高效液相色谱定性定量分析方法+++
高效液相色谱法
答：气相温度对于样品的气化程度影响很大,一般来说温度越高,气化越快,通过色谱柱时间也越短,气相单一物质分析一般用恒温,多种物质分析时,通过改变柱温能够很好的对样品进行分离,节省了分析时间,这时往往用梯度升温。
3、若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什么？
答：能，浓度对峰面积更优越。因为有些峰不完全对称，用它作标准曲线误差较大。
4、在样品干过滤时，为什么要弃去前过滤液？这样做会不会影响实验结果？为什么？
答： 干过滤主要是保持溶液浓度不变而采取的一种过滤方法，前液中可能有一些滤纸或滤膜上的杂质存在，为了保持溶液浓度不变，所以要将前液去掉。干过滤为分离掉溶液中的固体并且不改变溶液浓度而采取的一种方法。为保持溶液浓度不变。前段滤液要弃去，并且滤纸漏斗盛接的烧杯都要干的。这样做不会影响实验结果。
液相并不是都是室温,一般来说,温度对于反相色谱分析影响不大,所以用反相柱分析时,一般用室温,不配备柱温箱,但是很多正相色谱分析时对于温度要求比较严格,比如说配位体交换色谱法时,温度的影响还是很大的。
5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
6、10μL平头微量注射器。
四、实验内容
1、标准贮备液配制质量浓度分别为20、40、80、160μg·mL-1的标准系列溶液。（1mL，2mL，4mL，8mL稀释为50mL）
2、谱仪器条件：
泵的流速：1.0mL/min；检测波长：275nm；进样量：4μL；柱温：室温。
定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间tR和峰面积A后，可直接用tR定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。
hplc检测方法
hplc检测方法HPLC检测方法高效液相色谱(HPLC)是一种广泛应用于化学、制药、食品、环境等领域的分析技术。
HPLC检测方法能够对样品中的化合物进行定量和定性分析，具有灵敏度高、分离效果好、选择性强等优点。
下面将介绍HPLC检测方法的原理、步骤、注意事项等方面的内容。
一、原理HPLC检测方法的原理是利用不同化合物的物理化学性质，如分子量、极性、亲水性、亲油性等，在高压力下通过固定在柱子中的固定相进行分离。
样品成分通过柱子后，会在检测器中产生信号，根据不同成分的信号大小进行定量分析。
二、步骤HPLC检测方法的步骤主要包括：样品制备、柱子选择、流动相配置、样品进样、分离、检测等。
1. 样品制备：样品制备是HPLC检测方法的第一步。
样品制备的目的是将复杂的样品进行简化，使其易于分离和检测。
常用的样品制备方法包括提取、纯化、水解、酸解等。
2. 柱子选择：柱子是HPLC检测方法中最重要的部分之一。
柱子的选择应根据不同样品的性质和分离要求进行选择。
常见的柱子类型有反相柱、离子交换柱、凝胶柱等。
3. 流动相配置：流动相是HPLC检测方法中的另一个重要组成部分。
流动相的选择应根据不同样品的性质和柱子类型进行选择。
常用的流动相包括水、有机溶剂、缓冲液等。
4. 样品进样：样品进样是HPLC检测方法中的关键步骤之一。
样品进入柱子前必须经过进样器。
进样器的选择应根据不同样品的性质和进样量进行选择。
5. 分离：分离是HPLC检测方法中最核心的部分之一。
分离的目的是将样品中的成分分离出来。
分离过程中，样品成分会根据不同的化学性质在柱子中进行分离。
6. 检测：检测是HPLC检测方法中的最后一步。
检测器会对柱子中流过的各个成分进行检测，根据不同成分的信号大小进行定量分析。
三、注意事项在进行HPLC检测方法时，需要注意以下几点：1. 样品应尽可能纯净，避免杂质的干扰。
2. 流动相的选择应准确，避免对柱子产生损害。
3. 进样量应适当，过多或过少都会影响检测结果。
高效液相色谱法3
2.内标法 内标法分为 工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法 校正因子法 在HPLC中最常用内标对比法。 选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时 间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择 一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作 为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。 使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原 因带来的实验误差。
(一) 多环芳烃的分析 一 多环芳烃的分析(图21－18) 多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反 相色谱法用ODS柱，用乙腈−水或甲醇−水为流动相。但用 甲醇−水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环 芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相， 也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与 流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监 测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。
(1)内标对比法： 这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确 度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分 析结果(含量)常用标示量％表示:
( Ai / As )样品 (ms )样品 W 标示量% = × × ×100% ( Ai / As )对照 (ms )对照 m
(21.13)
式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液 中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符 号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物 的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后 二项均等于1。
A的标示量％=(178024／202694)÷(154856／171222)×100％=97.l％ P的标示量％=(820968／202694) ÷(692272／171222)×100％=100.l％ C的标示量％=(407792／202694) ÷(372221／171222)×100％=92.5％
210988827_高效液相色谱串联质谱法测定水果、蔬菜中双胍辛胺的定性定量分析研究
分析检测高效液相色谱串联质谱法测定水果、蔬菜中双胍辛胺的定性定量分析研究尹丽丽（上海华测品标检测技术服务有限公司，上海 201112）摘 要：目的：建立水果和蔬菜中双胍辛胺的高效液相色谱串联质谱法的定性定量分析方法。
方法：样品经过正丁醇∶正己烷=1∶1混合溶液提取，再用酸化水净化。
以高效液相色谱质谱联用仪检测萃取液中的双胍辛胺的含量，采用HILIC-C18柱分离，在ESI正离子模式下，以质谱多反应监测，采用外标法进行定量分析。
结果：在10～500 ng·mL-1，双胍辛胺的线性良好，相关系数R＞0.995，检出限为0.002 0 mg·kg-1，定量限为0.011 mg·kg-1，双胍辛胺在3个浓度添加水平下，水果回收率在92.7%～108.9%，蔬菜回收率在96.2%～110.0%，水果相对标准偏差为1.15%～4.45%，蔬菜相对标准偏差为1.36%～2.15%。
结论：本研究建立的高效液相色谱串联质谱法测定双胍辛胺的方法准确、快速，能够满足水果、蔬菜中双胍辛胺的分析要求。
关键词：双胍辛胺；高效液相色谱串联质谱；水果；蔬菜Determination of Iminoctadine in Fruits and Vegetables by High Performance Liquid Chromatography-Tandem MassSpectrometryYIN Lili(Shanghai Huabiao Testing Technology Service Co., Ltd., Shanghai 201112, China) Abstract: Objective: A method was developed for the determination of iminoctadine of fruits and vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Method: The sample was extracted with the solution of butyl alcohol and hexane (1∶1), and then cleaned-up by acidified water. Iminoctadine was determined by liquid chromatography mass spectrometer with a HILIC chromatographic column, analyzed in positive electronic spayionization (ESI+) mode with multiple reaction monitoring, and quantified by the external standart method. Result: The calibration curves were linear with the correlation coefficients over 0.995 in the range of 10～500 ng·mL-1 for iminoctadine. The limits of detection were 0.002 0 mg·kg-1. The limits of quantification were 0.011 mg·kg-1. The mean recoveries of iminoctadine at three spiked levels were in the range from 92.7% to 108.9% of fruits and 96.2%～110.0% of vegetables, with the relative standard deviations were in the range from 1.15%～4.45% of fruits and 1.36%～2.15% of vegetables. Conclusion: Determination of iminoctadine in fruits and vegetables by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established in this study which was accurate and rapid, suitable for analysis of iminoctadine in fruits and vegetables.Keywords: iminoctadine; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; fruits; vegetables双胍辛胺是一种广谱性杀真菌剂，对某些病原真菌有很高的生长抑制活性，其作用方式是抑制病菌类脂的生物合成，是触杀和预防性杀菌剂，对大多数由子囊菌和半知菌引起的真菌病害有很好的效果[1]。
色谱定性定量分析方法
⑥稳定性（stability）：
意义： 考察分析样品与试剂在一定时间内稳定性。 内容：
根据样品与试剂测定时实际可能所处的环 境进行考察。
⑦耐用性（ robustness ）：
意义： 考察测定条件发生小变动时测定结果的变化。
内容：
流动相的组成和pH、商品柱的品牌尺寸、 柱温等
广泛用于药物中的杂质、体内外代谢产物的结构鉴定
重现性: 不同实验室，不同人测定的精密度 1、色谱信号的测量:
意义： 待测物浓度与响应值成线性关系的浓度范围；
相对保留值 α, (t-t0)/(tr -t0）
2、选择合适的离子源，利用LC-MS获得杂质的准分量不同浓度的对照品，比较测定值和加入值确定。
ELSD响应的自然对数与样品的浓度或质量呈线 性关系；
质谱（MS-ESI）检测器高浓度时的响应与样品 的质量可能呈二次或更复杂的方式。
四、色谱分析方法验证
目的：
证明所采用的色谱分析方法适合于相应的检验 要求，判断能否用于药品分析。
效能指标：评价分析方法的尺度
效能指标包括: 精密度、准确度、专属性、检测限、定量限、
tr
内容： LC-ESI-MS的
要求，判断能否用于药品分析。 内容： 药物制剂含量测定时的专属性考察内容：
重复性 广药泛品用 质于量药标物准中分的析杂方质法:、验体证内外代同谢产一物的实结构验鉴定室,同一人多次测定的精密度
中间精密度 2药、品选质择量合标适准的分离析子方源法，验利证用LC:-MS同获得一杂质实的准验分子室离子，峰。不同人，不同仪器测定的精密度
线性与范围、耐用性、稳定性、系统适用性等
不同分析测定方法的要求
药品质量标准分析方法验证 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
4．进样阀从装载转向进样位，同时按进样按扭，工作站 开始记录并出图11。 5．苯甲酸的色谱峰出完后，按照4-5步骤连续操作四次， 获得从最低浓度到最高浓度的标准试液的五张色谱图，分 别为11，12，13，14，15（15为流动相进样，设浓度为0 mg/ml）。 6．按照4-5步骤取25微升的未知样品，进样，出谱图W1。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱测定原理
高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析方法，它基于样品在液相中的分配
行为以及在固定相上的吸附和解吸行为。
它能够对样品中的物质进行分离、定量和定性分析。
高效液相色谱的原理如下：
1. 选择性分离：高效液相色谱中，样品混合物被注入装有固定相（柱填充物）的色谱柱中。
不同物质在柱填充物上的吸附和解吸速度不同，因此可以通过调整流动相的组成、温度和流速等参数来实现对样品中物质的选择性分离。
2. 吸附-解吸过程：在高效液相色谱中，样品溶解于流动相中，与固定相表面发生相互作用。
这个过程涉及吸附和解吸，吸附过程发生在固定相表面，解吸过程发生在固定相表面和流动相中物质的分配行为。
通过控制流动相的性质和柱填充物的特性，可以实现对不同物质的选择性吸附和解吸。
3. 柱填充物：高效液相色谱柱的填充物通常是多孔性固体颗粒，如硅胶或石英。
填充物的选择与样品的性质和分离的目的有关。
柱填充物的粒径、孔径和表面性质将影响色谱分离的效果。
4. 检测器：高效液相色谱的结果通过检测器进行检测和记录。
常见的检测器包括紫外可见光检测器、荧光检测器、电化学检测器等，根据待分析物的性质和浓度选择适当的检测器。
总之，高效液相色谱是利用样品在液相中的分配和在固定相上的吸附解吸过程进行分离和定量分析的方法。
通过调整柱填充物、流动相和检测器等参数，可以实现对样品中不同物质的选择性分离和定量测定。
高效液相色谱法定性定量分析
高效液相色谱法测定萘乙酸的含量一、实验目的1、学习高效液相色谱仪的操作。
2、了解高效液相色谱法测定萘乙酸的基本原理。
3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。
二、实验原理将已配制的浓度不同的萘乙酸标准溶液进入色谱系统。
如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R和峰高A后，可直接用t R定性，用峰面积A作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定未知浓度萘乙酸的含量。
三、仪器和试剂1、Agilent 1100高效液相色谱仪。
2、色谱柱：Zorbax C8，5µm，250×4.6mm，20μL定样环。
3、流动相：H2O和CH3OH4、萘乙酸标准溶液：精密称取萘乙酸标准品制成浓度(mg/L)分别为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、2、5、8、10、15、20 mg/L的对照品溶液，放入冰箱备用。
5、未知物萘乙酸6、平头微量注射器。
四、实验步骤1、开机(1) 检查流动相、废液瓶和色谱柱；(2) 打开打印机和计算机的电源；(3) 自上而下打开个组件电源，Bootp Server里显示有信号时（有六行字符）；(4) 打开工作站。
2、编辑方法(1) 选择“Method”菜单，然后“EDIT METHOD”依屏幕提示进入以下设定：(a）泵对话框：设定泵的流速：1.0mL/min；H2O和CH3OH线性梯度洗脱：H2O 0 min：10%；1 min：20%；3 min：30%；4 min：30%；(b）检测器对话框：设定波长337 nm。
(2) 单击“Method”菜单，选中“Save Method As…”，输入方法名，单击OK。
(3) 从“Run Control”菜单中选择“Sample Info…”选项，输入操作者名称，在“Data file”中选择“Manual”或“Prefix”。
(4) 单击Ok，等仪器Ready，基线平稳。
仪器分析实验的课后习题答案及讨论
高效液相色谱1．高效液相色谱法的特点特点：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量准确度高，应用围广。
适用于分析高沸点、大分子、强极性、热不稳定有机及生化试样的高效别离分析方法。
2.高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点：(1)进样方式的不同：高效液相色谱只要将样品制成溶液，而气相色谱需加热气化或裂解；(2)流动相不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力；(3)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4~5个数量级；(4)由于流动相的化学成分可进展广泛选择，并可配置成二元或多元体系，满足梯度洗脱的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率〔柱效能〕；(5)高效液相色谱采用5~10Lm细颗粒固定相，使流体相在色谱柱上渗透性大大缩小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相；(6)高效液相色谱是在液相中进展，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、荧光光度检测器等。
3.高效液相色谱的定性和定量分析的方法定性：〔1〕利用纯物质定性的方法利用保存值定性：通过比照试样中具有与纯物质一样保存值的色谱峰，来确定试样中是否含有该物质及在色谱图中位置。
不适用于不同仪器上获得的数据之间的比照。
利用参加法定性：将纯物质参加到试样中，观察各组分色谱峰的相对变化。
〔2〕利用文献保存值定性相对保存值r21：相对保存值r21仅与柱温和固定液性质有关。
在色谱手册中都列有各种物质在不同固定液上的保存数据，可以用来进展定性鉴定。
定量：有归一法、标法、外标法在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、标法或外标法等，但高效液相色谱在别离复杂组分式样时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而标法定量则被广泛使用。
4．高效液相色谱实验时，选择流动相时应注意的几个问题〔1〕尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
高效液相色谱定性定量分析方法
1
134.2
220.2
0 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 350 375 400 425 450 475 500 Counts vs. Mass-to-Charge (m/ z)
由分子量及其 质谱图可以确 定该代谢物为 乙酰化氨脒
定性分析—两谱联用定性
定性分析—其他方法
1 收集洗脱物后进行定性分析
` 收集色谱分离后的每一个分离组分 ` 对所得组分分别进行仪器、化学分析或其他物理
参数（如熔点、沸点、折光、旋光等）测定
定性分析—其他方法
收集组分时应注意
` 某些情形，如色谱分析，宜采用非破坏性检测器，电化 学检测器不可；
` 如使用破坏性检测器，则须在检测器前分流，使分离后 的一小部分组分进入检测器
` 可根据文献数据和对照品选用已知标准物 ，再用已知标准物进行定性
定性分析—保留值定性
3 利用已知物增加峰高法定性
将已知标准物质加到待测样品，若某一峰 增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使 该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物 为同一物质
定性分析—保留值定性
4 用三维图谱检测器定性
` 如果HPLC仪配备有三维图谱检测器，除比较未 知组分与已知标准物保留时间外，还可比较两 峰的立体构形
条件下应该有相同的保留值； 但相反结论却不成立，即相同色谱条件下
，具有相同保留值的两个物质不一定是同一 个物质。尚需一些辅助技术 ` 利用两谱联用定性；
其他方法定性
定性分析—保留值定性
1 已知物保留值直接对照法定性
` 未知峰保留值(t’R或V’R)与某标准物完全 相同，可初步确定为同一物质
` 改变色谱柱或流动相组成，二者保留值仍 完全相同，则可认定为同一物质
液相色谱法
2、液相色谱能完成难度较高的分离工作 ①气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡 过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互 作用。 而在液相色谱中流动相液体也与固定相争夺样品分子， 为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种 或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。 ②液相色谱固定相类型多，如离子交换色谱和排阻色谱等， 作为分析时选择余地大；而气相色谱是不可能的。 ③液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般有利于 色谱分离条件的选择。
反相键合相色谱法 在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶C18H37（简称O D S或C18），硅胶-苯基等。 用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和 无机盐的缓冲液等。 目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大 致有两种观点： ① 一种认为属于分配色谱; ② 另一种认为属于吸附色谱。
三、梯度洗脱装置
在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定 程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性 、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分 析时间的目的。
梯度洗脱装置分为两类： 一类是外梯度装置又称低压梯度，流动相在常温常压 下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。 一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分 别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室 混合，再输至柱系统。
四、化学键合相色谱 通过化学反应把各种不同的有机基团键合到硅胶表面的游离羟 基上，代替机械涂渍的液体固定相。 ① 避免了液体固定相流失； ② 改善了固定相的功能，提高了分离的选择性； ③ 化学键合色谱适用于分离几乎所有类型的化合物。 根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，分为极性和非极 性键合相色谱。 在极性键合相色谱中，由于流动相的极性比固定相极性要小， 所以极性键合相色谱属于正相色谱。 流动相的极性比固定相极性强的键合相，既可作为正相色谱， 也可作为反相色谱。
高效液相色谱定性定量分析方法
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器 响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
诚信
奉献
改善
利他
为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
• Ci=fiAi • Ci=fiHi
• 实际修饰公式为：y=ax+b
诚信
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为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
定量分析方法
诚信
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面积归一化法
不能作为准确定量的方法、仅在特殊情况下使用
• •
公式： 特点：
C%
Ai Ai
100%
– 各组分要全部流出、全部被检测，要求所有响 应因子相当
– 进样量不要求严格
– 不需标样
– 无需做校正、简单、快速
诚信
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利他
为/客/户/生/产/满/意/商/品 为/社/会/培/养/有/益/人/才
内标法
• 选择适宜的物质作为欲测组分的参比物， 定量加到样品中去，依据欲测组分和参比 物在检测器上的响应值（峰面积或峰高） 之比和参比物加入的量进行定量分析的方 法。
• 内标法与标准曲线法相比，有利于消除色 谱条件不完全重现、进样量不准确等所带 来的误差。
18章高效液相色谱法
六、反相离子对色谱法
把离子对试剂加入到含水流动相中，被分析组分离 子在流动相中与离子对试剂的反离子（或是称对离子） 生成不带电荷的中性离子对，从而增加溶质与非极性固 定相的作用，使分配系数增加，改善分离效果， 适用于分离可离子化或离子型的化合物。 1、离子对模型
试样离子在流动相中与离子对试剂离解出的反离子 生成不荷电的中性离子对，然后在非极性固定相上产生 保留。
第四节 高效液相色谱分析方法
一、定性和定量分析方法
1、定性方法分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法。 2、定量方法常用外标法和内标法进行。 3、主成分自身对照法：
不加校正因子主成分自身对照法： 加校正因子主成分自身对照法： 二、高效液相色谱分离方法的选择 分离模式选择主要依据试样的性质和各种模式的分离 机制。试样的性质包括相对分子量、化学结构、极性和溶 解度等。
（1）化学稳定性好,使用过程中不流失,柱寿命长;
（2）均一性和重现性好;
（3）柱效高,分离选择性好;
（4）适于梯度洗脱;
（5）载样量大. 3、使用注意事项： （1）使用硅胶基质的键合相pH应维持在2-8;硅-碳杂化 硅胶等为基质的键合相pH范围宽（2-12）；
（2）不同厂家，不同批号的同类键合相也可表现不同 的色谱特性。
（3）极性键合相：常用氨基、氰基键合相。是分别 将氨丙硅烷基和氰乙硅烷基键合在硅胶是制成。一般用 作正相色谱固定相。 氰基键合相。对双键或含双键的环状化合物有较好 的分离能力。 氨基键合相对糖类化合物的分离选择性好。在酸性 介质中它是一种弱阴离子交换剂，能分离核酸。不宜分 离带羰基的物质
2、键合相的特点
高效液相色谱法的检测器要求：灵敏度高、噪声 低、线性范围宽、重复性好和适用范围广。
1、紫外检测器简介： 灵敏度较高、噪声低、线性范围宽，对流速 和温度的波动不灵敏，还适用于制备色谱。 工作原理：是朗伯比尔定律，即组分的浓度与吸 光度成正比。 2、紫外检测器分类：
液相色谱法
10.3 各类高效液相色谱法>>
10.3.3 化学键合色谱法>>3.离子对色谱法
离子对色谱(ion pair chormatography，IPC) 在流动相中加入与被测离子相反电荷的离子对试剂， 使之形成中性的离子对化合物，从而增加样品离子 在非极性固定相中的溶解度，使分配系数增加，分 离改善。分配系数的大小主要取决于离子对化合物 的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。 ⑴ 常用离子对试剂 分离碱类：用烷基磺酸盐为离子对试剂。如十二烷 基磺酸钠，正戊/己/庚/辛磺酸钠(PIC-B5/6/7/8)等。 分离酸类：用四丁基季铵盐(PIC-A) ，如四丁基胺 磷酸盐(TBA)等。
1
10.3 各类高效液相色谱法
10.3.1 吸附色谱法(LSC) 10.3.2 分配色谱法(LLC) 10.3.3 化学键合色谱法(BPC) 10.3.4 其他色谱法
10.3 各类高效液相色谱法>>
10.3.1 吸附色谱法 LSC
1. 分离机理 吸附色谱法是被分离的组分分子(溶质 分子)与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心，因 溶质分子的吸附系数的差别而分离。 2. 影响容量因子(k)的因素 以硅胶吸附剂为例： ⑴ 硅胶与溶质分子的亲和力顺序：k大者后出峰。 kmin→饱和烃＜芳烃＜…＜酯醛酮＜…＜羧酸→kmax ⑵ 溶质的极性：常用流动相是以烷烃为底剂，加入适 当的极性溶剂组成二元或多元溶剂系统，从而能调 整溶解的极性，控制组分的保留时间。溶剂系统的 极性越大，洗脱力越强。
十八烷基硅烷 O 键合相ODS
+
10.3 各类高效液相色谱法>>
10.3.3 化学键合色谱法
1. 2. 3. 4. 5. 反相键合相色谱法，RBPC 正相键合色谱法， NBPC 离子对色谱法，IPC or. PIC 离子抑制色谱法，ISC 其他色谱法
高效液相色谱定性定量分析方法==
吸光度（ Absorbance UV/Vis）检测 • 目前实验室中最流行的选择 ▫ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA） • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
吸光度检测器（ UV/Vis）－ 优点 • 这种检测器简单、可靠 • 多数人熟悉并喜欢这种技术 • 可以作梯度实验并且是非破坏性的 • 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 • 一般来说灵敏度还可以
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的
泵的保养： • • • • • 使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污 染；
柱的保养： • • • • • • • • • 柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
• 试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
分析实验报告 高效液相色谱
华南师范大学实验报告学生姓名：杨秀琼学号：20082401129专业：化学年级班级：08化二课程名称：仪器分析实验实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯实验类型：综合实验时间：2010/416一、[实验目的:]1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术二、[实验原理:]高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。
它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。
具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。
其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、[仪器和试剂:]1.主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测PhenomenexO柱]；10μL微量注射器2、试剂：甲醇、水苯和甲苯混合待测溶液苯标准溶液：2.0μL/mL甲苯标准溶液：2.0μL/mL苯、甲苯混合标准溶液：1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL、10.0μL/mL 四、[实验步骤]1、按操作规程开机。
2、.选择合适的流动相配比，优化色谱条件通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。
调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min 。
柱温30℃，检测波长354nm 3、苯、甲苯定性分析在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL 微量注射器分别进样10μL 苯和 甲 苯混合待测溶液，10μL 苯标准溶液（2.0μL/mL）和10μL 甲苯标准溶液（2.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。
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RS变化值 1.6
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
水： 去离子水 纯净水 自动纯水仪 商品瓶装水
溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
试剂:
分析纯
• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
图1；好的梯度系统
图2；一般的二元梯度系统
图3；一般的四元梯度系统
五个小肽的5ng进样，好的色谱系统非常容易鉴别出所有 峰。在不好的色谱系统中，第一个峰则消失在基线噪音中。
1.183
Caffeine @ 271 nm
1.183
1.224
线路过滤器
单向阀 柱塞密封圈 进样器
检测器
吸滤头
1.50 1.40 1.30 1.20 1.10 1.00 0.90 0.80 AU 0.70
UV Spectrum of Eluents with 0.1% TFA Against HPLC Grade H2O Blank
H20 with 0.1% TFA 50% ACN with 0.1% TFA
固定相。
色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适
的溶剂进行洗净。
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
对样品有响应并有一个输出信号 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并 且所设计的校正技术应该促进这种关系
（ 4 ）强烈滞留的组分不容易残留在
柱上, 保持柱性能长期良好； （ 5 ）下次分析时 , 流动相需要一段 平衡时间；不同溶剂的 UV吸收程度稍 有差异, 可能会引起基线漂移
① A 流动相/弱溶剂组成； ② B 流动相/强溶剂组成； ③ 梯度时间；
强溶剂 A%
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
N
目前实验室中最流行的选择 ◦ 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是多 波长，25%是PDA） 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 吸光度与样品浓度呈线性关系 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
这种检测器简单、可靠 多数人熟悉并喜欢这种技术 可以作梯度实验并且是非破坏性的 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 一般来说灵敏度还可以
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成 后，马上关闭检测器。 样品池要保养
谢谢！
今天用的图片都为 摄影协会 王诏同学所拍摄
吸滤头－－定期清洗，更换溶剂时 单向阀－－定期清洗，压力波动大时 泵－－自动清洗 在线过滤器－压力大时清洗
吸滤头
材料：不锈钢烧结，孔径10um
故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成
措施：用5％稀硝酸，超声波清洗，
再用蒸馏水清洗
单向阀
故障：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好
表现：系统压力波动大
措施：
固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线
保留时间
液相色谱的色谱柱
色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的
使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污 染；
柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气； 避免使用高粘度的溶剂作为流动相； 进样样品要提纯； 严格控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱； 若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭；
打开排液阀，以异丙醇为流动相输液 拆下单向阀，放入异丙醇中，超声波清洗
线路过滤器
故障：堵塞
线路过滤器
现象：系统压力波动大或压力 偏高
压力传感器
措施：5％稀硝酸，超声波清洗
判断依据：关闭排液阀，断开出 口管路，设定流速1mL/min， 如压力>3kgf/cm2，则堵塞。
排液阀 流动相
柱内 体积 (Vm)
0.10 mL 0.06 mL 0.03 mL
平衡时间 流速 0.2 mL/min
5 min 3 min 1.5 min
1.0mL/min
60 sec 36 sec 18 sec
单次样品运行时间 = 分析时间 + 色谱柱平衡时间 色谱柱平衡时间 = 10倍柱内体积 ÷ 流速
色谱柱清洗保存
5 2 1
3
2
1
低压梯度 ◦ 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 ◦ 对脱气要求高
◦ 不易调节梯度的滞后体积
如设计不当，梯度的 准确性受影响 ◦ 滞后体积（系统 体积）设计合理
低 压 梯 度
A
B D
C
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
色谱柱 进样器 检测器
比例阀
滞后(系统)体积 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 滞后(系统)体积 高 压 梯 度
检测器 柱温箱 流动相 脱气装置 样品盘
控温箱
四元
泵
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源， 待设备通过自检后，打开计算机启动
色谱管理软件
准备流动相 过滤，脱气 色谱泵排气 用新配制的流动相灌注泵
◦ 输液系统 ◦ 进样系统 ◦ 分离系统
◦ 检测系统
◦ 数据记录处理系统
液相色谱流程图
HPLC色谱柱 溶剂 自动进样器 色谱泵 检测器 废液
数据处理系统
色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um 流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
pH变化值 0.1
2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形
3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
选用适宜的容器
（1）改善分离, 加快分析速度； （ 2 ）改善峰形 , 减少拖尾 , 有利于 痕量组分的检测； （3）增加峰容量；
溶剂输送 系统(泵)
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
色谱柱
进样器
溶剂输送 系统(泵)
梯度混合器
检测器
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟
◦ 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min
实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 ◦ 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受
滞后体积的不同会使方法转换麻烦 ◦ 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 ◦ 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好
普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性
色谱柱 尺寸 (mm)
4.6 x 50 4.6 x 30 4.6 x 15 4.6 x 150
柱内 体积 (Vm)
0.5 mL 0.3 mL 0.15 mL 1.54 mL
平衡时间 流速 1.0 mL/min
5 min 3 min 1.5 min 15 min
色谱柱 尺寸 (mm)
2.1 x 50 2.1 x 30 2.1 x 15
Parabens at 254 nm
0.15
0.10 AU 0.05 0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
Minutes
3.50
4.00
4.50
5.00
5.50
6.00
由于不是所有化合物都有吸光度，因此不是通用检测器 对某些化合物的检测灵敏度不及其他检测器 样品中不同化合物的最大吸收波长不同时，需要使用多波 长检测，或使用折衷的波长 受流动相组成的影响： ◦ 用截止波长以上至少5～10nm作为工作波长 ◦ 缓冲盐、离子对试剂、胺改性剂也会有影响
高灵敏度；可忽略的基线噪音 宽的线性范围 独立于流动相及操作参数的响应 ◦ 对压力、温度及流速等变化不敏感 长时间操作的稳定性 低死体积 非破坏性 选择性
灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值 （S/N） 6:1 检测限（LOD）：S/N = 2~4 定量限（LOQ）：S/N = 8~10 好的信噪比有利于： ◦ 更好的色谱峰确认 S ◦ 更好的定量 ◦ 更好地完成色谱峰纯度/均一性
•
理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um
的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是 使用无机盐配制的缓冲液。