根除计划 使 JKL 在全球部分国家已得到根除
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
福建畜牧兽医
第 !" 卷
第#期
$%&' 年
一例猪伪狂犬病病毒的诊断
王
摘 要
霞
福建省泉州市惠安县农林局
('$&%%
!"#$ 年 ## 月 当地某养殖户 #$ 日龄仔猪出现角弓反张 精神沉郁等疑似猪伪狂犬病病毒感染的典型神 经 症 状 但 查
看免疫程序 已免疫猪伪狂犬病疫苗 %&'()&*+,- 株 经 ./ 基因血清学调查和针对 ./ 基因的 012 诊断 证实该病例为猪伪狂 犬病病毒感染所致 关键词 猪伪狂犬病病毒 感染
'6( 王 勤 & 猪 伪 狂 犬 病 病 毒 $% 基 因 的 研 究 进 展 '+(& 畜 牧 与 兽
医 )!78!)69:18509!499&
猪血液后 按照常规分离血清的方法小心分离猪血 清 按照猪伪狂犬病病毒 .R 抗体诊断试剂盒说明 书推荐的步骤进行血清学检测
-4!
猪伪狂犬病病毒 ./ 基因病原学诊断
=G 该步 JQK 反应液的配置为 模板 & W上 下游 引物 .R*&B^.R*&K $% b 各 & W $cJQK 扩增试
带 与扩增的预期相符 见图 &
图 扩增 基因片段的核苷酸同源性比较

讨
论
在过去一段时期内 *,> 曾经在我国得到有效 控制 但自 $%&& 年以来 我国多地均报道过免疫经 典 *, 弱毒疫 苗 -89:;8 ='& 株 后仍然 发 生 典 型
*,> 感染的情况 国内多家单位对其病原学和疫苗
./ 基因
诊断
文章编号 &%%(*#((& $%&' %#*%%$%*%(
文献标识码 )
!"# $%&'()*%* )+ ,)-.%(/ ,*/0$)-&1%/* 2%-0* +,-. /0,
120,- 342-56 ,.70328527,8 ,-9 :47;<576 =27;,2> ?2,-@A42 B2C0,- ('$&%%
'#( 陈焕春 ) 方六荣 ) 何启盖 ) 等 &猪伪狂犬病病毒鄂 * 株的分离
鉴定 '+(&畜牧兽医学报 )#,,-)!-.!/01234131&
'!( 童 光 志 ) 陈 焕 春 & 伪 狂 犬 病 流 行 现 状 及 我 国 应 采 取 的 防 制
措施 '+(&中国兽医学报 )1,,,)1,.15014!"
学均进行了深入研究 发现新近流行的 *,> 毒株与 经 典 *,> 存 在 毒 力 差 异 和 抗 原 性 变 异 *, 疫 苗 -89:;8 ='& 株 无法对猪群提供 &%%M 有效保护 但 是 研究也发现 在当前尚无有效疫苗防控该型
*,> 之 前 经 典 疫 苗 仍 可 提 供 部 分 保 护 专 家 建 议 需继续对 *, 进行免疫 可有效降低因 *,> 感染导
琼脂糖凝胶电泳鉴定
&P$P(
基因序列测定和分析
符合试验预期的电泳
#3-
材料与方法 猪伪狂犬病病毒 ./ 基因血清学诊断 采集仔
目的条带经胶回收试剂盒切胶回收后 将目的片段 与 ` 克隆载体连接 随机选取 " 个单菌落摇菌后提 取相应的质粒进行 JQK 鉴定 JQK 鉴定所使用的引 物为 .R*&B^.R*&K 扩增的目的片段大小仍为 d'%
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剂 $( ) 补充灭菌去离子水至终体积 (% )*+, 扩增条件同上 将经 *+, 验证符合试验预期的重组 质粒送由专业测序公司进行序列测定 并对测定的 序列进行 -)./0 分析比较
EE++.+E+++..+E.+.+EEE++0+0.+.+E+0E +.+E.+E++0++EEE++E+EEE++E0E00+000E0 EE+EE0EEE+E.
\F]
a# 作 用 F E0- 待 恢 复 室 温 后 加 入 )S( 试 剂 #% W 混匀后作为 JQK 扩增的模板基因组 ST) JQK 反应液的配置为 模板 &% W 上 下游引物 .R*&B^.R*&K $% b 各 %PF W $cJQK 扩 增 试 剂 $% W 补充灭菌去离子水至终体积 d% W 扩增反 应条件为 ad 预变性 &% E0- 后进入循环 循环参 数 为 ad (% <'% (% <Z$ (% <d% 个 循 环 后 Z$ 延伸 &% E0- 取 JQK 产物 F W 进行常规
增片段大小为 #'% =G 本研究扩增采用动物组织直 接 扩 增 试 剂 盒 简 要 步 骤 如 下 取 试 剂 盒 中 的 )S& 试剂 #% W )S$ 试剂 &% W 混匀后加入 $% W 组 织研磨液上清 继续混匀一次 FF 水浴 &% E0- 后
在 UX 区中存在 JKL 的一种主要
JK($'#$5JL'%&"%& 和 JL'%&"%# 进行核 苷 酸 同 源性比较 可见本研 究测定的 67 基 因与 EFG-8G=
数 据 库 *,> 分 离 株 的 67 基 因 核 苷 酸 同 源 性 均 在
554%M 以上 见图 $
!&! 猪伪狂犬病病毒 $% 基因病原学检测 $4$4& *+, 检 测 使 用 针 对 67 基 因 的 引 物 67< ?&@67<,&进行 *+, 扩增 结果表明 *+, 扩增产物 琼脂糖凝胶上 靠近 (%% AB 条带附 近出现特异 性条
34*5-6.5 )5 -4D;E=;7 4: $%&F> &F*9,6*489 G0.8;5< <A4H;9 56G03,8 4G0<5A454-2<> 9;G7;<<04- ,-9 45A;7 -;27,8 <6EG54E<> HA03A <A,7;9 5A; <,E; ,< 56G03,8 G4730-; G<;2947,=0;< D072< IJKLM 0-:;3504-> =25 5A; G0.8;5< A,9 =;;- 0EE2-0@;9 H05A JK D,330-; IN,75A,*O'& <57,0-MP N,<;9 4- 5A; ;G09;E0484.03,8 0-D;<50.,504- ,-9 <;7484.03,8 0-D;<50.,504->JQK 90,.-4<0< 5,7.;50-. H05A 5A; .R .;-; 4: JKL> 5A; 7;<285< <A4H;9 5A0< H,< JKL 0-:;3504-P 7/8 9)-$* G4730-; G<;2947,=0;< D072< 0-:;3504- .R .;-; 90,.-4<0<
列在基因组中方向并不完全一致 表现为同向和反 向两种情况
\&*#]
肺脏 腹股沟淋巴结 研磨后反复冻融 ( 次 # %%% 7^
E0- 离心 $% E0- 后 小心吸取上清备用 &P$P$ .R 基因的扩增 针对 JKL 的 .R 基因特征 利 用 分 子 生 物 学 软 件 _80.4Z 设 计 引 物 上 游 引 物 .R*&B )`Y)QQ`Q))QYYQY)QQ`Q 下游引物 .R* &K `QYQQQ)QQYQQ)Q)))Y))Q) 引 物 预 期 扩
将扩增的序 列与 EFG-8G= 数据库 *,> 分离株 的 67 基因 EFG-8G= 号分别 .?&H&5IH JK($'#$H
!"#
结
果 经酶标
猪伪狂犬病病毒 $% 基因血清学检测
仪测定 样品 123(% 值为 %45& 试剂盒阳性对照和阴 性对照 12#(% 值均符合试剂盒质控要求 表明仔猪 的 伪 狂 犬 病 病 毒 67 基 因 血 清 学 检 测 结 果 为 阳 性 经查免疫程序发现 该猪已免疫猪伪狂犬病疫苗 -89:;8<='& 株 表明该猪群存在 *,> 感染
序列 结果如下
67@6P 双基因 缺失和 67@6P@0J 多基 因缺失在实 验室
均表现较好的免疫保护 N"<5O 该免疫保护可同时抵抗 经典和新发 *,> 的感染 需要指出的是 疫苗的研 发到上市还需要较长的时间 猪场在当前阶段除继 续接种疫苗外 还需要在引种 日常饲养等环节加强 防控 注意患病猪群的隔离和净化 也可在一定程度 上减少猪场的经济损失
猪 伪 狂 犬 病 病 毒 G4730-; G<;2947,=0;< D072<
&P$P&
病料采集和处理
剖杀感染仔猪后 采集其
JKL 属于疱疹病 毒科 1;7G;<D0709,; * 疱疹病 毒 亚 科 )8GA,A;7G;<D070-,; 水 痘 病 毒 属 !"#$ %&''()$#*+ JKL 基因组为双股 ST) 病毒全基因组 长 &F% O= 左右 病毒基因组中存在独特长 U-0V2; 84-.UW 区和独特短 U-0V2; <A475 UX 区 研究发 现 JKL 的 YQ 含量超过 Z%[ 其 UW 区和 UX 区序
图
基因的 鉴定
致的损失 N'<HO 值得欣喜的是 目前针对该病疫苗的研究已见 有大量的报道 如针对新 *,> 进行 67 单基因缺失
C 2D. 分子量标准 $%%% & 检测样品 $ 阴性对照
$4$4$
序列测定
将阳性重组质粒经序列测定后经
-)./0 分析符合预期后获得所扩增的 67 的核苷酸
参考文献
.0E.++0+..+EE+E.++0+E.+EE+E.+E. ++E++E+E+EEE+00+EE+0+EE+++0+E+.0+++ 0E.EEE.EE+E+++++EE+++.0+0EE0E..+E0 E0++E.EEE+E++..+00+.+++0+E.+E+E+E+E E+E.+EE+E++E0E+0EE++EEE.0+0EE.+E00+ +0E+++E0++E+EE+0E+E.+E++E0E0+EE0E.+ +.+EE0E0E+00+E.E.++E+E0E++.+++EE.++ 0EE0E+0EEE++E+E++0E+E0++++E.EE+++EE E.E.0EEE+.0+EE+E.+0.++0E++E+++E.EE 0E++E+EE+0++EE+E+E.E++E+++.0+E0+.++ ++EE.E+EE0EE0+E++E+.++0E.E+E0++0E+E