第十二章病毒的培养

第十二章病毒的培养

一、实验动物

二、鸡胚

三、组织培养

(一)组织（块）培养

(二)器官培养

(三)细胞培养

(四)组织和细胞的培养方法

(五)细胞克隆技术

(六)细胞的保存

四、病毒的组织培养

五、病毒蚀斑技术

病毒缺乏完整的酶系统,又无核糖体等细胞器,所以不能在任何无生命的培养液内生长。因此,实验动物、鸡胚以及体外培养的器官和细胞就成为人工增殖病毒的基本工具。而大量病毒的培养,又是病毒学实验研究以及制备疫苗和特异性诊断制剂的先决条件。培养病毒最早应用的方法是实验动物和鸡胚,但从50年代简便适用的细胞培养广泛应用于病毒培养以来,前两种方法已降到次要地位,但至今仍有部分病毒的分离鉴定还离不开实验动物或鸡胚,特别是在免疫血清制备以及病毒致病性、免疫性、发病机理和药物效检等方面。在禽类病毒病和流感、副流感类等病毒病的研究方面,鸡胚(含其它禽胚)仍具有重要的应用价值。

一、实验动物

实验动物是长期以来分离和增殖病毒、制造病毒抗原和病毒疫苗以及病毒病实验研究的常用材料和工具。但是后来发现,实验动物经常自身带有病毒,常常混淆试验结果,并给病毒疫苗的生产带来严重的潜在危险,例如被某些致瘤病毒所污染等等。为了克服这个缺陷,目前已通过微生物控制手段,培育出无菌动物(Germ Free Animal, 简称GF)、已知菌动物或称悉生动物(Gnotobiotics, 简称GN)和无特定病原动物(Specific Pathogen Free Animal,简称SPF)。

GF动物体内和体外均检不出任何微生物、寄生虫或其它生命体。

GN是确知所带微生物的动物。只带一种菌的叫单菌动物,其次为双菌和三菌动物,四菌以上则称多菌动物。

SPF是指体内无特定微生物和寄生虫感染的动物。从微生物控制的程度讲,SPF动物虽是这三类中最低的,但它无人畜共患病,无主要传染病,无对实验研究产生干扰的微生物,所以能满足病毒学一般实验的需要,比应用普通实验动物取得的结果更为科学与可靠。限于条件,某些实验室当前仍常应用普通实验动物,但也必须健康,并使用纯系品种。一次实验使用的动物,在年龄、体重和营养状态等方面要尽量一致。

国外实验动物科学发展迅速,我国已在部分大城市建立实验动物中心,专供应各种经过人工遗传控制和微生物控制而育成的纯系高品位实验动物。为了满足生物学、医学和兽医学研究的需要,国外按遗传控制标准已育成各类实验动物2600余种,其中小鼠就有1700余个品系,而且已经规范化、标准化,从而保证了研究工作的科学性和严密性。

虽然病毒学实验中应用实验动物的比重正在逐步降低,但是乳鼠至今仍是分离某些虫媒披膜病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒的主要工具。兽医学上除常应用家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠和鸡胚等进行病毒分离、驯化以及疫苗生产以外,还常直接应用自然易感动物,例如羊、猪、狗、鸡甚至马和牛等大动物作各该病毒的实验研究。

但如上述,普通实验动物经常自身带毒,甚至发生病毒病的流行。例如家兔常有乳头状瘤、多型瘤、疱疹、兔痘、脑脊髓炎和传染性口腔炎等病毒感染,小白鼠常有鼠痘(脱脚病)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、病毒性肺炎、脑脊髓炎、白血病、乳腺瘤、鼠肝炎等病毒感染,仓鼠有唾腺炎等病毒感染,豚鼠有脑膜炎、唾腺炎等病毒感染,实验研究时必须注意。

实验动物主要用于:

(1)分离病毒,并借助感染范围试验鉴定病毒;

(2)培养病毒,制造抗原和疫苗;

(3)测定各毒株之间的抗原关系,例如应用实验动物作中和试验和交叉保护试验;

(4)制备免疫血清和单克隆抗体;

(5)作病毒感染的实验研究,包括病毒毒力测定,建立病毒病动物模型等。进行动物实验时,首先考虑的是选择对目的病毒最敏感的实验动物品种和系,以及适宜的接种途径和剂量。至于实验动物的饲养管理、接种和采血、剖检等具体方法,请参阅微生物学实验指导或有关专著。

二、鸡胚

鸡胚(包括其它禽胚)是正在发育中的机体,多种动物病毒能在鸡胚中增殖和传代,并可用鸡胚制备某些病毒抗原、疫苗和卵黄抗体等。禽胚的优点在于胚胎的组织分化程度低,又可选择不同的日龄和接种途径,病毒易于增殖,感染病毒的组织和液体中含有大量病毒,容易采集和处理,而且来源充足,设备和操作简便易行。

应用鸡胚需要注意的首要问题是胚内可能污染细菌(如沙门氏菌等),尤其是经母鸡

垂直传递的病毒,如禽白血病病毒以及新城疫、禽脑脊髓炎和Rous肉瘤病毒等。另外,胚胎中往往含有因母鸡免疫而产生的卵黄抗体,影响同种病毒的增殖。因此理应选用SPF鸡群产的蛋。虽然喂饲添加抗生素饲料母鸡的蛋中含有抗生素,但对病毒学实验通常无影响。病毒在鸡胚中增殖,除部分病毒产生痘斑、引起充血、出血、坏死灶和死亡等变化外,许多病毒缺乏特异性的感染指征,必须应用血清学反应或检查病毒抗原以确定病毒的存在。

鸡胚实验必需的器械主要有孵卵箱、检卵灯、卵盘、开卵钻、卵杯和羊膜腔接种用的照明灯等。操作时要注意防止污染,选择适宜的接种途径和培养温度,并要认真观察,及时收获。

鸡蛋孵育前不要洗擦,因洗擦能除掉卵壳表面的胶质保护层,容易致发细菌感染。没有孵卵箱时,也可用普通恒温箱代替,为保持40%～70%的相对湿度,于其下部应放一盛水盘。最适温度为38～39℃,并应每天翻卵1～2次。

常有绒毛尿囊膜、尿囊腔、卵黄囊和羊膜腔等四种接种方法(见图11-1)

1.绒毛尿囊膜接种

主要用于痘病毒和疱疹病毒的分离和增殖,这些病毒可在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘斑或病斑。用10～12日龄鸡胚。

2.尿囊腔接种

主要用于正粘病毒和副粘病毒,例如流感病毒和新城疫病毒的分离和增殖,也是制备马脑炎病毒疫苗的常用接种途径。选用10～11日龄的鸡胚

3.卵黄囊接种

主要用于虫媒披膜病毒以

及鹦鹉热衣原体和立克次氏体等

的分离和增殖。用6～8 日龄鸡胚。

4.羊膜腔接种

主要用于正粘病毒和副粘

病毒的分离和增殖。在由病料初次

分离病毒时,羊膜腔接种法比尿囊

腔接种法敏感。但此法操作技术比

较困难,鸡胚也易受伤致死。选用

11～12日龄的鸡胚。

三、组织培养

组织培养,原来是指动物或植物组织小块的体外培养。这个名称现在用以泛指体外的组织、器官和细胞培养,是分离和培养病毒以及进行病毒学实验研究的简便而有效的工具和手段。病毒在细胞内的增殖及其对细胞的作用,可以根据细胞病变、细胞培养物内出现血凝素或其他病毒抗原、红细胞吸附现象以及通过对“指示病毒”的干扰等方法加以识别。

近年来,许多新的动物病毒,就是通过组织培养方法而被发现。生产病毒抗原以及制造病毒疫苗,则更大量地应用着组织培养。组织培养的方法有三种。

（一）组织(块)培养

这就是原来意义上的所谓组织培养。将动物组织切成小块在固定或悬浮状态下培养。组织块培养是最早的组织培养方法。

（二）器官培养

取器官薄片(例如一段胎儿气管或一小块鼻粘膜)进行培养,使其基本保持原来的结构和功能,例如正常的纤毛上皮运动。某些呼吸道病毒,就是应用器官培养才分离出来的。这种培养还是研究器官生理机能以及某些病毒感染机理的良好工具。

（三）细胞培养

应用胰酶等分散剂将动物组织消化成单个细胞悬液,适当洗涤以后,加入营养液,通常即可使其贴附于玻璃瓶壁上, 并生长增殖。这样的细胞培养物称作-原代细胞。

将已长成单层的原代细胞从玻璃瓶壁上消化下来后再作培养,就是-继代细胞。原代细胞和继代细胞一般地还保持原来细胞主要特性,例如继续保持正常体细胞二倍体组型的染色体等。经过严格检查,染色体的数目和形态正常,并且没有污染的继代细胞,特称二倍体细胞株。继代细胞(包括二倍体细胞株)一般可在体外传几代、几十代至一百代左右,此后不可避免地逐渐衰老死亡。

由于遗传突变或者在理化学物质和致瘤病毒的作用下,组织培养细胞中有时出现恶性变细胞,也就是癌变细胞。这种癌变细胞具有很高的生长和增殖势能,而且几乎可以无限地传代,故称-传代细胞系。传代细胞系的染色体已经发生改变,不再保持原来细胞的正规的二倍体组型,故又称为异倍体细胞。由人体和动物体取得肿瘤组织进行培养,比较容易获得传代细胞系。

为使二倍体细胞株不致因定期传代而不断增加代数,同时也是为了避免发生变异,

通常将其保存于-196℃的液体氮中,以甘油或二甲基亚砜作为保存剂。这样保存的细胞株,可以随时取用, 甚为方便。但是必须指出,即使在已经鉴定并已广泛应用的细胞系(株)中也常可能发生病毒污染,例如作者等在进口的IBRS2系猪肾细胞中就曾发现有一种RNA病毒的污染。

(四)组织和细胞的培养方法

组织和细胞的培养方法,随培养的组织或细胞的种类以及培养目的而不同。组织块培养,通常应用玻片悬滴法、旋转管法或卡氏瓶等培养法。细胞培养,则常应用单层培养法和悬浮培养法。

用于细胞培养或组织块培养的动物胎儿、器官或组织,应在无菌条件下采集后尽快培养。如需保存一定时间,例如1～2天,可将其切成0.5cm见方的小块后浸泡于营养液内,置4℃冰箱保存,同时加抗生素以抑制细菌生长。如欲保存更长时间,则应将组织块剪成1～3mm见方的小块,并用Hanks液冲洗2～3遍后,加入5～10倍量的营养液(内含抗生素),置优质玻璃瓶中,盖以橡皮塞后保存于4℃冰箱内。这样保存的组织块一般经1～2周细胞仍能生长。但在培养前还需用洗液将其冲洗2～3遍。如需运送远处,可将带有营养液的组织块瓶置0～４℃冰瓶内运输。

1.组织块培养

组织块培养是20年代开始应用的最早的组织培养方法,现在已经很少用,只在某些慢病毒和难于在单层细胞内生长的病毒的分离培养上试用。组织块培养有固定培养和悬浮培养两种方法。

2.器官培养

培养的器官组织能基本保持原来固有的特性,如气管粘膜能保持纤毛上皮运动。医学上利用器官培养的人胚鼻和气管纤毛上皮,分离出了一些新的人类呼吸道病毒(如冠状病毒),而这些病毒应用一般的细胞培养是分离不出来的。兽医病毒学也应注意利用器官培养,以发现那些迄今还未分离成功的病毒。经器官培养分离的病毒,可能逐渐过渡到单层细胞内生长增殖。

器官培养用的组织最好来自妊娠中后期的胚胎,这种组织不仅生长旺盛,而且能保持其固有特性。采到的器官组织要尽快培养,在普通冰箱中至多保持1～2天(剪成2～3mm 小块并加入含10%犊牛血清的营养液浸泡)。

(五)细胞克隆技术

在将原代细胞继续传代的过程中,往往可以发现原来占优势的一些细胞逐渐减少乃至消失,而另一些细胞却可能后来居上,取而代之。例如原代肾细胞培养物中主要是上皮样细胞,纤维样细胞较少或很少。但在继代培养过程中,后者逐渐增多,3～4代或更多一些代次以后,上皮样细胞明显减少以至消失,而大部或全部成为了纤维样细胞。其他组织的培养物,例如肺和骨髓等,也都存在这种情况。应用异种血清,例如继代培养猪肾细胞或仓鼠肺细胞时应用犊牛血清,最易出现这类现象。这是因为动物器官和组织中经常含有许多种类的细胞,在原代肾培养物中,肾上皮细胞最多,故在显微镜下观察,以上皮样细胞为主。但将原代培养物作继代培养时,由于纤维样结缔组织细胞的生长比上皮细胞快得多,逐渐改变两者的数量关系,最后成了纤维样细胞的一统天下。应用同种血清,例如以犊牛血清培育牛肾细胞,以猪血清培育猪肾细胞,较易保持其上皮细胞类型。但是,更好的办法是采取纯化技术,选取并育成所需细胞类型,例如上皮细胞的细胞株。再者,即使已经纯化的细胞株,在长期的传代过程中,也可能因发生变异而使细胞株在形态、生理特性和对病毒的敏感性方面呈现不一致现象。这也要求我们采用纯化筛选手段,以便保证细胞株的均一和稳定。

所谓细胞克隆技术,就是从一般细胞株(系)的培养物中,获得由一个单细胞后代增殖的细胞群体。所获得的这种生物学性状一致的细胞培养物称为克隆化细胞株,从而达到细胞纯化筛选的目的。应用这种纯化细胞株进行的实验不仅科学可靠,而且能提高细胞的敏感度和可重复性。如流行性出血热病毒的分离培养曾是医学病毒实验室的一个难题,但在应用细胞克隆技术,从Vero细胞中获得了对病毒敏感的Vero-E6纯化细胞系后,一举分离成功,难题迎刃而解。如前述,日常应用的细胞株(系)都是经过长期多次传代的,由于传代过程中各种条件的变化,以及细胞本身的生物变异现象,不断产生细胞分化,结果成为在生物性状上不尽一致的细胞群体。可见应用细胞克隆技术,解决细胞的纯化问题就显得十分必要。

各种细胞株的单胞增殖率明显不同。所谓“单胞增殖率”,是指将一定数量的分散细胞接种入培养瓶或平皿内,待其生长增殖,计算已经形成的细胞集落数目,其占有原来种入的细胞数的百分比,就是单胞增殖率或称集落形成率。传代细胞,例如HeLa细胞的单胞增殖率很高,可达10%～20％,因此易在单细胞分离培养中获得纯系细胞。原代细胞和继代细胞的单胞增殖率较低,通常在2%～3％以下,甚至不到1％,单细胞分离培养的成功率也相应降低。细胞种类当然也是决定单胞增殖率的一个重要因素,例如肿瘤细胞的单胞增殖率显著高于正常细胞,结缔组织细胞和上皮细胞又比其它细胞易于形成纯系细胞等等。

单细胞分离培养技术中有几种比较常用的方法:

1.毛细管法

2.终点稀释法

3.微滴法

4.饲养细胞层法

5.软琼脂法

(六)细胞的保存

实验室内培养的细胞株,需要定期传代,这是一项繁重的工作。而且,由于传代次数增多,相应地增加了细胞污染和变异(包括恶性变)的危险性。二倍体细胞的建立,更要求减少传代次数,以免发生过早的衰老死亡。因此,细胞株的保存是组织培养中一个十分重要的工作。这一问题现已基本获得解决,特别是细胞低温保存方法的成功,极大地保证和促进了细胞培养工作的发展。

1.细胞培养物的常温短期保存

细胞株和传代细胞系的短期保存并不困难。将已长成单层的细胞于换液后置室温或20～22℃温度下避光保存,一般均可保持细胞的生活力达半个月以上(某些细胞,如BHK21细胞,最多能保存7天左右)。但维持液中的血清含量应提高至5%～10％。

与动物组织块的保存方法不同,细胞培养物不宜在4℃保存。单层细胞在这种温度下易于发生退化现象,并且较快由培养瓶壁脱落;继续传代培养时,细胞活力也明显降低。

如果传代培养时将培养温度由37℃降至32℃甚至30℃,则细胞生长缓慢,老化也迟,可以每隔15～30天传代一次。作者等试用30～32℃的温度培养HeLa细胞、人羊膜传代细胞、猪肾细胞(PK15和IBRS2)和驴胎继代细胞等,20～30天传代一次,细胞的形态和活力未见明显变化。如果细胞在这种温度下生长太慢,不能长成单层,可先将其置37℃培养,待其生长增殖而将形成单层时,再行移置于30～32℃培养。但必须指出,由于缺乏详尽的细胞学和病毒学上的鉴定数据,上述的细胞保存方法只是一种可被偶然采用的权宜之计,不能作为细胞保存的基准方法。

在需长途运送细胞培养物,例如经火车或飞机送往远处时,可选择刚刚长成单层的细胞培养物,弃去营养液,加入维持液至满瓶,勿使培养瓶内存留空气。随后用橡皮塞紧塞瓶口,并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15～25℃左右。到达目的地后,将培养瓶内的维持液倒出,仅存留正常的维持液量,并置37℃温箱中培养1～2天,即可进行传代培养。如系炎热夏天,气温太高,而运输路途又远,则可取不漏水的塑料袋1个,放入若干冰块,扎紧袋口,并置入广口保温瓶内,同时放入已用纱布适当包扎的细胞培养瓶,使保温瓶内的温度保持在10～30℃之间。

2.细胞培养物的低温长期保存

早在40年代,人们就已证明人类精子对-79℃乃至-196℃的低温具有一定的抵抗力。随后又发现,甘油对低温保存的动物细胞具有良好的保护作用:细胞悬液中加入甘油,可以明显地提高其在-79℃的活存率。

60年代以来,另一种化学试剂——二甲基亚砜(DMSO)又被用作细胞低温保存的保护剂。应用甘油或DMSO已经成功地保存各种组织细胞,特别是在使用-196℃的液氮以来,已经可以几年或更长时间地保存细胞。

实验证明,当细胞悬液的温度较快下降到0℃以下时,细胞内开始形成冰结晶,这种冰结晶是使细胞产生机械性损伤的主要原因。温度继续下降,细胞外相的冰结晶增多,残留液中的盐类浓度增高,水分从细胞内抽出,其结果,细胞内的可溶性物质特别是电解质在残余的少量水中逐渐浓缩,又使细胞发生渗透性休克。因此,细胞在被冷冻至0℃以下时,将先后或同时发生冰结晶形成、脱水和可溶性物质浓缩等三种变化。而在快速冰冻时,细胞膜又易发生损伤。但如果温度下降缓慢,例如每分钟下降1℃,则发生另外一种情况:细胞内并不出现冰结晶,冰结晶主要形成于细胞外,细胞本身只发生逐渐的脱水,并不遭受严重损伤。因此,“缓慢冰冻”是保护细胞,使之不致发生严重损伤的关键因素。由于细胞内冰结晶的形成和电解质的浓缩主要发生在-5℃和-10℃之间,因此只要严格控制0℃～-20℃范围内的温度下降速度,即可明显减轻细胞在低温冰冻过程中的损伤程度。甘油和DMSO 是非电解性物质,具有较强的亲水性,而且易于穿透细胞膜,可以减轻冰结晶对细胞的机械性损伤作用;此外借助其弥散作用,又可置换细胞内的水分,避免因细胞内脱水而发生电解质浓缩,且使细胞不致发生绉缩。

相反,已在低温冰冻保存的细胞,融解时却又必须十分迅速,否则也会产生严重的细胞损伤。因在缓慢融解时,当细胞由最低温度(例如-196℃)逐渐上升至-20℃～-5℃时细胞内也会形成冰结晶和发生电解质浓缩。因此,一般是将低温保存的细胞安瓿直接置入37℃～40℃的温水中,使其尽快融解,以减少细胞损伤。总结细胞低温保存的经验,可以归纳为一句话,那就是:“缓慢的冰冻和迅速的融解”。

至于什么样的低温条件最有利于细胞保存?何种温度是其可以允许的上界?则还没有充分的研究。一般认为,保存温度最好低于-130℃,因在-130℃以下的低温下,细胞的生命活动降至最低点,有利于长期保存细胞。液氮是目前广泛应用的冰冻剂。

(1)细胞悬液的制备:将已长成或即将长成单层的生长旺盛的细胞,例如培养2～3天又经换液1～2天的单层细胞,按该细胞的常规消化方法消化分散,并在该细胞常用的营养液内作成分散的细胞悬液,倾入离心瓶内,以500r/min离心沉淀5～10分钟,弃去上清液,于沉淀细胞内加入含10％DMSO或甘油的营养液(血清含量为10～15％),其量约为原营养液量的1／4。吹打混合并作必要的稀释,使成每ml含2～5×106个细胞的悬液。应该强调指出,在将DMSO溶液加于沉淀细胞中时,必须一滴滴地缓慢加入,同时将离心瓶置于冰浴内,以免DMSO溶液产生潜热,损伤乃至致死细胞。

甘油和DMSO均应为分析纯试剂。甘油用高压灭菌,DMSO用滤器过滤除菌,两者均分装于小瓶,紧紧加塞后保存于普通冰箱内,不宜多次开启,以免形成有毒的氧化产物。

(2)装瓿和封口:将上述细胞悬液分装于1ml的硬质玻璃安瓿内。在距细胞悬液面3cm 处用酒精喷灯封口，以免烫死细胞。封口必须十分可靠，否则在由液氮中取出时可能发生危险的爆炸。因此，应将已经封口的安瓿置入0.5％甲基蓝溶液中10分钟。凡有蓝色液进入的安瓿应即废弃，并将合格的安瓿置自来水下冲净后擦干，准备冷冻。

(3)冷冻：将细胞安瓿置于特制的预冻装置内，使其温度缓慢下降(每分钟1℃)直至-20℃。此后即可将其迅速置液氮中。如果没有特制的预冻装置，可将细胞安瓿放入一个适合的纸匣内，衬垫棉花加以固定，切勿倾斜。匣外包裹3层棉花，每层厚1cm，再用橡

皮带扎紧,随即置4℃冰箱内6小时，取出后置入-20℃冰箱内24小时。在由-20℃冰箱内取出后，迅速除去棉花层，并从匣内取出安瓿，立即浸入液氮保存。

(4)复苏和培养：需取用细胞时，可用竹镊子取出细胞安瓿，迅速投入37～40℃的水浴锅内，加盖并适当摇晃，使冰冻的细胞迅速融解(40～60秒内)。随即取出已融化的细胞安瓿，用75％酒精消毒后，用安瓿锯锯开颈部，用几层灭菌纱布掰除安瓿顶部后，用毛细吸管吸出细胞悬液，置入培养瓶，并于每ml细胞悬液内加入10倍量预热至37℃的营养液。营养液中的血清含量提高至10%～15％。置37℃的CO2温箱内培养4～12小时。在细胞贴壁后，即可换入新的营养液，继续培养至长成单层后换液，并考虑传代。也可在细胞悬液内加入10倍量营养液后，即以500r/min的速度离心沉淀10分钟，倾弃上清层，彻底除去保护剂，再在沉淀细胞内加入营养液，充分混悬后分瓶培养。营养液的最后加入量以原培养的细胞营养液为准。例如由10ml细胞培养物制成的冷冻细胞，在融解和离心沉淀后可再悬浮在10ml营养液中进行培养。如果低温保存条件不理想，例如冷冻速度不够缓慢……等等，则因细胞死亡较多，最后的营养液量可减半。细胞计数时，每ml营养液中的活细胞不应低于20～30万。

如果没有液氮设备，可将上述已经预冻处理的细胞安瓿置-70℃冰箱内。在液氮中保存1～2年的细胞，活存率一般可达80%～90％，而在-70℃冰箱内保存同样时间的细胞，活存率不到10％，有时只有3％左右。

液氮操作必须十分小心,应穿戴防护服、面罩和手套，特别注意防护眼睛。没有封严或有裂纹的安瓿中可能渗入液氮，当由液氮中取出时，因液氮快速蒸发而发生剧烈爆炸。皮肤接触液氮也会引起严重冻伤。近来改用塑料安瓿，就比较安全了。

四、病毒的组织培养

组织培养是病毒学研究和实践中最为广泛应用的手段，不仅用于分离和鉴定病毒，而且是研究病毒与机体或组织细胞相互关系的基础。且如上述，组织培养细胞还是生产特异性诊断抗原和病毒疫苗的比较理想的材料。

应用组织培养细胞接种病毒，必须首先选择敏感细胞。例如乙型脑炎病毒易在仓鼠肾、猪肾、羊胚肾和鸡胚等原代细胞上增殖，并常呈现明显的细胞病变或出现蚀斑；狂犬病病毒可在鸡胚、小白鼠、仓鼠、猪、兔、狗等许多动物和人的许多组织的原代细胞和继(传)代细胞中生长，但在WI-38(人胚肺二倍体细胞株)、BHK21克隆13和小鼠成神经细胞瘤细胞(C-1300)中产生的病毒滴度最高，并形成明显的细胞病变；马传贫病毒只能在马属动物的原代白细胞和骨髓细胞以及某些继代或传代细胞内增殖……等等。应用组织培养方法培养病毒，一般采用易感动物的组织，例如应用牛、猪或仓鼠的细胞培养口蹄疫病毒，应用马属动物的细胞培养马传贫病毒等等。但是非敏感动物的组织细胞有时也能支持自然条件下不感染的病毒的生长，例如可用鸭胚细胞培养鸡的马立克氏病病毒等等。关于哪些类型的细胞对哪些种类的病毒具有敏感性，没有明确的规律性，似乎只能依靠经验，也就是通过实践来发现和验证。故在分离未知病毒时，应该多选几种细胞同时进行分离培养，

以便增加分离成功的机会。而病毒的细胞感染范围又可反过来为该病毒的分类鉴定提供一定的依据。

当病料污染严重或含有的活病毒量太少，直接用细胞培养分离病毒困难时，可采用“带毒培养方法”。即先用病料悬液接种健康同种动物或易感实验动物，当其出现可疑症状时扑杀，立即灭菌采取可能感染有病毒的组织器官进行原代细胞培养，经48～72小时细胞基本长成单层时换维持液，以后每天镜检细胞病变(CPE)一次。这种带毒培养的细胞，往往于原代即能出现CPE。为提高病毒分离率，当原代培养没有出现明显CPE时，可将原代细胞盲目进行次代培养，有时原代细胞未出现CPE或CPE不明显，而于次代培养时出现。另外，这种方法也可用于已知病毒的培养传代，即在病毒传代过程中发现CPE不明显或不规律时，可将此带毒培养物用胰酶消化后作1∶1或1∶2传代培养，往往在带毒传代以后，病毒对细胞的毒力表现增强，CPE恢复正常。以上两种带毒传代方法，在我们实验室都曾多次应用，实践表明，效果良好。

关于细胞培养物接种病毒的时机，多数病毒是在细胞培养长成或基本长成单层后，在换液同时接种病毒；但细小病毒类例外，要在培养细胞同时接种病毒。原因在于这类病毒复制过程中编码能力有缺陷，需要依赖细胞有丝分裂过程中的某些功能才能完成病毒粒子的复制，因此需要与细胞传代时同步接毒。

必须指出，组织培养细胞，特别是原代细胞和由原代细胞传代育成的细胞株，往往自身携带病毒，易被误认为是欲分离的病毒，从而造成错误结论。因此，用以培养病毒的组织培养细胞特别是细胞株，必须严格鉴定，并多设置空白对照，也就是不接种病毒或可疑材料作为对照。

病毒在组织培养中的增殖，可以根据其所引起的细胞病变、细胞代谢(颜色)反应或者血凝素和特异性病毒抗原等病毒成分以及电镜直接观察而识别。将感染培养物接种敏感动物和鸡胚，观察实验动物和鸡胚的发病和死亡情况以及病理变化，也是判定致病性病毒存在的一个常用方法。

某些病毒之间存在干扰现象，也就是一种病毒的增殖可以抑制另一种病毒的生长，因此可以应用一个已知病毒，根据其在细胞培养物中的被干扰情况，间接判定另一种病毒存在的可能。也有一些病毒具有增强另一些病毒增殖和产生细胞病变的作用，所以也可利用这一现象判定这些病毒的存在等等。

五、病毒蚀斑技术

病毒蚀斑，又称空斑，是指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。将适当稀释的病毒悬液接种敏感的单层细胞，再在单层细胞上覆盖一层固体介质，例如琼脂糖、甲基纤维素等，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能进而感染和破坏邻近的细胞。经过几个这样的增殖周期，就将形成一个局限性的肉眼可见的变性细胞区，直径小到1～2mm，大至3～4mm，这就是蚀斑。某些病毒在一般单层细胞培养内不形成CPE，但是却可在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。因此可用蚀斑方法进行此类病毒

的检测。混悬于琼脂等固体介质中的稠密细胞，在接种病毒后，也可产生蚀斑。为了便于观察，常在覆盖琼脂中加入使细胞着染的染料。这些染料或着染死细胞而不染活细胞，如台盼蓝；或着染活细胞而不着染死细胞，如中性红。中性红是蚀斑技术中最常应用的一种染料。这种染料在中性时呈红黄色，偏碱时变黄，偏酸时呈玫瑰色。在以中性红着染的细胞培养瓶内，当蚀斑长到1mm直径以上时，可在白色衬底上清楚看到红色背景中不着色的蚀斑。某些病毒，例如新城疫的某些变异株和SV40病毒感染的细胞，其对中性红的亲和力反而高于未感染细胞，因此可形成红色蚀斑。

从理论上讲，一个病毒粒子可以形成一个蚀斑。反过来说，每产生一个蚀斑，也就是说明原接种物中含有一个活的病毒粒子。但是实际情况远非如此，因为并非每个病毒粒子都有感染和增殖的能力，操作过程中也常有许多病毒粒子灭活,而且即使是有增殖能力的病毒粒子，也不一定能够遇上合适的敏感细胞。根据电子显微镜的观察，经常是几百个乃至上千个病毒粒子才能形成一个蚀斑，即使在最好的试验条件下，例如应用增殖力和抵抗力较高的病毒、敏感的细胞以及十分严密和适当的实验条件，也需几十个病毒粒子才能产生一个蚀斑。因此，以蚀斑形成单位(PFU)表示病毒悬液中的感染病毒浓度，似乎更为确切，例如说某个病毒悬液每ml含有108个PFU的原理，实际上就是将病毒悬液作连续的10×稀释，随后各取定量，接种于已经长成单层的敏感细胞上，并覆盖中性红琼脂，待其出现蚀斑后计数，即可算出病毒悬液中每ml所含的蚀斑单位。

蚀斑技术主要用于病毒纯化，亦即挑选病毒克隆株(Clone)。由于病毒的遗传变异，一般所用的病毒悬液或所谓的病毒株，实际上都是由许多在特性上不尽一致的病毒粒子组成的混杂群体。应用蚀斑技术，也就是根据蚀斑的不同的性状、产斑条件和产斑时间等进行挑斑，可以从这类混杂群体中挑选出各个不同的纯化病毒，亦即克隆株。近年来，许多弱毒疫苗株就是通过蚀斑技术选育而成。而在弱毒疫苗的生产中，也需经常地通过蚀斑技术选出克隆株，借以保证疫苗株稳定的免疫原性和弱毒特性。

蚀斑技术还是测定病毒悬液中感染病毒含量的一个准确方法。因为组织培养细胞的敏感性比较一致，培养条件也易统一，所以蚀斑技术已在许多动物病毒的滴定中取代了实验动物滴定法。由于特异性抗体能够抑制病毒产生蚀斑，故可应用蚀斑技术测定动物血清或其他体液内的中和抗体，亦即所谓的蚀斑抑制试验和蚀斑减数试验。