保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的测定(NO2)

保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的
测定
一、概述
•1．盐酸硫胺素
•盐酸硫胺素( thiamine，vitamin B1)也叫维生素
B1，主要用于防治缺乏维生素B1所致的脚气病，也用于神经炎、心肌炎、消化不良辅助治疗。

甲状腺机能亢进患者，妊娠或高热患者，可适当补充维生素B1，以改善症状
•本品还具有维持心脏、神经及消化系统的正常功能，促进碳水化合物在人体内的代谢作用，谷物是盐酸硫胺素主要来源，杂粮、豆类、干酵母、硬果、动物内脏、蛋类、瘦肉也含有较多盐酸硫胺素
一、概述
•盐酸硫胺素的化学式为C
12H17ClN4OS·HCl，相对分子质
量为337.27，化学名称为氯化4-甲基-3-[（2-甲基-4-氨基-5-嘧啶基）甲基]-5-(2-羟基乙基)噻唑鎓盐酸盐，CA名称及编号为4-methyl-3-[(2-methyl-4-amino-5-pyrrmidinyl) methyl]-5-( 2-hydroxyethyl) thiazolium chloride，67-03-8，结构式如下
盐酸硫胺素为白色结晶或结晶性粉末，有微弱的特殊臭味，味苦，干燥品在空气中迅即吸收约4%的水分。

在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。

气味似酵母，在酸性溶液
中比较稳定，加热不易分解。

但在碱性溶液中极不稳定，
紫外线可使其降解而失活，铜离子可加快它的破坏
一、概述
•盐酸硫胺素过量中毒事件很少见，超过推荐摄入量( RNI) 100倍以上的剂量有可能出现头痛、惊厥、心律失常等。

•盐酸硫胺素与碳水化合物代谢密切相关，其供给量与机体能量总摄入量成正比
中国居民维生素B1推荐摄入量(RNI)
年龄/
岁
男性/( mg/d) 女性/(mg/d) 年龄/
岁
男性/(
mg/d)
女性
/(mg/d) 0～0.2适宜摄入量
(AI)
0.2适宜摄入量
( AI)
11～ 1.2 1.2
0.5～0.3适宜摄入量
(AI)
0.3适宜摄入量
(AI)
14～ 1.5 1.2
1～0.6 0.6 18～ 1.4 1.3
4～0.7 0.7 孕妇- 1.5
7～0.9 0.9 乳母- 1.8
盐酸硫胺素的可耐受最高摄入量(UL)为50 mg/d。

一、概述
•2．盐酸吡哆醇
•盐酸吡哆醇( vitamin B
6，pyridoxine)也叫维生素B
6
、吡
哆辛。

维生素B
6包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺，三者可
互相转化，具体结构式如下：
吡多醇吡多醛吡多胺
一、概述
•盐酸吡哆醇在体内与三磷酸腺苷( ATP)经酶作用生成具有生理活性的磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺。

它是某些氨基酸的氨基转移酶、脱羧酶及消旋酶的辅酶，参与许多代谢过程，如脑中抑制性递质γ-氨基丁酸是由谷氨酸脱羧产生，色氨酸转化为烟酸亦需维生素Bs参与。

此外，磷酸吡哆醛可参与亚油酸转变为花生四烯酸过程
•动物缺乏维生素B6时可能会有动脉粥样硬化病变。

盐酸吡哆醇临床上用于：①防治因大量或长期服用异烟肼、肼屈嗪等引起的周围神经炎、失眠、不安；减轻抗癌药和放射治疗引起恶心、呕吐或妊娠呕吐等。

②治疗婴儿惊厥或给孕妇服用以预防婴儿惊厥。

③白细胞减少症。

④局部涂搽治疗痤疮、酒糟鼻、脂溢性湿疹等。

盐酸吡哆醇广泛存在于各种食物中，其含量最高的食物为白色肉类，其次为肝脏、豆类、坚果类等，水果和蔬菜中的含量也较多
一、概述
•盐酸毗哆醇的化学式为C
8 H11NO3·HC1，相对分子质量
为205.64，化学名称为6-甲基-5-羟基-3,4-吡啶二甲醇盐酸盐，CA名称及编号为6-methyl-5-hydroxy-3，4-
pyridinedimethanol chloride，58-56-0，结构式如下：
盐酸吡哆醇为白色结晶性粉末，无臭，味酸苦。

易溶于水，微溶于乙醇，在三氯甲烷或乙醚中不溶。

高温、碱性溶液中和遇光均易破坏。

熔点205℃～209℃，熔融时同时分解
一、概述
•从食物中获取过量的盐酸吡哆醇没有毒副作用，而通过补充品长期给予大剂量盐酸吡哆醇(500 mg/d)会引起严重毒副作用，主要表现为神经毒性和光敏感反应。

牛以
5 mg/kg剂量给药，曾发生体重减轻和肝损害而致死亡•可耐受最高摄人量(UL)：儿童50 mg，成人100 mg
中国居民维生素B
6
推荐摄入量(RNI)
年龄/岁RNI/( mg/d) 年龄/岁RNI/(mg/d)
0～0.1 14～ 1.1
0.5～0.3 18～ 1.2
1～0.5 50～ 1.5
4～0.6 孕妇 1.9
7～0.7 乳母 1.9
11～0.9
一、概述
•3．烟酸
•烟酸（nlacln，nicotinic acid）又称尼古丁酸、尼克酸，维生素PP。

烟酸在组织呼吸过程中，作为催化重要的氧化还原反应的多种酶中的辅酶发挥作用。

它可以成为基质脱下来的氧离子的受体被还原，然后经黄素蛋白的作用被再氧化，恢复到原来的状态。

烟酸具有扩张血管、降低血脂、减少胆固醇合成，溶解纤维蛋白，防止血栓形成的作用
•烟酸广泛存在于动植物食物中，主要为动物性食物，尤其在动物内脏中含量较高。

在全谷、种子、豆类中也含有丰富的烟酸
一、概述
•烟酸是具有烟酸生物学活性的吡啶-3-羧酸衍生物的总称，基本结构为吡啶-3-羧酸。

化学式为C
6
H5NO2，相对分子质量为123.11，化学名称为吡啶-3-羧酸，CA名称及编
号为pyridine-3-carboxylic acid，59-67-6，结构式如下
烟酸为白色结晶或结晶性粉末，无臭或有微臭，味微酸，
水溶液显酸性反应。

在沸水或沸乙醇中溶解，在水中略溶，在乙醇中微溶，在乙醚中几乎不溶；在碳酸钠溶液或氢氧
化钠溶液中均易溶。

熔点234℃～238℃
一、概述
•目前，尚没有食用烟酸过量引起中毒的报道，烟酸毒性报道主要见于临床采用大剂量烟酸治疗高血脂症病人所出现的副反应
其副作用主要表现为皮肤潮红、眼部不适、恶心、呕吐，甚至出现黄疸、转氨酶升高等肝功能异常以及葡萄糖耐量的变化。

大鼠烟酸经口毒性半数致死数是(LD50)为7g/kg，大鼠烟酸皮下注射LD
50
为5 g/kg
•可耐受最高摄入量(UL)：儿童50 mg，成人100 mg
一、概述
中国居民烟酸推荐摄入量(RNI)
年龄/
岁男性/(mg/d)
女性/(
mg/d)
年龄/
岁
男性
/(mg/d)
女性
/(mg/d) 0～
2[适宜摄人
量(AI)]
2[适宜摄人
量(AI)] 11～12 12
0.5～
3[适宜摄入
量(AI)]
3[适宜摄入
量(AI)] 14～15 12
1~ 6 6 18～14 13
4～7 7 孕妇- 15
7～9 9 乳母- 18
一、概述
•3．烟酸
•烟酸（nlacln，nicotinic acid）又称尼古丁酸、尼克酸，维生素PP。

烟酸在组织呼吸过程中，作为催化重要的氧化还原反应的多种酶中的辅酶发挥作用。

它可以成为基质脱下来的氧离子的受体被还原，然后经黄素蛋白的作用被再氧化，恢复到原来的状态。

烟酸具有扩张血管、降低血脂、减少胆固醇合成，溶解纤维蛋白，防止血栓形成的作用
•烟酸广泛存在于动植物食物中，主要为动物性食物，尤其在动物内脏中含量较高。

在全谷、种子、豆类中也含有丰富的烟酸
一、概述
•4．烟酰胺
•烟酰胺( nicotinamide)为辅酶I及Ⅱ的组成部分，为多种脱氢酶的辅酶，缺乏时可影响细胞的正常呼吸和代谢而引起糙皮病
•烟酰胺具有防治心脏传导阻滞和提高窦房结功能及抗快速型实验性心律失常的作用，能显著改善维拉帕米（异搏停）引起的心率减慢和房室传导阻滞；临床用于冠心病、病毒性心肌炎、风湿性心脏病及少数洋地黄中毒等伴发的心律失常
•烟酰胺广泛存在于动植物食物中，肉、禽类和鱼都能提供大量的烟酰胺，种子、豆类、谷物、蘑菇、芦笋和绿色的叶菜类也含有丰富的烟酰胺，通常多种维生素营养补充剂中基本以烟酰胺形式存在
一、概述
•烟酰胺的化学式：C6H6N2O，相对分子质量为122.13，化学名称为3-吡啶甲酰胺，CA名称及编号为pyridine-3-carboxamide，98-92-0．结构式如下
烟酰胺为白色结晶性粉末，无臭或几乎无臭，味苦，易
溶于水和乙醇，在甘油中溶解。

熔点128℃～131℃
一、概述
•目前，烟酰胺毒性报道主要见于临床采用大剂量烟酰胺所出现的副反应。

其副作用主要表现为头昏、恶心、上腹不适、食欲不振等，这些症状可自行消失。

妊娠初期过量服用，有致畸的可能。

实验测得大鼠LD50（皮下注射给药）为1.68 g/kg
•烟酰胺的日需要量[以烟酰胺当量(NE)计]是1.6 mg/J (6.6 mg/1 000 kcal)，即13 mg/d
一、概述
•5．咖啡因
•咖啡因(caffeine)是一种全世界使用最广的神经兴奋剂，可刺激中枢神经系统，使情绪激昂，思考力清晰，消除睡意和减轻疲劳。

小剂量能兴奋大脑皮质，改善思维活动，提高对外界的感应性；大剂量则可兴奋延髓的呼吸中枢和血管运动中枢，增加呼吸频率和深度
•咖啡因具有增强体外骨骼肌收缩性的作用。

咖啡因的主要来源是咖啡，其他含有咖啡因的天然植物有60种以上，例如茶叶、可乐果和可可豆
•咖啡因也可以人工合成，作为清凉饮料、感冒药、利尿剂、止痛药、减肥药的添加物
一、概述
•咖啡因的化学式为C
8
H10N4O2·H2O，相对分子质量为212.21，化学名称为1,3,7-三甲基-3,7-二氢-1H-嘌呤-2,6-二酮-水合物，CA名称及编号为1H -purine-2,6-dione，3,7-dihydro-1,3,7-trimethyl-.1,3,7-trimethylxanthine，58-08-2，结构式如下
咖啡因为白色或带极微黄绿色、
有丝光的针状结晶；无臭，味
苦，有风化性；易溶于热水或
三氯甲烷，在水、乙醇或丙酮
中略溶，在乙醚中极微溶解。

咖啡因溶液对石蕊呈中性。

水
合物在空气中粉化。

熔点
235℃～238℃。

1g咖啡因溶于
约50 mL水、75 mL酒精、6 mL
三氯甲烷和600 mL乙醚中
一、概述
•咖啡因对婴儿特别敏感，怀孕和哺乳期的母亲要禁用含咖啡因的饮料，否则会影响婴儿和胎儿，致使婴儿、胎儿发生畸形•咖啡因中毒的症状是：躁动不安、呼吸加快、肌肉震颤、心动过速、早搏以及失眠、眼花、耳鸣等
•大鼠LD50（口服）200 mg/kg～250 mg/kg。

妊娠大鼠被喂给大量咖啡因，可引起难产，仔鼠出现先天性缺陷，骨骼发育迟缓等
一、概述
•成人每天摄入80 mg～250 mg咖啡因[1.1
mg/( kg·d)～3.5 mg/( kg·d)]为低摄入量，300 mg～400 mg[4 mg/(kg·d)～6 mg/(kg·d)]为中摄入量，超过500 mg[7 mg/(kg·d)]为高摄入量
•咖啡因是中枢兴奋药中的清醒药，能提高细胞内环腺苷酸(cAMP)的含量。

低、中摄入量时其作用包括：①兴奋大脑皮质，振奋精神，提高其注意力、自信心以及工作效率和积极性；②增强警觉性和减少疲乏感，提高警惕性和维持持久的工作能力；③增强识别能力，缩短快速与选择反应时间，并能提高瞬时口头记忆力；④影响睡眠，故入睡困难者晚上应减少其摄入量，而高摄入量的咖啡因可引起焦虑、烦躁、失眠、易怒及精细运动功能受损
保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因的
测定
GB／T 5009. 197-2003
1 范围[说明]
•本标准规定了保健食品中盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因高效液相色谱测定方法
•本标准适用于盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺和咖啡因作为膳食补充剂添加于口服液、饮料等试样类型中的高效液相色谱测定方法。

•本方法的检出限为：盐酸硫胺素0.02µg、盐酸吡哆醇0.02µg、烟酸0.10µg、烟酰胺0.06µg、咖啡因0.05µg。

线性范围：盐酸硫胺素0.500 µg/mL～50.0 µg/mL;盐酸吡哆醇0.500µg/mL～50µg/mL烟酸1.00
µg/mL～l00 µg/mL;烟酰胺1.00 µg/mL～l00 µg/mL;
咖啡因5.00 µg／mL～500 µg/mL
【说明】
•标准方法的来源：本方法是在参考日本大正制药株式会社力保健维生素功能饮料检测方法的基础上，结合我国具体的仪器分析条件，制定了适用于片剂、胶囊、口服液、饮料等保健食品类型中所添加的盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、烟酰胺等B族维生素和咖啡因含量的高效液相色谱测定方法
2原理
•将粉碎混匀的片剂、胶囊或液体试样使用甲醉+水+磷酸=100+400+0.5进行提取稀释，根据高效液相色谱紫外检测器外标法定性定量检测
3试剂【说明】
•除非另有说明，在分析中所用的水为双蒸水。

• 3.1 甲醇：优级纯。

• 3.2 乙腈：色谱纯。

• 3.3磷酸：分析纯。

• 3.4硫酸月桂酯钠( sodium dodecylsulfate)：高效液相色谱用试剂。

• 3.5 1-癸烷磺酸钠(sodium 1-decanesulfonate)：高效液相色谱用
试剂。

• 3.6标准储备液A：准确称量已扣除水分的盐酸硫胺素和盐酸吡哆醇标准品各0.0500 g，溶于水中并定容至50 mL。

• 3.7标准储备液B：准确称量已扣除水分的烟酰胺和烟酸标准品各0. 040 0 g，溶于水中并定容至20 mL。

• 3.8混合标准使用液：准确称量经80℃干燥4h的咖啡因0.050 0 g，准确加入标准储备液A 5mL，标准储备液B10 mL，再加入甲醇+水+磷酸=100+400+0.5混合溶液至20 mL
4仪器
•4.1高效液相色谱仪：附紫外检测器。

•4.2超声波清洗器。

•4.3离心机。

5分析步骤
• 5.1 试样处理【说明】
• 5.1.1 取20粒以上片剂或胶囊试样研磨或混匀，称取一定量试样子试管中（准确至0.00 1 g），加入甲醇+水+磷酸=100+400+0.5混合溶液，使浓度为每毫升中大约含盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇0. 25 mg，烟酸、烟酰胺1 mg。

超声提取5 min后以3 000 r/min离心5 min，上清液经0.45 µm滤膜过滤后待进样。

• 5.1.2液体试样直接以甲醇+水+磷酸
=100+400+0.5混合溶液稀释，充分混匀后经0.45 µm滤膜过滤后待进样。

【说明】
•前处理条件的选择：
• 1．提取溶剂为甲醇：水：磷酸=100：400：0.5混合
溶液，其中磷酸用于调节酸度，在此酸度条件下，上述B族维生素方可有效地被提取。

• 2．固体样品需要通过超声实现提取效果，液体样品
直接通过与提取溶剂混匀即可实现提取。

• 3．对于市场上的营养素类保健食品来说，由于其基
质仅含有填充剂，糖或其他调味剂以及其他维生素和矿物质等，故较一般食品要简单得多，但因为是多种维生素的复合体故要比药品复杂得多。

针对这类食品的特点，可采用尽可能简单的前处理方法将分析组分提取出来，上清液直接进样，选择合适的流动相对分析组分进行有效的分析
5分析步骤
• 5.2色谱条件【说明】
• 5.2.1 色谱柱：TSK C18 4.6 mm×150 mm,5 µm。

• 5.2.2柱温：室温。

• 5.2.3检测波长：盐酸硫胺素260 nm；咖啡因、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇280 nm。

• 5.2.4流动相：盐酸硫胺素：硫酸月桂酯钠溶液(5
g→ 530 mL)+乙腈+磷酸=530+470+1;咖啡因、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇：1-癸烷磺酸钠溶液(1.22 g → 850 mL)+乙腈+磷酸= 850+150+1。

• 5.2.5流速：1 mL/min。

• 5.2.6 进样量：10µL
【说明】
•1．标准中使用的色谱柱为TSK C18 4.6 mm×150 mm，5µm，这是根据大量样品检测确定的在标准中提供的流动相条件下最佳的色谱柱，其特点是能够适用于各种样品的分析。

µ-BONDAPAK TM C
18
4.6 mm×250 mm，
5µm在此流动相条件下虽然也能够分析上述B族维生素，且分析时间比TSK C
18
4.6 mm×150 mm，5µm少将近15
min，但液体样品中存在的苯甲酸完全与烟酰胺重合。

因此如分析不含苯甲酸的固体样品，µ-BONDAPAKTM C18 4.6 mm×250 mm，5µm是最佳选择，如分析含苯甲酸的液体样品，TSK CI8 4.6 mm×150 mm，5µm更适合。

• 2．配制流动相时，首先应将离子对试剂溶于水中，
由于表面活性剂自身的特点可能会形成含气泡小球，出现不溶的现象，当加入乙腈后此现象即可消失，成为澄清的溶液
【说明】
•3．在流动相中选用甲醇会出现分析时间长，分离效果和峰形均较差的缺点。

乙腈则效果要好得多，这可能与乙腈极性比甲醇大有关。

• 4．流动相必须要调节酸度，通常使用磷酸，适合的酸度对于保证分析效果极为关键，必须按照标准中的磷酸加入量进行加入，否则无法分析。

• 5．标准中给出的分析温度为室温，在实际分析中可适当加温至35℃以缩短分析时间。

此外使用柱温箱可保证一致的分析时间，实现良好的重复性
【说明】
• 6．由于本方法适用的样品中B 族维生素含量较高．，因此完全可以采用紫外检测器检测。

其中根据盐酸硫胺的特征紫外吸收波长确定其在260 nm 处检测，而其余物质在280 nm 处均具有较高的响应并在标准的色谱条件下可以完全分离，故可将其聚类分析。

• 7．内标物的选择：选择内标物对于定性定量均有好处，虽然分析时外标法更简单一些。

在本实验中可选择盐酸苯海拉明作为测定维生素Bi 的内标物，选择愈创木酚甘油醚作为测定维生素B6、烟酸、烟酰胺和咖啡因的内标，这两种内标虽然配在同一标准溶液中但无交叉干扰
5分析步骤
•在该色谱条件下，盐酸硫胺素保留时间14. 305 min 、
盐酸吡哆醇保留时间18. 512 min 、烟酸保留时间8. 728 min 、烟酰胺保留时间9.341 min 、咖啡因保留时间4.986 min 。

浓度分别为盐酸硫胺素8.80 µg/mL 、盐酸吡哆醇9.60 µg/mL 、烟酸23.8 µg/mL 、烟酰胺25.0 µg/mL ，咖啡因50.4 µg/mL 。

1-盐酸硫胺素
1-咖啡因；2-烟酸；3-烟酰胺；4-盐酸吡哆醇
【说明】
•方法的技术参数：
• 1．方法的线性范围 配制各种分析组分系列浓度的标准溶液，在给定的仪器条件下进行液相色谱分析，以峰面积对浓度校正曲线，得线性回归方程和线性相关系数
各分析组分线性回归方程和线性相关系数
分析组分
浓度范围/(µg/mL) 线性回归方程
线性相关
系数γ
维生素B 1 0.5～50.0 y=32986.25x-2 228.56 0.9998 维生素B 6 0.5～50.0 y=17697.22x+3 240.68 0.9997 烟酸 1.0～l00.0 y=3 894.48x-1160.54 0.9997 烟酰胺 1.0～100.0 y= 5665.19x+809.62 0.9998 咖啡因 5.0～500.0 y=30 435.54x-6 923.47 0.9998 【说明】
•2．方法的准确性和精密度根据试样测定步做两个浓度，每个浓度作6个平行
加标回收试验结果
组分名称 加标回收率范围/% RSD/% 维生素B 1 97～103 2.6 维生素B 6 95～104 3.2 烟酸 94～103 2.6 烟酰胺 97～104 2.8 咖啡因
94～103
3.4
【说明】
•与国内外现行同类检验方法之间的比较：
• 目前，国内外报道测定维生素Bi 、维生素B6、烟酸、烟酰胺和咖啡因的方法有分光光度法、荧光光度法、毛细管电泳法和高效液相色谱法等。

其中，分光光度法为中国药典规定的标准方法，但按其规定的方法一次只能测定某一个组分，且步骤繁杂；分光光度法借助化学计量学方法，理论上可同时测定上述四种维生素，但实际上应用较少，对于含有多种水溶性、脂溶性和矿物质的复合维生素片剂中维生素B 1、维生素B 6、烟酸和烟酰胺的测定，干扰通常较大。

高效液相色谱法是分离测定复合维生素药物中多种组分的有效方法。

多数方法或采用流动相中加入胺类改性剂，以克服碱性维生素(维生素B l 、维生素B 6)的峰拖尾现象；或采用两种流动相体系，以梯度洗脱；或采用碱性去活色谱分离柱，有的还需预柱进行前处理，但柱的平衡时间长，柱寿命短
【说明】
•AOAC测定B族维生素的方法均为传统的分光光度法、微生物法等，没有色谱法。

测定咖啡因的方法也很多，但均限于药品、咖啡、茶叶和无醇饮料等，但其中有色谱法的报道，如饮料中苯甲酸、咖啡因和糖精钠的液相色谱测定法(AOAC 979. 08)，可可制品中可可碱和咖啡因的液相色谱测定法(AOAC980. 14)等。

•本方法在参考日本大正制药株式会社维生素检测方法的基础上，结合我国具体的仪器分析条件，实现了保健食品中维生素Bi、维生素B6、烟酸、烟酰胺和咖啡因五种成分的反相高效液相色谱法分离测定，与国内外现行同类检验方法之间比较具有独特性。

目前国内对于多种维生素、矿物质营养素补充剂、饲料预混料等有很多使用液相色谱多组分分析的报道，技术参数和分析效果和本方法相近。