高效液相色谱塔板理论
塔板理论
第二章 气相色谱分析gas chromatographic analysis,GC第二节 色谱理论基础fundamental of chromatograph theory色谱理论需要解决的问题：色谱分离过程的热力学和动力学问题。
影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径，柱效与分离度的评价指标及其关系。
组分保留时间为何不同色谱峰为何变宽组分保留时间：色谱过程的热力学因素控制；（组分和固定液的结构和性质）色谱峰变宽：色谱过程的动力学因素控制；（两相中的运动阻力，扩散）两种色谱理论：塔板理论和速率理论；一、塔板理论-柱分离效能指标1.塔板理论（plate theory ）半经验理论；将色谱分离过程比拟作蒸馏过程，将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 （类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程）；塔板理论的假设：(1) 在每一个平衡过程间隔内，平衡可以迅速达到；(2) 将载气看作成脉动（间歇）过程；(3) 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略；(4) 每次分配的分配系数相同。
色谱柱长：L ，虚拟的塔板间距离：H ，色谱柱的理论塔板数：n ，则三者的关系为：n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为： 保留时间包含死时间，在死时间内不参与分配!2.有效塔板数和有效塔板高度•单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。
•用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。
222116545)()(./bR R W t Y t n ==•组分在t M 时间内不参与柱内分配。
需引入有效塔板数和有效塔板高度：3.塔板理论的特点和不足（1）当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高，所得色谱峰越窄。
（2）不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质。
（3）柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组分的分配系数K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都无法分离。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
塔板理论
二、塔板理论1．塔板理论的基本假设塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。
它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。
塔板理论的基本假设为：1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。
2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。
3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。
4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。
虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。
但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。
2．色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）由色谱流出曲线方程可知：当t＝tR时，浓度C有极大值。
Cmax就是色谱峰的峰高。
因此：①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。
②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。
由流出曲线方程对V(0~∞)求积分，即得出色谱峰面积A。
可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。
把Cmax＝h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。
三、速率理论（又称随机模型理论）1．液相色谱速率方程1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论--速率理论。
它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。
后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）.2．影响柱效的因素1）涡流扩散（eddy diffusion）。
高效液相色谱仪常识
被分离组分在柱中的洗脱原理
Ⅱ 基本概念和理论
一、基本概念和术语
1.色谱图和峰参数
⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）.
⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。
⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。
⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。
4.相平衡参数（distribution coefficient,K）--在一定温度下，化合物在两相间达到分配平衡时，在固定相与流动相中的浓度之比。K=[xs]/[xm]
Cs-溶质在固定相中的浓度
Cm－溶剂在流动相中的浓度
分配系数与组分、流动相和固定相的热力学性质有关，也与温度、压力有关。在不同的色谱分离机制中，K有不同的概念：吸附色谱法为吸附系数，离子交换色谱法为选择性系数（或称交换系数），凝胶色谱法为滲透参数。但一般情况可用分配系数来表示。
⊕保留时间（retention time,tR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。
⊕保留体积（retention volume,VR）--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值时流出溶剂的体积。又称洗脱体积。VR＝F*tR .
⊕调整保留时间（adjusted retention time,tR’）--扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间（reduced retention time）。在实验条件（温度、固定相等）一定时，tR’只决定于组分的性质，因此，tR’(或tR)可用于定性。TR’=tR-t0
高效液相色谱原理和操作详解
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 (2)一、液相色谱理论发展简况 (2)二、HPLC的特点和优点 (2)三、色谱法分类 (3)四、色谱分离原理 (3)II．基本概念和理论 (5)一、基本概念和术语 (5)二、塔板理论 (8)三、速率理论（又称随机模型理论） (9)III．HPLC系统 (10)一、输液泵 (11)二、进样器 (13)三、色谱柱 (14)四、检测器 (17)五、数据处理和计算机控制系统 (20)六、恒温装置 (20)IV．固定相和流动相 (20)一、基质（担体） (20)二、化学键合固定相 (22)三、流动相 (23)1．流动相的性质要求 (23)2．流动相的选择 (24)3．流动相的pH值 (24)4．流动相的脱气 (25)5．流动相的滤过 (25)6．流动相的贮存 (26)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (26)8．HPLC用水 (26)V．HPLC应用 (27)一、样品测定 (27)二、方法研究 (27)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (28)一、对起草单位的要求： (28)二、对复核单位的要求： (28)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱中理论塔板数的计算方法
高效液相色谱中理论塔板数的计算方法高效液相色谱中理论塔板数的计算方法理论塔板数(theoretical plate number,N)用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为:N=(tR/σ)2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2 W:峰宽 ; σ:曲线拐点处峰宽的一半，即峰高0.607处峰宽的一半。
N为常量时，W随tR成正比例变化。
在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。
用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。
(一般HPLC柱的N在1000以上。
) 若用调整保留时间(tR’)计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)=16(tR’/W)2理论塔板高度(theortical plate height,H)每单位柱长的方差。
H=。
实际应用时往往用柱长L和理论塔板数计算:H=L/N在实际应用中能达到分离完全就可以了，塔板数超过会增加试验的时间，试验效率就会降低。
定义编辑理论塔板数(theoretical plate number)N，色谱的柱效参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率(简称柱效)。
N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为:理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)2 (2是平方)柱效率用理论塔板数定量地表示:N=16*(t/w )2。
其中，t是溶质从进样到最大洗脱峰出现的时间，w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。
色谱法
载气
检测器
氮气
氢火焰离子化检测器（FID）
检测温度高于柱温
一般 250 ~ 350℃
二、高效液相色谱法（HPLC法）
以液体为流动相的色谱法
（一）HPLC的速率理论
H A Cu
与气相色谱法的差别
GC法 高温（ChP 50 ~ 265℃） 纵向扩散项大（B/u）
HPLC法
室温
传质阻抗项大（Cu）
2. 载体
硅藻土型载体（红色、白色）
3. 毛细管色谱柱 填充型毛细管柱
开管型毛细管柱（WCOT、SCOT）
√
（四）气相色谱仪
气源 进样及气化系统
色谱柱和柱温箱
检测器 热导检测器 氢火焰离子化检测器
电子捕获检测器
ChP（2005）对气相色谱仪的一般要求
色谱柱 固定液 填充柱或毛细管柱（空心柱) 高沸点液体
As Cs f AR CR
内标+样品→计算杂质含量
Ax Cx f As Cs
内标物+ 杂质对照品 →校正因子
内标物+样品 →杂质含量
（2）外标法 供试品→供试品溶液
杂质对照品→对照品溶液
Ax 含量（ x） CR C AR
缺点 不易控制进样量
宜用定量环
（3）加校正因子的主成分自身对照法
2
（二）分离度（R）
除另有规定外，R≥1.5
2 t R2 t R1 R W1 W2
t R2 t R1
（三）重复性（RSD）
尾因子（T）
除另有规定外，T应0.95 ~ 1.05
W0.05h T 2d1
四、GC和HPLC在药品检验中的应用
配系数大的后流出
塔板理论
成的影响，故可利用此特性通过改变流动相的组成，在液
固色谱仪上完成许多困难的分离工作。
四、色谱流出曲线方程的连续函数形式
处理式（2.21），取其对数得到
故
在实际过程中，进入柱管的样品量m远远多于一个分子， 而色谱图上纵坐标往往以浓度c来表示，在这样的情况下， 色谱流出曲线的连续函数形式可表示为：
从3.6可知，
由此可看出影响色谱区域宽度的因素有：
（1）柱管填充疏松时（即流动相占的空间大），qw大，因此△V1/2大；
（2）流出时的物质有较大的K值，△V1/2大； （3）塔板高度H值大，长度较长的色谱柱流出物的△V1/2大；
（4）塔板高度H的大小与流动相的线速度有关，过高或过低的线速
度都会使△V1/2增大；
浓度分配比k：
k = a/c
a:平衡时每毫升固定相所含组分 c:平衡时每毫升流动相所含组分量
2、柱内各处H为常数
设色谱柱长为L，则柱内相当的塔板数（n）为： n=L/H
3、 流动相在柱内每个塔板上跳动的次数为：
V/Hqw
V: 通过色谱柱的流动相的体积
q:柱内的横截面积
w:在柱的横截面积中流动相所占的截面积分数
式中
式（2.45）也可以写成：
不难看出上式描述出来的色谱流出曲线是以V=VR为对称 轴的正态分布曲线
五、流出峰达到最大值时组分在柱后的浓度
由式（2.45）可以见到，当V=VR时色谱流出曲线达到极大 值为
借助于式（2.48），可以归纳出影响色谱峰峰高的因素有： （1）进样量m越大，则Cmax越大，Cmax与m成正比，这一事 实即为色谱峰高定量法的理论依据； （2）塔板高度（H）越小，即柱效率越高时Cmax/m越大；
分 离 科 学
安捷伦高效液相色谱基本原理-理论
• 化合物和仪器特异 性
• 最佳流速取决于具 体化合物
ToC
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 28
5.0 m 3.5 m 1.8 m
峰容量
梯度分析
hf(w2 ) 折合理论塔板高度是峰宽的函数
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h = f ( weddy + wax + wC ) • 涡流扩散
• 扩散系数
h = A + B/u + C u
• 传质阻力
ToC
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折合理论塔板高度 (h)
Van Deemter 方程
仅用于教学目的 2014 年 12 月 4 日 © Agilent Technologies, Inc. 2016 18
影响分离的因素
同一种样品采用相同固定相、流动相及相同梯度，但采用不同柱温 进行分析。
ToC
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塔板理论、速率方程
吸收了塔板理论的概念
结合了影响塔板高度的动力学因素
解释了影响塔板高度的各因素
内容：填充柱的柱效受分子扩散、传质阻力、 载气流速等因素的控制
H 2d p 2Dg u
2 2 0.01k 2 d p d 2 k f u 2 1 k 2 d g 3 (1 k ) DL
塔板理论有利于我们形象地理解色谱的分离过程；
导出色谱流出曲线方程，它符合高斯分布，与实验现 象相吻合；
导出理论塔板数的计算公式，作为柱效的评价指标；
塔板理论的局限：
定性地给出了塔板高度的概念，却无法解释板高的影
响因素；
不能解释流速对理论塔板数的影响； 四个假设与实际不相符合；
三、速率方程
论塔板数作为衡量柱效率
的指标。
二、塔板理论
Martin and Synge receiving the 1952 Nobel Prize in chemistry
二、塔板理论
塔板理论的假设：
（1）组分在两相间的分配可以瞬时完成。这样达到分
配平衡的一小段柱长称为理论塔板高度H；
（2）载气进入色谱柱不是连续的，而是脉动（间歇） 过程，每次进气为一个板体积； （3）试样开始时都加在0号塔板上，而且试样在相邻 两塔板间没有纵向扩散；
一、色谱分离基本参数
滞留因子
流动相在柱内的线速度为u cm· s-1，由于固定相对组分 的保留作用，组分在柱内的线速度us将小于u，两速度之比 称为滞留因子Rs
Rs us / u
Rs也可用质量分数ω表示
mM 1 1 Rs m mS mM 1 S 1 k mM
理论塔板数
理论塔板数1、定义理论塔板数（theoretical plate number）N，色谱的柱效参数之一,用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。
N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)2柱效率用理论塔板数定量地表示：N=16*（t/w ）2。
其中，t是溶质从进样到最大洗脱峰出现的时间，w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。
在一色谱柱中用相同的洗脱条件时候，不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。
因此理论塔板数大的色谱柱效率高。
当然，N的大小和柱子长度有密切关系：理论塔板高度H=柱长/N，用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H越小，则色谱柱效率越高。
N为常量时，W随tR成正比例变化。
在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。
用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。
N与柱长成正比，柱越长，N越大。
用N表示柱效时应注明柱长，，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。
（一般HPLC柱的N在1000以上。
）若用调整保留时间（tR′）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16(tR′/W)2我们知道实际操作过程中，峰会出现拖尾的情况，所以，实用半峰宽比使用峰宽要准确一些，当然这也不是绝对的。
理论塔板高度和理论塔板数都是柱效指标，，由于峰宽或半峰宽是组分分子在色谱柱内离散的度量，总的离散程度是单位柱长内分子离散的累计，其与柱长成正比。
理论塔板数首先应该是和柱子的性能是有关系的，像填料，柱长什么的，和你的流动相，流速，样品分子量大小都是有关系的。
每个峰的理论塔板数肯定是不同的，理论塔板数越高峰形越好。
2、理论塔板数下降后可以考虑色谱柱再生（1）、反相柱分别用甲醇：水=90：10，纯甲醇（HPLC级），异丙醇（HPLC级），二氯甲烷（HPLC级）等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积，然后再以相反的次序冲洗。
学习液相，必须要知道的三大理论
学习液相，必须要知道的三大理论写在前面高效液相色谱我们常用，如何操作自然难不倒我们，那么，液相色谱的分析的理论基础是什么？这个你知道吗？这一篇咱们好好学一学液相色谱的分析理论基础，可以让你更好地使用高效液相色谱仪。
在说分析的理论基础之前，问大家一个问题，为什么液相色谱柱的内径都不是整数呢？”例如:1.7、1.9、2.1、4.6这是为什么呢？想了解真相？往下看色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。
组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相的分配系数决定的，即色谱过程的热力学性质有关。
但是两峰间虽有一定的距离，如果每个峰都很宽，以至彼此重叠，还是不能分开。
这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程中的动力学性质有关。
因此要从动力学和热力学两方面来研究色谱行为。
色谱热力学理论主要研究溶质在色谱柱内的分离机制及分子特征与分离结果之间的关系；色谱动力学主要研究溶质在色谱柱中的运输规律，解释色谱流出曲线的形状、影响色谱区带展宽及峰形的因素，从而为获得高效能色谱分离结果提供理论指导，为峰形预测、重叠峰的定量解析以及选择最佳色谱分离方法奠定理论基础。
先复习一下仪器分析的重点——色谱分析的三大理论。
1相平衡理论相平衡理论认为溶质在流动相和固定相之间达到平衡。
分配（吸附）色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次的分配（吸附-脱附）过程，在一定温度和压力下，组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的浓度之比K分配系数，分配系数是由组分在两相的热力学性质决定的。
在一定温度下，分配系数K小的组分在流动相中浓度大，先流出色谱柱。
K=Cs/Cm lnK=-△Gm/RTc由上式可以看出分配系数和温度呈反比，升高温度，分配系数变小，组分在固定相的浓度减小，可缩短出峰时间。
分配比κ又称容量因子，它是在一定温度和压力下，组分在两相间分配达平衡时，分配在固定相和流动相中的质量比κ=ms/mm，κ越大说明组分在固定相中的量越多，相当于柱的容量越大，因此又称分配容量比或容量因子。
高效液相的使用原理
原理高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。
高效液相色谱基本常识
被分离组分在柱中的洗脱原理Ⅱ基本概念和理论一、基本概念和术语1.色谱图和峰参数⊕色谱图（chromatogram）--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号－时间曲线，又称色谱流出曲线（elution profile）.⊕基线（base line）--流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴。
⊕噪音（noise）――基线信号的波动。
通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。
⊕漂移（drift）基线随时间的缓缓变化。
主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
⊕色谱峰（peak）--组分流经检测器时相应的连续信号产生的曲线。
流出曲线上的突起部分。
正常色谱峰近似于对称性正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。
不对称色谱峰有两种：前延峰（leading peak）和脱尾峰（tailing peak ）.前者少见。
⊕拖尾因子（tailing factor,T）--T=B/A,用以衡量色谱峰的对称性。
也称为对称因子（symmetry factor）或不对称因子（asymmetry factor）《中国药典》规定T应为0.95～1.05。
T<0.95为前延峰，T>1.05为拖尾峰。
⊕峰底――基线上峰的起点至终点的距离。
⊕峰高（Peak height,h）――峰的最高点至峰底的距离。
⊕峰宽（peak width,W）--峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。
W=4σ。
⊕半峰宽（peak width at half-height,Wh/2）--峰高一半处的峰宽。
W h/2＝2.355σ。
⊕标准偏差（standard deviation, σ）--正态分布曲线x=±1时（拐点）的峰宽之半。
正常峰宽的拐点在峰高的0.607倍处。
标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中的分散程度。
7 塔板理论
C＝Cs＋Cm
对于填充柱，固定相传质阻力系数Cs为：
0.01k dp Cs 2 (1 k) Dm
2
2
式中k为容量因子。由上式看出，固定相传质阻力 与填充物粒度则的平方成正比、与组分在载气流中的 扩散系数见成反比。因此，采用粒度小的填充物和相 对分子质量小的气体（如氢气）做载气，可它Cs减小 ，提高柱效。
形象地如图
A =σ12 /L = 2λdp
dp：固定相的平均颗粒直径； λ：固定相的填充不均匀 因子。
上式表明，A与填充物的平均直径dp的大小和填 充不规则因子λ有关，与流动相的性质、线速度和组
分性质无关。为了减少涡流扩散，提高柱效，使用细
而均匀的颗粒，并且填充均匀是十分必要的。对于空
心毛细管，不存在涡流扩散，因此A＝0。
由 n= σ 2 / l 2
代入
H=L / n
2 2 2 2 L 2 1 2 3 4 H n L L
将上面公式总结，即可得气-液色谱速率板高方程：
2Dm 0.01k 2 dp2 2 k df2 H 2dp [ ]u 2 2 u (1 k) Dm 3 (1 k) Dl
σ2 = σ12 + σ22+σ+32 +σ42 因为H=σ2 /L，所以理论塔板高度H：
2 2 1 2 n H 2 L L L
H是单位柱长的分子的总离散度，是单个分子离散 度的统计概念。我们只要找出影响峰形展宽的各种因素 就能导出具体公式。
① 涡流扩散项 A
在填充色谱柱中， 当组分随流动相向柱出 口迁移时，流动相由于 受到固定相颗粒障碍， 不断改变流动方向，使 组分分子在前进中形成 紊乱的类似“涡流”的 流动，故称涡流扩散，
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
高效液相色谱法(HPLC)简介
高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次 差别： 是检测手段和输液设备。
经典液相色谱 固定相： 粒度：60~600μｍ（多孔） 柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻 力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。 只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节 高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易 分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性 物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。 涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品 及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境 （2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项 鉴别：519项 杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为 反映各国药典先进性的重要指标之一。
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1.塔板理论的基本假设
塔板理论是Martin和Synger首先提出的色谱热力学平衡理论。
它把色谱柱看作分馏塔，把组分在色谱柱内的分离过程看成在分馏塔中的分馏过程，即组分在塔板间隔内的分配平衡过程。
塔板理论的基本假设为：
1）色谱柱内存在许多塔板，组分在塔板间隔（即塔板高度）内完全服从分配定律，并很快达到分配平衡。
2）样品加在第0号塔板上，样品沿色谱柱轴方向的扩散可以忽略。
3）流动相在色谱柱内间歇式流动，每次进入一个塔板体积。
4）在所有塔板上分配系数相等，与组分的量无关。
虽然以上假设与实际色谱过程不符，如色谱过程是一个动态过程，很难达到分配平衡；组分沿色谱柱轴方向的扩散是不可避免的。
但是塔板理论导出了色谱流出曲线方程，成功地解释了流出曲线的形状、浓度极大点的位置，能够评价色谱柱柱效。
2.色谱流出曲线方程及定量参数（峰高h和峰面积A）
根据塔板理论，流出曲线可用下述正态分布方程来描述；
C=e 或C=e
由色谱流出曲线方程可知；当t=tR时，浓度C有极大值，Cmax=.Cmax就是色谱峰的峰高。
因此上式说明；①当实验条件一定时（即σ一定），峰高h与组分的量C0（进样量）成正比，所以正常峰的峰高可用于定量分析。
②当进样量一定时，σ越小（柱效越高），峰高越高，因此提高柱效能提高HPLC分析的灵敏度。
由曲线方程对V（0～∞）求积分，即得出色谱峰面积A＝×σ×Cmax =C0。
可见A相当于组分进样量C0，因此是常用的定量参数。
把Cmax=h和Wh/2＝2.355σ代入上式，即得A＝
1.064×Wh/2×h，此为正常峰的峰面积计算公式。
三、速率理论（又称随机模型理论）
1.液相色谱速率方程
1956年荷兰学者Van Deemter等人吸收了塔板理论的概念，并把影响塔板理论高度的动力学因素结合起来，提出了色谱过程的动力学理论——速率理论。
它把色谱过程看作一个动态非平衡过程，研究过程中的动力学因素对峰展宽（即柱效）的影响。
后来Giddings和Snyder等人在Van Deemter方程（H=A+B/u+Cu,后称气相色谱速率方程）的基础上，根据液体与气体的性质差异，提出了液相色谱速率方程（即Giddings方程）：
H＝2λdp++\s\up5(2p+\s\up 5(2p+\s\up 5(2f
2.影响柱效的因素
1)涡流扩散（eddy diffusion）.由于色谱柱内填充剂的几何结构不同，分子在色谱柱中的流速不同而引起的峰展宽。
涡流扩散项A=2λdp,dp为填料直径，λ为填充不规则因子，填充越不均匀λ越大。
HPLC常用填料粒度一般为3～10 um，最好3～5um，粒度分布RSD≤5％。
但粒度太小难于填充均匀（λ大），且会使柱压过高。
大而均匀（球形或近球形）的颗粒容易填充规则均匀，λ越小。
总的说来，应采用而均匀的载体，这种有助于提高柱效。
毛细管无填料，A=0。
2）分子扩散（molecular diffusion）.又称纵向扩散。
由于进样后溶质分子在柱内存在浓度梯度，导致轴向扩散而引起的峰展宽。
分子扩散项B/u=2rDm/u.u为流动相线速度，分子在柱内的滞留时间越长（u小），展宽越严重。
在低流速时，它对峰形的影响较大。
Dm为分子在流动相中的扩散系数，由于液相的Dm 很小，通常仅为气相的10-4～10-5，因此在HPLC 中，只要流速不太低的话，这一项可以忽略不计。
r一般在0.6～0.7左右，毛细管柱的r＝1。
3）传质阻抗（mass transfer resistance）。
由于溶质分子在流动相和固定相中的扩散、分配、
转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，这一时间上的滞后使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。
液相色谱的传质阻抗项Cu又分为三项。
①流动相传质阻抗Hm＝Cmd2pu/Dm，Cm为常数。
这是由于在一个流路中硫路中心和边缘的流速不等所致。
靠近填充颗粒的流动相流速较慢，而中心较快，处于中心的分子还未来得及与固定相达到分配平衡就随流动相迁移，因而产生峰展宽。
②静态流动相传质阻抗Hsmd2pu/Dm,Csm为常数。
这是由于溶质分子进入处于固定相孔穴内的静止流动相中，晚回到流路中而引起峰展宽。
Hsm对峰展宽的影响在整个传质过程中起着主要作用。
固定相的颗粒越小，微孔孔径越大，传质阻力就越小，传质速率越高。
所以改进固定相结构，减小静态流动相传质阻力，是提高液相色谱柱效的关键。
Hsm和Hsm都与固定相的粒径平方d2p成正比，与扩散系数Dm成反比。
因此应采用低力度固定相和低粘度流动相。
高柱温可以增大Dm，但用有机溶剂作流动相时，易产生气泡，因此一般采用室温。
③固定相传质阻抗Hs＝Csd2fu/Ds（液液分配色谱），Cs为常数，df为固定液的液膜厚度，Ds为分子在固定液中的扩散系数。
在分配色谱中Hs与df 的平方成正比，在吸附色谱中Hs 与吸附和解吸速度成反比。
因此只有在厚涂层固定液、深孔离子交换树脂或解吸速度慢的吸附色谱中，Hs才有明显影响。
采用单分子层的化学键合固定相时Hs可以忽略。
从速率方程式可以看出，要获得高效能的色谱分析，一般可采用以下措施：①进样时间要短。
②填料粒度要小。
③改善传质过程。
过高的吸附作用力可导致严重的峰展宽和拖尾，甚至不可逆吸附。
④适当的流速。
以H对u作图，则有一最佳线速度uopt,在此线速度时，H最小。
一般在液相色谱中，uopt很小（大约0.03～0.1mm/s）在这样的线速度下分析样品需要很长时间，一般来说都选在1mm/s的条件下操作。
⑤较小的检测器死体积。
3.柱外效应、
速率理论研究的是柱内峰展宽因素，实际在柱外还存在引起峰展宽的因素，即柱外效应（色谱峰在柱外死空间里的扩展效应）。
色谱峰展宽的总方差等于各方差之和，
即：σ2＝σ2柱内+σ2柱外+σ2器它
柱外效应主要有低劣的进样技术、从进样点到检测池之间除柱子本身以外的所有死体积所引起。
为了减少柱外效应，首先应尽可能减少柱外死体积，，如使用“零死体积接头”连接各部件，管道对接宜成流线型，检测器的内腔体积应尽可能小。