9 血液中转氨酶活力的测定

实验九&十血液中转氨酶活力的测定（分光光度法）

本实验八人一组（根据分光光度计来确定）

一、目的要求：

1、了解转氨酶的重要作用及其在临床诊断中的意义。

2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。

二、原理：（谷丙转氨酶和丙酮酸的反应方程式）

生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基与丙酮酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解，尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类很多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。正常人血清中只含有少量转氨酶，当发生肝炎、心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。

本实验采用分光光度计法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙（催化反应方程式）。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法（520nm）测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可以计算酶的活力。

三、操作：

实验九标准曲线的绘制（由于时间关系，只做一组数据，不要重复）

1、向试管中加入试剂（有改动）：取6支试管，分别标上0、1、

2、

3、

4、5六个号。按表中所列的次序添加各种试剂（由于后面测定样品时有对照实验，所以不需要加入谷丙转氨酶底物，以蒸馏水补齐；不需要保温10分钟来平衡内外温度）。

2、向各管内加入0.5mL 2，4—二硝基苯肼溶液后37℃保温20分钟。

3、分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5mL（丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色）。在室温下保温静置30分钟，以0号管做空白，测定A520nm的吸光度。用丙酮酸的摩尔数做横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。

实验十酶活力的测定

一、目的要求：

2、学习转氨酶活力测定的原理和方法。

二、原理：（谷丙转氨酶和丙酮酸的反应方程式）

本实验采用分光光度计法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙（催化反应方程式）。丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法（520nm）测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可以计算酶的活力。

三、操作：

1、取2支试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对照管，各加入谷丙转氨酶底物0.5mL，置于37℃水浴内10分钟，使管内外温度平衡（不需要）。

2、取血清0.1mL加入第1号试管内，37℃保温30分钟后，

3、向2支试管中加入2，4-二硝基苯肼试剂0.5ml，向第2号试管补加0.1mL血清，再向1，2号管内各加入0.4mol/l氢氧化钠溶液5mL，在室温下静置30分钟后，测定未知管的A520nm 波长吸收值。

4、在标准曲线上查出丙酮酸的μmol数，计算每100mL血清中转氨酶的活力单位数。

五、思考题：

1、转氨酶在代谢过程中的重要作用及临床诊断的意义？

（2，4-二硝基苯肼是有机溶剂，可能会抑制反应的进行，可做对照实验来验证）