RNA测序研究进展

基因组学课程论文

（RNA测序的研究进展）

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学号：

专业：生物技术

班级：三班

论文提交日期2011 年10 月

RNA测序的研究进展

摘要：RNA测序（RNA-seq）已成为基因表达和转录组分析的新的重要手段，RNA-seq技术产生的海量数据为生物信息学带来了新的机遇和挑战. 有效地对测序数据进行针对性的生物信息学处理和分析，成为RNA-seq技术能否在科学探索中发挥重大作用的关键。目前，大约已发现了100多种miRNA，它们存在于不同的生物中，从四膜虫、线虫、植物、动物到人都已发现了不同的miRNA。miRNA的主要功能是调节内源基因表达，它在基因活动调控网络中扮演了重要的角色。小RNA分子研究将是今后分子生物学的研究热点之一。本文主要针对二代测序技术在RNA中的应用机理以及进展进行了简要综述。

关键词：二代测序；miRNA；高通量测序；cDNA文库

RNA sequencing research progress

Abstract:The RNA sequencing (RNA-seq) has become a gene expression and transcription of the new important means of analysis, RNA-seq technologies to produce the amount of data for bioinformatics brought new opportunities and challenges. The effective data to sequencing the targeted bioinformatics processing and analysis, become RNA-seq technology can be in scientific exploration of the key plays a major role. Currently, about 100 has been found in DuoZhong miRNA, they exist in different biological, from the four membrane bug, worms, plants and animals to people already found different miRNA. The main function is to adjust miRNA endogenous gene expression, it in gene regulation network activities play an important role. Small RNA molecules research will be in the future of molecular biology research hotspot. This article mainly aims at the second generation sequencing technology in the application principle and progress RNA is reviewed.

Key words:The second generation sequencing;miRNA; Illumina Genome Analyzer IIx; cDNA library

近年来基于边合成边测序思想的新一代测序技术迅猛发展，测序通量急速增加，测试成本也呈现直线下降的趋势。该技术正在使基因组研究发生革命性变化，在不久的未来可能将人的基因组测序成本降低到一千美元。目前新一代测序的读长很短，一般只有25-75bp，但是测序的通量非常大，一次可以获得上千万条短序列。虽然新技术已经开始普及，但是测序后的数据分析依然存在巨大的挑战，比如快速而准确的短序列比对，DNA多态性检测，数据管理和可视化等。另外，新一代测序技术在非模式生物转录组和基因组学研究进展十分缓慢。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类内源性的长度约22个核苷酸的非编码小分子RNA，能够在转录后水平调节mRNA表达。miRNA在线虫、果蝇、植物、哺乳动物，甚至病毒中广泛存在。miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，而且绝大部分定位于基因间隔区，其转录独立于其他基因。这类小RNA在表达上具有组织和时间的特异性，是调节其他功能基因表达的重要调节分子，在生物体的各种生命活动过程中发挥着重要作用。

1 二代测序在RNA中的应用原理与方法

近年来，新一代高通量测序技术得到了突飞猛进的发展，在此基础上，高通量RNA测序即RNA-seq也迅速发展. 二代测序(深度测序)技术和基因芯片技术在最近几年当中发挥了不可逾越的作用，但是两者都需要足够的高质量的核酸样品。与基因芯片技术相比，二代测序无需设计探针，能在全基因组范围内以单碱基分辨率检测和量化转录片段，并能应用于基因组图谱尚未完成的物种，具有信噪比高、分辨率高、应用范围广等优势，正成为研究基因表达和转录组的重要实验手段。所以，在只有或只能用单细胞或极少量细胞的情况下，如果没有特殊手段，上述分析往往不能常规、方便地进行。而深度测序(或基因芯片杂交)往往需要较多的DNA，并且在测序之前还需要一个扩增建库的过程，斯坦福大学Quake研究组利用其发明的Helicos单分子测序技术用较少的DNA快速测定了人类个体的全基因组序列，无需克隆或扩增，获取到了高质量的数据和许多重要发现；该技术也显示mRNA库良好的直接测序结果；该技术的的一个最新结果是，结合流程池捕获(flow．cell capture)和原位反转录技术，只用少至250至16000个小鼠或人体细胞，成功深度测定了mRNA库的序列。总之这项技术开创了一个新的方向，但与其说是“单分子测序”不如说是“直接测序”更能准确反应其特点，但是该技术在单细胞上的应用，就现状看来，还未有重要的的相关研究报道[1]。新一代测序技术是新出现的一种高通量测序核苷酸序列的技术，和以往的技术相比主要在通量和成本方面具有明显优势。目前该技术已被广泛运用于生命科学研究各领域。新一代测序技术在发展过程中出现了三大测序平台，分别是：454Life Sciences(Roche)，Illumina(Solexa测序)和SOLiD。高通量测序技术应用于转录本研究一一用新一代高通量测序技术检测总RNA的技术(简称RNA-Seq)，可从低丰度的样本中(或罕见的样本亚细胞株)检测到RNA，并且准确率很高。大量研究结果表明，RNA-Seq可以数字化定量转录水平，并且准确全面地确定基因组突变位点。已报道的研究结果表明，高通量测序数据有较高的重复性，非常小的技术差异。可以比转录组芯片技术检测到更多的差异表达基因。RNA-Seq极有可能取代基因芯片在转录组研究中的地位，成为转录组学主要的研究手段。这些第2 代测序技术尽管获得的序列较短，但具有速度快、成本低、覆盖度深、产出巨大等优点，因此非常适合小分子RNA 测序，尤其是对那些拷贝数低的小分子RNA。以最早发现的microRNA（miRNA）为例，互补链的出现已成为衡量其是否为miRNA 基因的充分必要条件。而miRNA 互补链在miRNA 形成后即进入降解途径，因而拷贝数极低，利用传统测序技术一般无法检测到。因此，高通量测序技术可大

大促进植物小分子RNA 基因的发现过程，为研究小分子RNA 的合成机制和生物学功能及其在物种间的进化规律提供大量信息。

1.1 有关miRNA的相关测序