第十二章病毒的培养

第十二章病毒的培养一、实验动物二、鸡胚三、组织培养(一)组织（块）培养(二)器官培养(三)细胞培养(四)组织和细胞的培养方法(五)细胞克隆技术(六)细胞的保存四、病毒的组织培养五、病毒蚀斑技术病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。

因此,实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞就成为人工增殖病毒的基本工具。

而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的先决条件。

培养病毒最早应用的方法是实验动物和鸡胚,但从50年代简便适用的细胞培养广泛应用于病毒培养以来,前两种方法已降到次要地位,但至今仍有部分病毒的分离鉴定还离不开实验动物或鸡胚,特别是在免疫血清制备以及病毒致病性、免疫性、发病机理和药物效检等方面。

在禽类病毒病和流感、副流感类等病毒病的研究方面,鸡胚(含其它禽胚)仍具有重要的应用价值。

一、实验动物实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。

但是后来发现,实验动物经常自身带有病毒,常常混淆试验结果,并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险,例如被某些致瘤病毒所污染等等。

为了克服这个缺陷,目前已通过微生物控制手段,培育出无菌动物(Germ Free Animal, 简称GF)、已知菌动物或称悉生动物(Gnotobiotics, 简称GN)和无特定病原动物(Specific Pathogen Free Animal,简称SPF)。

GF动物体内和体外均检不出任何微生物、寄生虫或其它生命体。

GN是确知所带微生物的动物。

只带一种菌的叫单菌动物,其次为双菌和三菌动物,四菌以上则称多菌动物。

SPF是指体内无特定微生物和寄生虫感染的动物。

从微生物控制的程度讲,SPF动物虽是这三类中最低的,但它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究产生干扰的微生物,所以能满足病毒学一般实验的需要,比应用普通实验动物取得的结果更为科学与可靠。

限于条件,某些实验室当前仍常应用普通实验动物,但也必须健康,并使用纯系品种。

一次实验使用的动物,在年龄、体重和营养状态等方面要尽量一致。

国外实验动物科学发展迅速,我国已在部分大城市建立实验动物中心,专供应各种经过人工遗传控制和微生物控制而育成的纯系高品位实验动物。

为了满足生物学、医学和兽医学研究的需要,国外按遗传控制标准已育成各类实验动物2600余种,其中小鼠就有1700余个品系,而且已经规范化、标准化,从而保证了研究工作的科学性和严密性。

虽然病毒学实验中应用实验动物的比重正在逐步降低,但是乳鼠至今仍是分离某些虫媒披膜病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒的主要工具。

兽医学上除常应用家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠和鸡胚等进行病毒分离、驯化以及疫苗生产以外,还常直接应用自然易感动物,例如羊、猪、狗、鸡甚至马和牛等大动物作各该病毒的实验研究。

但如上述,普通实验动物经常自身带毒,甚至发生病毒病的流行。

例如家兔常有乳头状瘤、多型瘤、疱疹、兔痘、脑脊髓炎和传染性口腔炎等病毒感染,小白鼠常有鼠痘(脱脚病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、病毒性肺炎、脑脊髓炎、白血病、乳腺瘤、鼠肝炎等病毒感染,仓鼠有唾腺炎等病毒感染,豚鼠有脑膜炎、唾腺炎等病毒感染,实验研究时必须注意。

实验动物主要用于:(1)分离病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒;(2)培养病毒,制造抗原和疫苗;(3)测定各毒株之间的抗原关系,例如应用实验动物作中和试验和交叉保护试验;(4)制备免疫血清和单克隆抗体;(5)作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定,建立病毒病动物模型等。

进行动物实验时,首先考虑的是选择对目的病毒最敏感的实验动物品种和系,以及适宜的接种途径和剂量。

至于实验动物的饲养管理、接种和采血、剖检等具体方法,请参阅微生物学实验指导或有关专著。

二、鸡胚鸡胚(包括其它禽胚)是正在发育中的机体,多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代,并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。

禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低,又可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作简便易行。

应用鸡胚需要注意的首要问题是胚内可能污染细菌(如沙门氏菌等),尤其是经母鸡垂直传递的病毒,如禽白血病病毒以及新城疫、禽脑脊髓炎和Rous肉瘤病毒等。

另外,胚胎中往往含有因母鸡免疫而产生的卵黄抗体,影响同种病毒的增殖。

因此理应选用SPF鸡群产的蛋。

虽然喂饲添加抗生素饲料母鸡的蛋中含有抗生素,但对病毒学实验通常无影响。

病毒在鸡胚中增殖,除部分病毒产生痘斑、引起充血、出血、坏死灶和死亡等变化外,许多病毒缺乏特异性的感染指征,必须应用血清学反应或检查病毒抗原以确定病毒的存在。

鸡胚实验必需的器械主要有孵卵箱、检卵灯、卵盘、开卵钻、卵杯和羊膜腔接种用的照明灯等。

操作时要注意防止污染,选择适宜的接种途径和培养温度,并要认真观察,及时收获。

鸡蛋孵育前不要洗擦,因洗擦能除掉卵壳表面的胶质保护层,容易致发细菌感染。

没有孵卵箱时,也可用普通恒温箱代替,为保持40%～70%的相对湿度,于其下部应放一盛水盘。

最适温度为38～39℃,并应每天翻卵1～2次。

常有绒毛尿囊膜、尿囊腔、卵黄囊和羊膜腔等四种接种方法(见图11-1)1.绒毛尿囊膜接种主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖,这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑或病斑。

用10～12日龄鸡胚。

2.尿囊腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒,例如流感病毒和新城疫病毒的分离和增殖,也是制备马脑炎病毒疫苗的常用接种途径。

选用10～11日龄的鸡胚3.卵黄囊接种主要用于虫媒披膜病毒以及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等的分离和增殖。

用6～8 日龄鸡胚。

4.羊膜腔接种主要用于正粘病毒和副粘病毒的分离和增殖。

在由病料初次分离病毒时,羊膜腔接种法比尿囊腔接种法敏感。

但此法操作技术比较困难,鸡胚也易受伤致死。

选用11～12日龄的鸡胚。

三、组织培养组织培养,原来是指动物或植物组织小块的体外培养。

这个名称现在用以泛指体外的组织、器官和细胞培养,是分离和培养病毒以及进行病毒学实验研究的简便而有效的工具和手段。

病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用,可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过对“指示病毒”的干扰等方法加以识别。

近年来,许多新的动物病毒,就是通过组织培养方法而被发现。

生产病毒抗原以及制造病毒疫苗,则更大量地应用着组织培养。

组织培养的方法有三种。

（一）组织(块)培养这就是原来意义上的所谓组织培养。

将动物组织切成小块在固定或悬浮状态下培养。

组织块培养是最早的组织培养方法。

（二）器官培养取器官薄片(例如一段胎儿气管或一小块鼻粘膜)进行培养,使其基本保持原来的结构和功能,例如正常的纤毛上皮运动。

某些呼吸道病毒,就是应用器官培养才分离出来的。

这种培养还是研究器官生理机能以及某些病毒感染机理的良好工具。

（三）细胞培养应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液,适当洗涤以后,加入营养液,通常即可使其贴附于玻璃瓶壁上, 并生长增殖。

这样的细胞培养物称作-原代细胞。

将已长成单层的原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来后再作培养,就是-继代细胞。

原代细胞和继代细胞一般地还保持原来细胞主要特性,例如继续保持正常体细胞二倍体组型的染色体等。

经过严格检查,染色体的数目和形态正常,并且没有污染的继代细胞,特称二倍体细胞株。

继代细胞(包括二倍体细胞株)一般可在体外传几代、几十代至一百代左右,此后不可避免地逐渐衰老死亡。

由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下,组织培养细胞中有时出现恶性变细胞,也就是癌变细胞。

这种癌变细胞具有很高的生长和增殖势能,而且几乎可以无限地传代,故称-传代细胞系。

传代细胞系的染色体已经发生改变,不再保持原来细胞的正规的二倍体组型,故又称为异倍体细胞。

由人体和动物体取得肿瘤组织进行培养,比较容易获得传代细胞系。

为使二倍体细胞株不致因定期传代而不断增加代数,同时也是为了避免发生变异,通常将其保存于-196℃的液体氮中,以甘油或二甲基亚砜作为保存剂。

这样保存的细胞株,可以随时取用, 甚为方便。

但是必须指出,即使在已经鉴定并已广泛应用的细胞系(株)中也常可能发生病毒污染,例如作者等在进口的IBRS2系猪肾细胞中就曾发现有一种RNA病毒的污染。

(四)组织和细胞的培养方法组织和细胞的培养方法,随培养的组织或细胞的种类以及培养目的而不同。

组织块培养,通常应用玻片悬滴法、旋转管法或卡氏瓶等培养法。

细胞培养,则常应用单层培养法和悬浮培养法。

用于细胞培养或组织块培养的动物胎儿、器官或组织,应在无菌条件下采集后尽快培养。

如需保存一定时间,例如1～2天,可将其切成0.5cm见方的小块后浸泡于营养液内,置4℃冰箱保存,同时加抗生素以抑制细菌生长。

如欲保存更长时间,则应将组织块剪成1～3mm见方的小块,并用Hanks液冲洗2～3遍后,加入5～10倍量的营养液(内含抗生素),置优质玻璃瓶中,盖以橡皮塞后保存于4℃冰箱内。

这样保存的组织块一般经1～2周细胞仍能生长。

但在培养前还需用洗液将其冲洗2～3遍。

如需运送远处,可将带有营养液的组织块瓶置0～４℃冰瓶内运输。

1.组织块培养组织块培养是20年代开始应用的最早的组织培养方法,现在已经很少用,只在某些慢病毒和难于在单层细胞内生长的病毒的分离培养上试用。

组织块培养有固定培养和悬浮培养两种方法。

2.器官培养培养的器官组织能基本保持原来固有的特性,如气管粘膜能保持纤毛上皮运动。

医学上利用器官培养的人胚鼻和气管纤毛上皮,分离出了一些新的人类呼吸道病毒(如冠状病毒),而这些病毒应用一般的细胞培养是分离不出来的。

兽医病毒学也应注意利用器官培养,以发现那些迄今还未分离成功的病毒。

经器官培养分离的病毒,可能逐渐过渡到单层细胞内生长增殖。

器官培养用的组织最好来自妊娠中后期的胚胎,这种组织不仅生长旺盛,而且能保持其固有特性。

采到的器官组织要尽快培养,在普通冰箱中至多保持1～2天(剪成2～3mm 小块并加入含10%犊牛血清的营养液浸泡)。

(五)细胞克隆技术在将原代细胞继续传代的过程中,往往可以发现原来占优势的一些细胞逐渐减少乃至消失,而另一些细胞却可能后来居上,取而代之。

例如原代肾细胞培养物中主要是上皮样细胞,纤维样细胞较少或很少。

但在继代培养过程中,后者逐渐增多,3～4代或更多一些代次以后,上皮样细胞明显减少以至消失,而大部或全部成为了纤维样细胞。

其他组织的培养物,例如肺和骨髓等,也都存在这种情况。

应用异种血清,例如继代培养猪肾细胞或仓鼠肺细胞时应用犊牛血清,最易出现这类现象。

这是因为动物器官和组织中经常含有许多种类的细胞,在原代肾培养物中,肾上皮细胞最多,故在显微镜下观察,以上皮样细胞为主。