WB使用技巧集锦
Western Blot使用技术手册
生物医药基地western blot技术手册1.western blot 主要试剂的配方1.1 5×电泳缓冲液配方(1L)注意事项：a.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。
b.配制好的溶液放于4度冰箱保存，使用时用纯水稀释至1×使用。
1.2 1×转膜液配方（1L）注意事项：a.加入适量的纯水，用磁力转子将各组分溶解后加入甲醇溶液，最后用纯水定容至1L（甲醇气味大，通风厨内配制，并注意戴口罩）。
b.加水时应尽量避免气泡的产生，否则会造成过多SDS的损耗。
1.3 10×TBS配方（1L）注意事项：a.加入适量的纯水溶解各组分后，使用浓盐酸或浓氢氧化钠溶液调节溶液的PH至7.6（一般溶解后溶液是偏碱的，所以选用浓盐酸调节PH至7.6即可）。
b.使用PH计调节溶液的PH前，要按照说明书校准PH计。
c.PH调节至7.6后，用纯水定容至1L，使用时稀释10倍至1×使用。
d.配制TBST时，在1×TBS中按照1:1000的比例加入吐温20充分混匀即可。
1.4 30%丙烯酰胺单体储存液配方（100ml）注意事项：a. 将各组分溶于总体积为60ml的纯水中，加热至37℃完全溶解，用纯水定容至100ml。
b. 用装0.45µm膜的滤器过滤，置于棕色瓶中保存于4℃冰箱保存。
c. 丙烯酰胺有神经毒性，操作时戴手套，并注意不要造成实验台面等的污染。
1.5 上液（1M Tris-HCl PH=6.8）配方（50ml）注意事项：用浓盐酸调节PH至6.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。
1.6下液（1M Tris-HCl, pH8.8 ）（50ml）注意事项：用浓盐酸调节PH至8.8，再用三蒸水定容至50ml，4℃冰箱保存。
2. Western Blot 主要流程2.1蛋白样品的提取2.1.1常用裂解液及其特点2.1.2 医药基地常用蛋白质提取方法⑴RIPA强裂解法：a. 取适量胰酶消化细胞（针对对贴壁细胞，悬浮细胞可省略此步），收取细胞，PBS洗两遍，600g离心5min，尽量去除PBS，向细胞沉淀中加入适量的预加了蛋白酶抑制剂PMSF的RIPA强裂解液（80ul ——200ul不等，根据自己细胞量的多少定）。
WB技术——精选推荐
WB技术免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专⼀性作⽤为基础的⽤于研究蛋⽩质相互作⽤的经典⽅法。
是确定两种蛋⽩质在完整细胞内⽣理性相互作⽤的有效⽅法。
其原理是：当细胞在⾮变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋⽩质－蛋⽩质间的相互作⽤被保留了下来。
如果⽤蛋⽩质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋⽩质Y也能沉淀下来。
⽬前多⽤精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的⽬的。
这种⽅法常⽤于测定两种⽬标蛋⽩质是否在体内结合；也可⽤于确定⼀种特定蛋⽩质的新的作⽤搭档。
其优点为：（1）相互作⽤的蛋⽩质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋⽩的相互作⽤是在⾃然状态下进⾏的，可以避免⼈为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作⽤蛋⽩复合物。
缺点为：（1）可能检测不到低亲和⼒和瞬间的蛋⽩质－蛋⽩质相互作⽤；（2）两种蛋⽩质的结合可能不是直接结合，⽽可能有第三者在中间起桥梁作⽤；（3）必须在实验前预测⽬的蛋⽩是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，⽅法本⾝具有冒险性。
⼆、准备⼯作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮⼦（⽤保鲜膜包好后，埋冰下），离⼼机1. ⽤预冷的PBS洗涤细胞两次，最后⼀次吸⼲PBS；2. 加⼊预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养⽫或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养⽫、75cm2培养瓶)3. ⽤预冷的细胞刮⼦将细胞从培养⽫或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP 管插冰上，置⽔平摇床上）4. 4℃，14000g离⼼15min，⽴即将上清转移到⼀个新的离⼼管中5. 准备Protein A agarose，⽤PBS 洗两遍珠⼦，然后⽤PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋⽩中加⼊100µl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置⽔平摇床上），以去除⾮特异性杂蛋⽩，降低背景7. 4℃，14000g离⼼15min，将上清转移到⼀个新的离⼼管中，去除Protein A珠⼦8. (Bradford 法)做蛋⽩标准曲线，测定蛋⽩浓度，测前将总蛋⽩⾄少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存⼀个⽉）9. ⽤PBS将总蛋⽩稀释到约1 µg/µl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋⽩在细胞中含量较低，则总蛋⽩浓度应该稍⾼（如10 µg/µl）10. 加⼊⼀定体积的兔抗到500µl总蛋⽩中，抗体的稀释⽐例因兴趣蛋⽩在不同细胞系中的多少⽽异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议⽤2 h室温孵育12. 加⼊100µl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所⽤抗体为⿏抗或鸡抗，建议加2 µl"过渡抗体"（兔抗⿏IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离⼼5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，⽤预冷的RIPA buffer洗3遍，800µl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使⽤PBS14. ⽤60µl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要⽽定（60 µl⾜够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠⼦，离⼼，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。
western blot操作技巧及常见问题分析
Western Blot 操作技巧及常见问题分析汉恒生物提供病毒包装服务你的Western Blot结果是否出现过非特异性条带？条带变窄变宽了？条带哭了条带笑了？信号太弱了？等情况，所以现在需要提升一下你的Western Blot结果的颜值了！如何使电泳条带漂亮些？电泳注意事项●为减少小蛋白条带的扩散，上样后应尽快开始电泳●如用预染Marker，当要分辨的蛋白到达最佳分辨区——分离胶的2/3处，结束电泳●电泳用恒压模式能保持蛋白质恒定的电泳迁移率，而电压先低后高可使样品更好的进入凝胶。
实际电压可根据时间安排调节，电压高时电泳发热大，电压低于50V时小蛋白容易弥散，凝胶分辨率会下降。
影响跑胶的质量，有以下因素：●胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。
倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，水或饱和正丁醇隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶，使胶不均匀。
●聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。
建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。
●电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。
电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。
●样品，在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素，可以克服由于样品溶解不佳引起的纹理和拖尾现象。
●减少上样量可以避免由于加样量太多引起蛋白带过宽或与邻近泳道的蛋白带相连。
WB常见问题分析高背景原因解决办法蛋白浓度过高降低抗体浓度膜的污染使用干净镊子；戴手套操作；换一张新膜用足够的液体，膜始终保持湿润；孵育时使用脱色摇床；避免膜重叠，互相覆盖；小心操作，勿毁损膜漂洗不完全增加漂洗时间和缓冲液体积封闭液不适合比较尝试不同封闭液封闭不完全延长封闭时间（可4℃过夜）抗体浓度过高优化降低一抗、二抗浓度曝光时间过长缩短曝光时间缓冲液污染使用新配制缓冲液信号弱或无信号原因解决办法抗原量不足增加上样量，使用阳性对照；减少漂洗，可将TBST改为TBS蛋白质在储存过程中降解重新制备样品转膜不完全转膜后确定转膜效率、保证胶与膜充分结合、保证电极正确装配、控制转膜温度（冰袋降温）、优化转膜电流及时间。
WB原理及操作注意事项详解
WB原理及操作注意事项详解一、WB原理WB即White Balance，是指相机调整图像色彩的设置，使得图像中的白色或中性颜色看起来真实且准确。
它通过测量图像所拍摄的场景中的白色参考点，将该点设置为真实的白色或中性颜色，并通过调整其他色彩来实现整个图像的色彩平衡。
相机根据光源的颜色温度进行色彩校正。
颜色温度是指光源的色彩发光特性，通常以单位开尔文（K）表示。
较低的数值代表较暖的色彩，较高的数值代表较冷的色彩。
在室内拍摄环境中，常见的光源有白炽灯、荧光灯、LED灯等，它们的颜色温度不同，因此会影响图像的色彩表现。
若相机的白平衡设置不正确，图像中的白色或其他颜色会出现偏色，使得图像色彩失真。
二、操作注意事项1.使用自动白平衡模式：现代的相机一般都提供自动白平衡模式，可以根据光源的颜色温度自动调整色彩，方便又快捷。
在大多数情况下，自动白平衡模式能够满足拍摄需求，因此建议使用自动模式进行拍摄。
2.手动白平衡校准：一些特殊情况下，自动白平衡模式无法准确识别光源的颜色温度，这时可以选择手动白平衡校准。
具体操作是在相机菜单中找到白平衡设置选项，然后按照相机说明书或菜单提示进行校准操作，通常需要拍摄一个白色卡片或中性灰色卡片作为参考。
手动白平衡校准需要一定的经验和技巧，对于初学者来说可能需要多次尝试才能获得满意的效果。
3.手动设置白平衡模式：除了自动白平衡模式和手动白平衡校准，一些相机还提供了多种预设的白平衡模式，如阴影、日光、白炽灯等。
这些模式可以根据实际拍摄环境的光源特点选择，以便更准确地调整图像的色彩。
4.考虑周围光源：光源的颜色温度可能在不同的环境中发生变化，在拍摄时需要注意周围光源的情况。
例如，如果在室内拍摄时有窗外的自然光进入室内，可能会导致色彩偏差。
此时可以使用相机的曝光补偿功能来调整亮度，或者添加反光板、遮光板等辅助工具来控制光线。
5.各种光源的颜色温度：不同的光源具有不同的颜色温度，以下是一些常见光源的颜色温度范围供参考：-白炽灯：约2500K-3000K；-电晕灯/日光灯：约3500K-4500K；-太阳光：约5000K-5500K；-阴天/阴影：约6000K-7500K；了解各种光源的颜色温度范围，可以帮助拍摄者更好地选择相机的白平衡模式，准确调整图像的色彩。
WB的原理、操作及注意事项2篇
WB的原理、操作及注意事项2篇【第一篇】WB的原理、操作及注意事项WB是音频处理中常用的一个效果，用于调整音频信号中的频率平衡，使音频听起来更加平衡、清晰和自然。
本文将介绍WB的原理、操作及注意事项。
一、原理1. 音频频率平衡WB通过调整不同频率范围对应的音量，来达到频率平衡的效果。
人耳对不同频率的敏感度是不同的，一般来说，中频对人耳的感知更敏感，低频和高频相对较低。
因此，WB的原理是根据人耳的感知特点，提升或削弱不同频率范围的音量，使得整个音频频率范围听起来平衡。
2. 三个控制参数WB一般拥有三个控制参数，即低音、中音和高音。
通过调整这三个参数的数值，可以增强或减弱不同频率范围的音量。
常见的控制参数数值为-12dB到+12dB之间，分别对应削弱和增强音量。
二、操作1. 加载WB效果器首先，将WB效果器加载到音频处理软件的插件栏中。
常见的音频处理软件如Adobe Audition、Logic Pro X等都具备这一功能。
2. 设置控制参数调整低音、中音和高音的参数数值，根据音频的实际情况来决定增强或削弱哪个频率范围的音量，以达到平衡的效果。
可以通过耳朵来感受音频的变化，不断地调整参数数值，直到达到满意的效果。
3. 实时监听在设置参数的过程中，要实时监听音频的变化。
可以使用耳机或扬声器来播放音频，确保调整后的效果符合要求。
4. 预设保存如果达到了满意的效果，可以将参数数值保存为预设。
这样在后续的音频处理中，可以直接加载预设，省去再次调整参数的时间。
三、注意事项1. 调整幅度适度在进行WB时，要注意调整的幅度适度，尽量避免过度增强或削弱某个频率范围的音量。
过度增强会导致音频失真，而过度削弱则会使音频听起来不自然。
2. 音频良好录制WB只是对音频进行后期处理，如果原始录制的音频质量不好，进行WB也很难改善效果。
因此，在进行音频录制时，要注意选择合适的录音设备，保证录制的音频质量。
3. 不同音频应用不同参数不同类型的音频可能需要不同的WB参数设置，例如音乐制作、语音广播、电影配乐等，需要根据具体应用场景来调整参数，以达到最佳效果。
大分子量400蛋白wb技巧
大分子量400蛋白wb技巧大分子量400蛋白WB技巧引言：Western blot（简称WB）是一种常用的蛋白质分析技术，能够检测特定蛋白质在复杂混合物中的存在与表达水平。
大分子量蛋白在WB 中的检测是一项挑战，需要特别的技巧和注意事项。
本文将介绍一些用于大分子量400蛋白WB的技巧，以帮助研究人员获得准确和可靠的结果。
1. 优化蛋白质提取和裂解对于大分子量400蛋白，蛋白质提取和裂解过程至关重要。
使用较强的裂解缓冲液，含有蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，确保完全溶解蛋白质。
此外，可以使用超声波破碎仪或高压细胞破碎仪来增加样品的可溶性。
2. SDS-PAGE电泳条件的优化对于大分子量蛋白，选择适当的凝胶百分比和电泳条件非常重要。
较低的凝胶百分比（例如6％）可用于更好地分离大分子量蛋白。
此外，延长电泳时间和提高电流可以增强大分子量蛋白的迁移速度。
3. 蛋白转移的优化大分子量蛋白的转移效率通常较低。
为了提高转移效率，可以选择较长的转移时间和较低的电流。
此外，使用0.2μm或0.45μm的PVDF膜可以增强转移效果。
4. 抗体选择和免疫检测选择特异性和高亲和力的一抗和二抗非常重要。
对于大分子量蛋白，建议使用经过验证的抗体，并进行适当的稀释。
此外，可以尝试不同的检测方法，如增强化学发光（ECL）或荧光探针，以提高信号强度。
5. 质量控制和标准化为了确保实验结果的准确性和可重复性，建议在每个实验中包括阳性和阴性对照。
阳性对照可以是已知表达目标蛋白的细胞系，而阴性对照可以是未表达目标蛋白的细胞系。
此外，可以使用分子量标记物来验证蛋白的大小。
结论：通过优化蛋白质提取和裂解、优化SDS-PAGE电泳条件、优化蛋白转移、选择适当的抗体和免疫检测方法，并进行质量控制和标准化，可以提高大分子量400蛋白WB的可靠性和准确性。
以上技巧可以帮助研究人员获得更好的实验结果，推动蛋白质研究的进展。
WB操作-郭子龙讲解
鉴于实验技术方法的改进以及试剂商品化程度的提高，本操作指南中的部分内容目前仅作参考学习，在实际实验过程中可能不会用到。
一、实验原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。
二、蛋白样品制备（根据样品及检测要求选适当提取方法，蛋白样品制备是WB 的第一步，更是决定WB成败的关键步骤。
）1.样品与试剂组织(Storage: -80℃)；RIPA裂解液(强) (谷歌生物；beyotime:P0013B Storage: -20℃，一年有效。
大瓶装买回来后及时用10ml EP管分装，尽量避免过多的反复冻融。
在分装的Ep管上标明分装当日日期，每使用一支要在EP管上做个标记，用完一支再启封新的。
如果不嫌麻烦，初次分装RIPA裂解液时分装于10ml Ep管中，用于组织裂解；用于上样蛋白配制的分装一部分于1.5ml Ep管中。
PMSF (谷歌生物；Solarbio: Cat.No.P0100 Lot.No.20150716 Storage: -20℃。
100mM)10×SDS样品缓冲液量取下列试剂，置于10ml塑料离心管中1M Tris-Hcl，PH6.8 2.5mlSDS 0.5gBPB 50mg甘油5ml加去离子水溶解后定容至10ml。
小份（500μl/份）分装后，于室温保存。
使用前将50μl的2-ME加到每小份中，加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
2.仪器与耗材组织蛋白：玻璃匀浆器；手术剪；冰；冰盒；镊子；1.5mL Ep管；Ep管架；10ul、1000ul加样器；tip头；称量纸；低温高速离心机；电子天平。
细胞蛋白：冰；冰盒；镊子；1.5mL Ep管；Ep管架；10ul、1000ul加样器；tip头；称量纸；低温高速离心机；电子天平。
Western blot操作要点概述
Western blot操作要点概述目录实验内参选择PART 1Western blotWestern blot实验内参选择内参是WB实验中的标准参照物，一般选用管家基因表达的蛋白作为内参，管家基因即在所有细胞中均有表达的一类基因，其产物是对维持细胞生命所必须的，其蛋白表达也相对恒定，不容易因为外部条件变化而引起表达量的变化。
常用内参：GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）β-Actin（肌动蛋白，细胞骨架蛋白）β-Tubulin（微管蛋白，细胞骨架蛋白）经验总结：1.β-Actin：相对使用最多，对大多数组织和细胞的实验来说β-Actin是最适合的内参。
β-Actin 作为内参是得到公认的，它广泛分布于大多数组织及细胞的细胞质内，表达量非常丰富。
2.GAPDH：膜蛋白的WB一般用GAPDH为内参，当实验过程涉及应激、缺氧、糖代谢紊乱等状态时，不建议使用GAPDH为内参，GAPDH是三梭酸循环途径中的一个酶，因此上述的状态可能会改变此酶的表达和活性。
3.β-Tubulin：心肌蛋白和横纹肌的 WB实验内参，建议选择β-Tubulin。
膜的选择及特点PART 2Western blot实验WB实验中使用的固相支持物有硝酸纤维素(NC)膜，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜以及尼龙膜硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜(NC膜)是蛋白印迹实验的标准固相支持物。
在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，由于硝酸纤维素膜(NC膜)的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。
在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜(NC膜)。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。
大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果需要检测小于7KD的蛋白，还可以用到0.1μm的膜。
7wb数据分析的方法与技巧
数据分析技巧和方法1.数据分析必须遵循的原则数据分析是为了验证假设的问题，提供必要的数据验证数据分析是为了挖掘更多的问题，并找到深层次的原因不能为了做数据分析而做数据分析2.数据分析的步骤数据分析有极广泛的应用范围。
典型的数据分析可能包含以下三个步：1、探索性数据分析，当数据刚取得时，可能杂乱无章，看不出规律，通过作图、造表、用各种形式的方程拟合，计算某些特征量等手段探索规律性的可能形式，即往什么方向和用何种方式去寻找和揭示隐含在数据中的规律性。
2、模型选定分析，在探索性分析的基础上提出一类或几类可能的模型，然后通过进一步的分析从中挑选一定的模型。
3、推断分析，通常使用数理统计方法对所定模型或估计的可靠程度和精确程度作出推断。
数据分析过程实施数据分析过程的主要活动由识别信息需求、收集数据、分析数据、评价并改进数据分析的有效性组成。
一、识别信息需求识别信息需求是确保数据分析过程有效性的首要条件，可以为收集数据、分析数据提供清晰的目标。
识别信息需求是管理者的职责管理者应根据决策和过程控制的需求，提出对信息的需求。
就过程控制而言，管理者应识别需求要利用那些信息支持评审过程输入、过程输出、资源配置的合理性、过程活动的优化方案和过程异常变异的发现。
二、收集数据有目的的收集数据，是确保数据分析过程有效的基础。
组织需要对收集数据的内容、渠道、方法进行策划。
策划时应考虑：①将识别的需求转化为具体的要求，如评价供方时，需要收集的数据可能包括其过程能力、测量系统不确定度等相关数据；②明确由谁在何时何处，通过何种渠道和方法收集数据；③记录表应便于使用；④采取有效措施，防止数据丢失和虚假数据对系统的干扰。
三、分析数据分析数据是将收集的数据通过加工、整理和分析、使其转化为信息，通常用方法有：老七种工具，即排列图、因果图、分层法、调查表、散步图、直方图、控制图；新七种工具，即关联图、系统图、矩阵图、KJ法、计划评审技术、PDPC法、矩阵数据图；四、数据分析过程的改进数据分析是质量管理体系的基础。
wb striping buffer技巧
wb striping buffer技巧Western Blot（WB）是一种常用的生物化学技术，用于检测蛋白质在样本中的表达情况。
在完成一次Western Blot实验后，有时需要剥离已经结合的抗体，以便重新利用同一张膜进行其他蛋白的检测。
这时，就需要使用到WB Stripping Buffer。
WB Stripping Buffer的主要作用是去除已经结合在膜上的抗体，使膜可以重新用于其他蛋白的检测。
使用WB Stripping Buffer时，需要注意以下几点技巧：选择适合的Stripping Buffer：不同的Stripping Buffer可能具有不同的剥离效果和适用范围，因此需要根据实验需求和膜的类型选择合适的Stripping Buffer。
控制孵育时间和温度：孵育时间和温度是影响Stripping Buffer剥离效果的重要因素。
一般来说，室温下孵育30分钟左右可以达到较好的剥离效果，但如果膜上结合的抗体较多或者较难以去除，可以适当延长孵育时间或者提高孵育温度。
充分洗涤：在剥离抗体后，需要用适当的缓冲液充分洗涤膜，以去除残留的Stripping Buffer和剥离下来的抗体。
洗涤的次数和时间也需要根据实验情况进行调整。
注意膜的保存：剥离后的膜需要妥善保存，以避免膜上的蛋白被降解或者污染。
一般来说，可以将膜浸泡在适当的缓冲液中，存放在4℃冰箱中备用。
总之，使用WB Stripping Buffer需要注意多个方面的技巧，包括选择适合的Stripping Buffer、控制孵育时间和温度、充分洗涤以及注意膜的保存等。
只有在掌握了这些技巧后，才能更好地利用WB Stripping Buffer进行Western Blot实验。
最全的WesternBlot(WB)技术手册
最全的western blot技术⼿手册蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册蛋白免疫印迹杂交（Western Blot WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳1 PAGE胶的制备2 蛋白分子量Marker3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳C 转膜与显色（Western Blot）1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测：丽春红4 膜的封闭5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制WB概述: 检测原理:A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1：尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）2：保持蛋白的处于溶解状态（通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择）3：提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂） 4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）5：样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA（附录1）全蛋白抽提试剂盒细胞质（可溶蛋白）Tris-HCl（附录1）胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质（细胞骨架等不溶蛋白）Tris-Triton（附录1）蛋白分级抽提试剂盒细胞质（磷酸化蛋白）磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA（附录1）膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA（附录1）核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA（附录1）线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂（种类与量见本节2）2 吸净PBS，加入预冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2 flask).3 用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min（根椐细胞种类不同调整离心力）6 轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2 组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中，加入液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，（最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml, 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).4 4℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至新预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,3A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL，或按下表配制：备注：其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下：所有步聚均需在通风橱中进行：1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液.2. 用盐酸HCl 调至pH 9.03. 煮沸至溶液无色,尽量减少水分挥发.4. 冷却至室温5. 再调pH 至 9.06. 再煮沸至无色7. 重复上述过程,直至溶液煮沸冷却后达pH 9.08. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用.A-3 蛋白定量Bradford 法 Lowry 法或BCA 法（均有商品化试剂盒可选择，操作简单、需分光光度计或酶标仪），小牛血清白蛋白 (BSA) 作为标准曲线。
WB操作步骤及经验
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O 至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。
过滤后4°C保存。
这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL 调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。
PH太低时，聚合反应受到抑制。
AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。
去离子水配制数ml，临用前配制.6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，冻存。
7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
8、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀释10倍。
PH8.39、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水至总量1L。
主要定位细胞核蛋白的wb技巧
主要定位细胞核蛋白的wb技巧
Western blot（WB）技术是一种用于检测和定量蛋白质的方法，其主要定位细胞核蛋白需要一些特定的步骤和技巧。
首先，需要合
适的细胞裂解缓冲液来提取细胞核蛋白。
一般来说，含有离子型非
离子表面活性剂（如NP-40或Triton X-100）的缓冲液可以有效地
裂解细胞膜，释放细胞核蛋白。
其次，在离心后，收集上清液，这
一步很关键，可以避免核外蛋白的干扰。
接下来，需要进行蛋白质
的浓缩和纯化，可以使用丙酮沉淀或者TCA沉淀的方法。
之后，将
蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后转移至膜上。
在转膜后，
需要使用适当的抗体来检测细胞核蛋白，一般来说，可以选择针对
特定核蛋白的抗体，如histone抗体等。
在膜上进行免疫印迹检测后，可以使用化学发光或者荧光染色技术来观察和定量细胞核蛋白
的表达水平。
另外，要注意实验中的一些细节，比如处理细胞的时间、温度、蛋白质转移的条件等，都会对结果产生影响。
在进行实
验时，需要严格控制这些因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。
总的来说，主要定位细胞核蛋白的WB技巧需要注意样本的提取、纯化、分离、转膜和检测等多个环节，只有严格控制每个步骤，才能
获得准确的实验结果。
WB快速转膜液的使用方法及步骤
WB快速转膜液的使用方法及步骤WB（Western Blot）快速转膜液是一种用于快速转移蛋白质到膜上的试剂，下面是它的使用方法及步骤：1.准备工作：a.确保准备好充足的试剂和设备，包括WB快速转膜液、蛋白样品、PVDF或NC膜、转移仪器（如半湿式转膜仪）、电源、电泳槽及电泳缓冲液等。
b.准备蛋白样品，可根据需要进行提取、纯化和浓缩，使其达到所需的浓度和体积。
2.样品加载：a.准备SDS-胶，根据需要制备好胶模和配制好胶液。
b.加载蛋白样品到胶槽中，根据样品的大小，决定加载的量。
同时，可以加入分子量标记物，用于判断转膜的效果。
3.电泳：a.将胶槽装入电泳槽中，注意确保准备好电泳缓冲液，使其液面略高于胶。
b.运行电泳，根据需要设置合适的电压和时间，直至样品达到所需分离效果。
4.转膜前处理：a.准备转膜装置，将半湿式转膜仪的阴阳极腔填充相应的传输缓冲液。
b.预处理膜，将PVDF或NC膜浸泡在甲醇中，然后再用水清洗，以激活膜表面。
5.膜的组装和转膜：a.将预处理过的膜放在转膜装置中，确保膜的位置正确。
b.将电泳胶板从胶槽中取出，轻轻为其去除上下的玻璃板，然后将胶板与膜组合，确保它们的接触紧密。
c.放入转膜装置中，确保膜的位置不变，并将装置封闭。
6.转膜：a.开始转膜，设置合适的电压和时间来进行转膜。
b.在转膜过程中，可以根据需要监测转膜效果，通过分子量标记物的位置和强度来判断。
7.转膜后处理：a. 转膜结束后，将蛋白质转移到膜上，可以用Ponceau S染色来检查蛋白质转印效果。
b.可以根据需要进行后续的免疫检测步骤，如抗体探针的孵育、洗涤等。
8.图像获取和分析：a.使用适当的检测方法来获取膜上蛋白质的图像，可以通过化学发光法、染色法或荧光扫描仪等设备。
b.用适当的图像分析软件对图像进行定量分析，如测量带状物的密度、计算蛋白质的相对表达水平等。
总结：WB快速转膜液能够方便、快速地将蛋白质转移到膜上，并提供了高效、可靠的蛋白质检测方法，对于进行Western Blot实验具有重要意义。
wb剪膜技巧
wb剪膜技巧
在蛋白质免疫印迹实验（Western Blot，WB）中，有时需要将膜剪裁为适当的大小。
以下是一些剪膜的技巧：
1. 确定剪裁区域：根据实验需求，确定需要剪裁的膜区域。
通常，可以将膜分为两部分，一部分用于目的蛋白的检测，另一部分用于内参蛋白的检测。
2. 使用干净的剪刀：确保剪刀干净，没有任何残留物，以避免对膜造成污染。
3. 保持操作台整洁：在剪裁膜的过程中，保持操作台整洁，避免灰尘或其他杂质落在膜上。
4. 固定膜：在剪裁膜之前，可以用纸巾或吸水纸将膜固定在操作台上，防止滑动。
5. 对齐膜：在剪裁膜之前，确保膜对齐，以便将膜分成两部分。
6. 轻压膜：在剪裁膜的过程中，可以用手指轻轻压住膜，帮助剪刀更好地裁剪。
7. 保持干燥：在剪裁膜之后，确保膜干燥，以避免内参蛋白的检测受到干扰。
总之，在剪裁膜时应该注意细节，保持清洁和干燥，以确保实验结果的准确性。
同时，如果不确定如何进行剪裁，可以请教有经验的实验人员或查看相关的实验教程。
WB操作方法
5.4.1总蛋白的提取（1）将培养板内的培养液弃掉，用4℃预冷的0.01M PBS(PH7.2~7.4)洗涤细胞2次。
先配置的裂解液（内含RIPA缓冲液5mL、5ug/mL Aprotinin 、5ug/mL Leupeptin和100μg/m L的PMSF蛋白酶抑制剂）100μL/孔，浴中静置30min。
（2）细胞刮刀将细胞从板壁上刮去下来转移至离心管中，4℃下以12000rpm 离心30min，小心收集离心后的上清液，重新转移至新的离心管中，分装保存于-80℃待用。
5.4.2制作标准曲线Bradford法测定蛋白浓度（1）配制10 mg/mL BSA的母液，临用前稀释至1mg/mL使用。
（2）取18只10mL EP 管，3个一组，分别标记为0μg，20μg，40μg，60μg，80μg，100μg。
按照下表中加入各种试剂：1mg/mL BSA –20μl40μl60μl80μl100μl去离子水100μl80μl60μl40μl20μl–考马斯亮蓝G-250 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml （3）混匀后，室温放置5min，在波长595nm 处测定吸光值(A595)，并绘制标准曲线。
5.4.3检测样品蛋白含量（1）取足量的10mL EP管，各管均加入考马斯亮蓝溶液5mL。
（2）取其中一管加入去离子水100ul，混匀放置5min后作为空白对照。
（3）其余各管加入去离子水85uL和待测蛋白样品15ul，混匀后静置5min，于波长595nm处测定吸光值，代入标准曲线中确定待测样品浓度。
5.4.4变性不连续SDS-PAGE（变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）（1）根据厂家说明书正确安装电泳槽，注意两块玻璃板中位置较低的一块应朝向电泳槽的阴极侧，并试插Teflon梳子以确定螺丝的松紧。
（2）参照前面液体配制的方法，先灌制下层10%分离胶10 mL，迅速将分离胶灌入电泳槽两块玻璃板的间隙中直至分离胶顶部距阴极侧玻璃板顶端2.2cm 处，即梳子的齿长+1cm 积层胶+凝胶收缩的长度=2.2cm。
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Workbench使用技巧集锦A nsys Workbench12.0应力线性化过程图文详解1.首先，要进行应力线性化，必须定义适当的路径，classic中通过命令【ppath】进行，这里方法是在model标签上右键插入Construction Geometry，如下图：2.选择后，Outline中出现Construction Geometry选项，在选项上右键插入path，如下图3.插入路径后，显示如下图所示路径的Detail选项卡，黄色区域是对路径的定义区域，目前版本只能定义两点的路径，可已通过选择点、线、面或者坐标的方式定义起、止点【默认的，face模式，则取点为面中心，edge模式，取点为其中点，vertex模式，取点为模型上存在的点，坐标模式，取点为鼠标点击的模型表面任一点，选中的点都可以Detail项中的x，y，z坐标值进行调整】4.定义好的路径如下图所示选择方式按钮这里定义路径参照的坐标系，路径取样点数信息在快捷栏选择一种应力线性化，效果是一样的，如下图所示6.插入应力线性化选项后，出现如下图所示的Detail选项卡，黄色为预选的路径定义好的路径会在这里显示，选择一个作为当前线性化路径选择参与线性化的实体选择应力线性化类型，其实就是重新定义线性化结果时间选项，多载荷步求解使用线性化参照的坐标系，可以选择自己定义的坐标系通过subtype 选择的应力类型都会出现在这里，可以看到，这些结果都是可以参数化的，也就是说，可以继续进行基于线性化应力结果的优化7.线性化的结果示例。
查看最大最小值坐标先点击outline 下的solution 以上的图标(如选择Analysis Settings),这时你会发现在菜单Units 下的图标Coordinate 图标激活,点击之,再按住CTRL,左击Outline 下你要的结果云图,鼠标在应力云图上移动,会出现坐标,至于准不准确,研究完了告诉我.......应力线性化选项，做过的朋友都明白，不详细说了用commmandsnsort,..*get,..nx(..)ny(..)nz(..)在后处理上WB比Classic跟为简单明了，但所能进行的后处理极为有限。
利用commands 我们就可以在simulation里调用Classic后处理。
举例如下在Solution下插入commands,内含如下命令/show,png！设定显示模式/view,,1,1,1！设定视角/rgb,index,100,100,100,0！设定白色背景/rgb,index,0,0,0,15plnsol,eppl,z！给出z轴塑性应变利用ANSYS中逻辑选择，你可以选择应力结果在100-300MPa之间的单元或节点，然后画云图就可以得到你想要的结果了。
nsel,s,s,eqv,100,300这样给出的结果图不能动态显示，所以用/show跟/angle命令确定视点与视角很重要。
关于实体单元的轴力剪力等在ansys经典版本中可以通过surface operation查看应力再积分得出。
在workbench中，其实我们也可以通过建立surface来查看应力并通过对面积分求出来。
下面通过一个简单的例子来说明。
第一步：建一个悬臂梁，梁的尺寸为30*20*200mm，其中一边固定，另一边施加载荷轴向1000N和切向100N。
第二步：运算结束后，首先在需要提取力的面上建立局部坐标系。
（这里通过建立不同位置的局部坐标系则可以查看不同位置的力）第三步：建立surface面。
选中model，则可以在工具栏选constructiongeometry。
再插入surface即可，选择刚才建立的坐标系。
第四步：提取各个应力。
具体操作见图。
第五步：查看应力。
这里提取了x应力及xy应力。
第六步：求解轴力及剪力。
这里我们需要的是应力的average 值。
通过帮助文件可知，workbench 中的平均值是通过积分面再除以面得到的。
所以直接用平均值乘以面就可以得出轴力和剪力。
所以轴力F=1.6667*30*20=1000.02N ；Ft=0.16667*30*20=100.002N 与理论值1000N 及100N 误差很小，因此这里我们提取的力和实际相符。
*10：是指需要提取前10阶模态，也可以在这个命令里面指定频率范围，和振型归一化的方式：质量或位移归一~~~有了ICEM划分好的网格.uns文件，导入到WB进行后续的分析工作；2是在WB 中划分网格时交互调用ICEM，进行网格划分。
静磁场分析（电磁铁电流源）ANSYS WB13WB13静磁场分析（电磁铁电流源）在WB11的DM中有建立线圈的命令，可在WB12、13中没了，在本版未找到做法，经看help及摸索才知需自行建立线圈的3D模型。
以下以多股线圈的电磁铁加载电流源为例，简要说明WB13中静磁场模拟的流程及注意事项。
不足之处还望大家指出。
1.将具有电磁铁、衔铁、线圈的3D模型导入DM并产生空气域（enclosure）2.建立柱坐标并指定为线圈的坐标系（Y 向为电流方向）3.指定边界条件4.加载激励5.求解并查看结果在以往版本中Workbench只能施加随时间变化的荷载，如果要施加随空间变化的荷载，只能借助于commands。
V12在这点上有所改进，虽不是尽善尽美，也算是一个进步。
目前Workbench只支持pressure,line pressure,temperatue和thermal condition这四种荷载进行空间变化，而且只用有一个变量。
下面以pressure为例说明如何定义。
先插入一个Pressure，Defined by必须是normal to改Magnitude为Tabular现在我们可以选择independent variable，这里选x。
并决定荷载在一个自定义的坐标系上起作用但是在这里我们并不能以方程的形式输入。
比如压力分布为cos(pi*x/50),我们只能用几个点来确定这个荷载曲线，点越多也就越精确。
显然这很麻烦。
好在有更方便的选择。
改Magnitude为function现在可以直接输入方程。
但注意，只能有一个变量回车确认后多出几个Graph Control这就是我们得到的荷载如果一个荷载有几个变量而且各自都是线性变换，比如P=x+2y+3z，那就可以分三次施加, P1=x;P2=2y;P3=3z.不然只能回到commands。
除了上面提到的几个荷载外，Displacement也可以用function施加在EXCEL把需要的数据都COPY....然后在WB里的载荷TABLE里....选中第一行第一列的那个单元...右键PASTE就应该可以了....不能全部选中WB里的载荷TABLE....这样操作就会出现LZ所说的那样只复制了三行....目前还不能在Workbench中直接实现子模型分析，但还是可以通过commands来解决。
所需要的命令跟在Classic中一模一样，只不过在几个细节处需要加以注意。
对一个管道的T型连接进行分析。
绿色部分将进行进一步的子模型分析。
在这里为了表达方便，事先把这块给切下再form new part。
在对整体模型进行分析的时候，也可以不把子模型事先分出。
最开始的网格很是粗糙进行计算前，在solution下插入commands，把rst跟db文件拷到上一层目录，子模型分析中将会用到save/copy,'file',rst,,../FullModel,rst/copy,'file',db,,../FullModel,db然后求解，得到结果Duplicate两个分析项目，一个设为全模型，一个设为子模型,然后进行子模型分析。
先把子模型细分网格将所有的切面生成一个NamedSelection。
在这里命名为CutBoundary插入以下命令，具体含义请参考Classic HELP/prep7cmsel,s,CutBoundarynwriteallselSAVEFINISHRESUME,../FullModel,db/POST1FILE,../FullModel,rst*GET,LoadStep,ACTIVE,0,SET,LSTPSET,LoadStep,lastCBDOFFINISHRESUME/SOLU/INPUT,file,cbdo结果比较在这里的边界条件是整体模型映射到切面上的结果，用CBDOF施加。
只能用commands。
以下是简单的小结：1.子模型分析可以在实际工程中有效地节约计算时间。
2.在全模型网格划分时需谨慎，在减少网格节约计算时间的同时，还需要保证网格精度以保证结果的正确性。
3.子模型切分时，若切分在应力梯度较大区域，会对结果造成一定影响，应尽量避开（圣维南大哥永远活在我们心中）。
图标的。
而是其他CAD软件的图标。
如果经过了DM的编辑，则需要在DM中ATTACH的detail中设置refresh为on。