遗传标记
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（2）显性遗传，不能鉴别杂合子和纯合子； （3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术； （4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低； （5）实验重复性较差，结果可靠性较低。
5、AFLP
Amplified fragment length polymorphisms 扩增片段长度多态性，1993 年由荷兰的Zabean 和 Vos 等发明的。
人们对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行
研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的
限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR
II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II
和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可
体外连接的基因片段。
限制性内切酶的类型
源和性质可分为cDNA探针、基因组DNA探针、RNA
探针等。
原位杂交的类型
菌落原位杂交（colony
斑点杂交法（Dot
in situ hybridization） blot）
blot）
blot）
Southern印迹杂交（Southern
Northern印迹杂交（Northern
组织原位杂交（Tissue
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4~6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别6个核苷酸序列：
5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并
序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，
产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5′-CCC↓GGG3′）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突 出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别 序列后产生两个互补的粘性末端。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的
DNA序列或蛋白质。 狭义的分子标记是指DNA标记，指能反映
生物个体或种群间基因组中某种差异的特 异DNA片段。
分子标记的优点
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、
各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制； （2）数量多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性，能区别纯合体和杂合体。
二、遗传标记的类型
形态标记(morphological markers)
细胞学标记(cytological markers)
生化标记(biochemical markers)
分子标记(molecular markers)
形态标记：能够用肉眼识别和观察，并能 明确显示遗传多态性的外部形态特征。
将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后，产生的 片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来，并通过5′端与接
头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段，从而形
成指纹图谱的分子标记技术。
AFLP的操作步骤
（1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA
（2）DNA片段两端连接上特定的接头
（3）半特异性引物选择性扩增
3、原位杂交
原位杂交就是利用放射性或非放射性标记 的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检 测系统在组织、细胞及染色体上检测特异 DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、 简便的研究基因定位和表达的方法。
原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待 测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未 克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。 核酸探针是指用放射性同位素、非放射性荧 光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列 发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来
探针的制备主要采用缺刻平移法、随机引物
法、末端标记法。
探针的标记物分为同位素标记和非同位素标
记两大类，前者标记物一般为3H 、35S或32P，
后者有生物素或地高辛的间接标记或利用罗
丹明对探针分子进行直接标记。
切口平移法
原理：DNA酶I在Mg2+离子存在时，能在双链DNA的各股单链
的不同位置上造成随机切口，然后在存在着一种已标记 dNTP底物的体系中用大肠杆菌聚合酶I（pol I）进行5’→3’ 修复合成，在这个反应过程中将已标记的DNTP合成进DNA链 中。
限Fra Baidu bibliotek性片段的选择性扩增
PCR扩增片段的限制性酶切，如CAPs
4、基于单核苷酸多态性的DNA标记
SNP (Single nucleotide polymorphism) 单核苷酸多态性
主要的分子标记
1、RFLP
RFLP，限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphisms ），1980 年Botesin 提出的，是第一种被用于作 图研究的DNA标记。 根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基 发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶
3’ 端 标 记 时 ： 用 未 端 转 移 酶 催 化 已 标 记 的 dNTP加到寡核苷酸的3’端，成为标记探针；
生物素光照法
光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的 碱基发生化学反应，与核酸形成牢固的共价 结构，再借助于酶的显色反应，即可显示杂 交的位置。
4、RAPD
Random amplified polymorphic DNA ，随机
限制性内切酶可分为三类：I、Ⅱ和III类。I类和III 类酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用和 依赖于ATP的切割。I类酶结合于识别位点并随机的切 割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切 割DNA分子，然后从底物上解离。
Ⅱ类酶由2种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限 制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独 立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。
生化标记的优点：一是表现近中性，对生物经济性状一般没
有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较 小。
生化标记的缺点：一是可用标记数量少，二是染色方法和电
泳技术有一定难度。
理想的遗传标记应具备的特点
遗传多态性高; 检测手段简单快捷，易于实现自动化; 遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基因的3种基因 型。 标记遍布整个基因组； 准确性，能正确反映动物的真实遗传，即标记是经济性状基 因，还是与影响重要性的性状连锁。 实验重复性好（便于数据交换）； 开发成本和使用成本尽量低廉；
in situ hybridization）
in situ hybridization)
基因组原位杂交（Genome
原位杂交技术主要步骤：
材料处理及细胞样品的固定；
样品的制备和预处理； 探针的制备和预杂交； 探针及样品的变性； 杂交温育； 检测杂交信号，进行结果分析。
探针制备技术
切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行
检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多 态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。
限制性内切酶
（restriction endonuclease, RE）能特异地结合于 一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其 附近的特异位点上，并切割双链DNA的一种核酸内 切酶。
染色体数量：单体、缺体、三体、双三体、四体；
染色体结构：缺失、易位、倒位、重复等
某人的染色体组成为47,XXY。该人发生 了下列哪种染色体畸变? A．双三体 B．缺体 C．三体 D．重复
细胞学标记的特点
不易受环境影响，呈孟德尔方式遗传。
多态性集中表现在染色体高度重复DNA结构的异染色质所 在的部位。
原位杂交
2、基于PCR的DNA标记
单引物PCR标记：RAPD、ISSR
双引物选择性扩增的PCR标记：AFLP
通过克隆和测序来构建特殊双引物的PCR标记： SSR、SCAR、STS
3、基于PCR和限制性内切酶相结合的DNA标记
AFLP (Restriction fragment length polymorphisms)
2、DNA指纹
将个体的染色体DNA用限制性内切酶消化，
分离得到不同大小的DNA片段，再以重复序列
中的共有序列作为核酸探针进行杂交，对所得
到不同生物个体相似DNA片段的带型图谱（即
DNA指纹图谱）进行分析的方法。该技术可有 效地应用于遗传分析、法医和亲子鉴定等。
DNA指纹图谱的特点
1、多位点性 2、高变异性 3、简单而稳定的遗传性
限制性内切酶的命名
命名时，依次取宿主属名第1字母，种名头2个字母， 菌株号，然后再加上序号（罗马字）。如 HindⅢ
限制性内切酶， Hin 指来源于流感嗜血杆菌， d 表
示来自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序号。在同一品系细菌中 得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶， 可以编成不同的号，如EcoR I、EcoR II、 HindII、 HindIII、HpaI、HpaII、MboI、MboI等。
SSR标记的原理
微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列。
SSR 标记应用最为广泛，在水稻基因组中已经公布
了2740 个SSR 标记，平均每157 kb 就有1 个SSR
遗传图谱
转录图谱
HGP的主要任务
0.7 cM 或 kb
4张图：
物理图、 转录图
物理图谱
序列图谱
遗传图 、序列图
100 kb STS map
第2章 遗传标记
遗传标记的概念及特征
遗传标记的类型 主要的分子遗传标记
分子遗传标记的应用
一、遗传标记的概念及特征
遗传标记(genetic marker): 指可追踪染色体、 染色体某一节段、某个基因座在家系中传递 的任何一种遗传特性。 遗传标记的基本特征：可遗传性、可识别性。
（二）分子标记的类型
1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记
RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) 限制性片段长度多态性 VNTR (Variable number of tandem repeats) 可变数串联重复序列标记
ISH (In situ hybridization)
细胞遗传标记经常伴有对生物有害的表型效应，难以获得相 应的标记材料，或者观测和鉴定比较困难；需要花费较大的
人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体
变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。
生化标记：是指以生物体内的某些生化性状作遗
传标记，如血型、血清蛋白、种子贮藏蛋白、同
工酶和等位酶等。
随机引物合成法
用一些随机引物和探针DNA片段一起加热变性，退 火后，引物与单链DNA互补结合，再在大肠杆菌聚 合酶I的作用下，按碱基互补配对的原则不断在其3’ 端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的探针片 段。
末端标记法
标记的是线性DNA或RNA的5’端或3’端。 5’端标记时：先用碱性磷酸酶切除5’端的磷酸 基团，然后用 T4 多聚核苷酸激酶催化标记的 ATP连接到DNA片段5’端，从而使DNA片段成为 标记探针；
扩增的多态性DNA。由美国科学家Wiliams
和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任
意引物PCR。
基本原理：用一个或两个随机引物（一般8-10个碱基）非定
点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。
RAPD标记的特点：
（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息，且引物
无种族特异性；
伯乐相马
按图索骥
优点：简单直观、经济方便； 缺点：标记数少，多态性低，易受环境条件
的影响，并且有一些标记与不良性状连锁。
细胞学标记：能够显示遗传多态性的细胞学特征。主 要指染色体核型、带型和数量特征的变异等，它们反 映了染色体在结构和数量上的遗传多态性。
染色体核型：数量、大小、随体、着丝粒位置等；
（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳
（5）凝胶转移
（6）放射自显影
6、SSR
简单序列重复长度多态性( simple sequence repeat lengt h polymorphism ,SSR)，Moore 等于1991 年结合 PCR 技术创立的。SSR是一类由几个（多为1-5个）碱 基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般 较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、 （AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数 的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异 性正是SSR标记产生的基础。
5、AFLP
Amplified fragment length polymorphisms 扩增片段长度多态性，1993 年由荷兰的Zabean 和 Vos 等发明的。
人们对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行
研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的
限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR
II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II
和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可
体外连接的基因片段。
限制性内切酶的类型
源和性质可分为cDNA探针、基因组DNA探针、RNA
探针等。
原位杂交的类型
菌落原位杂交（colony
斑点杂交法（Dot
in situ hybridization） blot）
blot）
blot）
Southern印迹杂交（Southern
Northern印迹杂交（Northern
组织原位杂交（Tissue
绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4~6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别6个核苷酸序列：
5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并
序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处切割，
产生平末端的DNA片段（如SmaⅠ：5′-CCC↓GGG3′）；有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突 出末端的DNA片段称粘性未端，如EcoRⅠ切割识别 序列后产生两个互补的粘性末端。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的
DNA序列或蛋白质。 狭义的分子标记是指DNA标记，指能反映
生物个体或种群间基因组中某种差异的特 异DNA片段。
分子标记的优点
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、
各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制； （2）数量多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性，能区别纯合体和杂合体。
二、遗传标记的类型
形态标记(morphological markers)
细胞学标记(cytological markers)
生化标记(biochemical markers)
分子标记(molecular markers)
形态标记：能够用肉眼识别和观察，并能 明确显示遗传多态性的外部形态特征。
将基因组DNA 用成对的限制性内切酶双酶切后，产生的 片段用接头(与酶切位点互补) 连接起来，并通过5′端与接
头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA 片段，从而形
成指纹图谱的分子标记技术。
AFLP的操作步骤
（1）限制性核酸酶双酶切基因组DNA
（2）DNA片段两端连接上特定的接头
（3）半特异性引物选择性扩增
3、原位杂交
原位杂交就是利用放射性或非放射性标记 的已知核酸探针，通过放射自显影或非放射检 测系统在组织、细胞及染色体上检测特异 DNA或RNA序列的一种技术，是一种直接、 简便的研究基因定位和表达的方法。
原位杂交的杂交双方是待测核酸序列及探针，待 测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未 克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。 核酸探针是指用放射性同位素、非放射性荧 光染料直接或间接标记的，能与特定的核酸序列 发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来
探针的制备主要采用缺刻平移法、随机引物
法、末端标记法。
探针的标记物分为同位素标记和非同位素标
记两大类，前者标记物一般为3H 、35S或32P，
后者有生物素或地高辛的间接标记或利用罗
丹明对探针分子进行直接标记。
切口平移法
原理：DNA酶I在Mg2+离子存在时，能在双链DNA的各股单链
的不同位置上造成随机切口，然后在存在着一种已标记 dNTP底物的体系中用大肠杆菌聚合酶I（pol I）进行5’→3’ 修复合成，在这个反应过程中将已标记的DNTP合成进DNA链 中。
限Fra Baidu bibliotek性片段的选择性扩增
PCR扩增片段的限制性酶切，如CAPs
4、基于单核苷酸多态性的DNA标记
SNP (Single nucleotide polymorphism) 单核苷酸多态性
主要的分子标记
1、RFLP
RFLP，限制性片段长度多态性（ restriction fragment length polymorphisms ），1980 年Botesin 提出的，是第一种被用于作 图研究的DNA标记。 根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基 发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶
3’ 端 标 记 时 ： 用 未 端 转 移 酶 催 化 已 标 记 的 dNTP加到寡核苷酸的3’端，成为标记探针；
生物素光照法
光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的 碱基发生化学反应，与核酸形成牢固的共价 结构，再借助于酶的显色反应，即可显示杂 交的位置。
4、RAPD
Random amplified polymorphic DNA ，随机
限制性内切酶可分为三类：I、Ⅱ和III类。I类和III 类酶在同一蛋白质分子中兼有修饰（甲基化）作用和 依赖于ATP的切割。I类酶结合于识别位点并随机的切 割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切 割DNA分子，然后从底物上解离。
Ⅱ类酶由2种酶组成：一种为限制性内切核酸酶（限 制酶），它切割某一特异的核苷酸序列；另一种为独 立的甲基化酶，它修饰同一识别序列。
生化标记的优点：一是表现近中性，对生物经济性状一般没
有大的不良影响；二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较 小。
生化标记的缺点：一是可用标记数量少，二是染色方法和电
泳技术有一定难度。
理想的遗传标记应具备的特点
遗传多态性高; 检测手段简单快捷，易于实现自动化; 遗传共显性，即在分离群中能够分离出等位基因的3种基因 型。 标记遍布整个基因组； 准确性，能正确反映动物的真实遗传，即标记是经济性状基 因，还是与影响重要性的性状连锁。 实验重复性好（便于数据交换）； 开发成本和使用成本尽量低廉；
in situ hybridization）
in situ hybridization)
基因组原位杂交（Genome
原位杂交技术主要步骤：
材料处理及细胞样品的固定；
样品的制备和预处理； 探针的制备和预杂交； 探针及样品的变性； 杂交温育； 检测杂交信号，进行结果分析。
探针制备技术
切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行
检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多 态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。
限制性内切酶
（restriction endonuclease, RE）能特异地结合于 一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其 附近的特异位点上，并切割双链DNA的一种核酸内 切酶。
染色体数量：单体、缺体、三体、双三体、四体；
染色体结构：缺失、易位、倒位、重复等
某人的染色体组成为47,XXY。该人发生 了下列哪种染色体畸变? A．双三体 B．缺体 C．三体 D．重复
细胞学标记的特点
不易受环境影响，呈孟德尔方式遗传。
多态性集中表现在染色体高度重复DNA结构的异染色质所 在的部位。
原位杂交
2、基于PCR的DNA标记
单引物PCR标记：RAPD、ISSR
双引物选择性扩增的PCR标记：AFLP
通过克隆和测序来构建特殊双引物的PCR标记： SSR、SCAR、STS
3、基于PCR和限制性内切酶相结合的DNA标记
AFLP (Restriction fragment length polymorphisms)
2、DNA指纹
将个体的染色体DNA用限制性内切酶消化，
分离得到不同大小的DNA片段，再以重复序列
中的共有序列作为核酸探针进行杂交，对所得
到不同生物个体相似DNA片段的带型图谱（即
DNA指纹图谱）进行分析的方法。该技术可有 效地应用于遗传分析、法医和亲子鉴定等。
DNA指纹图谱的特点
1、多位点性 2、高变异性 3、简单而稳定的遗传性
限制性内切酶的命名
命名时，依次取宿主属名第1字母，种名头2个字母， 菌株号，然后再加上序号（罗马字）。如 HindⅢ
限制性内切酶， Hin 指来源于流感嗜血杆菌， d 表
示来自菌株 Rd ， Ⅲ 表示序号。在同一品系细菌中 得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶， 可以编成不同的号，如EcoR I、EcoR II、 HindII、 HindIII、HpaI、HpaII、MboI、MboI等。
SSR标记的原理
微卫星DNA两端的序列是相对保守的单拷贝序列。
SSR 标记应用最为广泛，在水稻基因组中已经公布
了2740 个SSR 标记，平均每157 kb 就有1 个SSR
遗传图谱
转录图谱
HGP的主要任务
0.7 cM 或 kb
4张图：
物理图、 转录图
物理图谱
序列图谱
遗传图 、序列图
100 kb STS map
第2章 遗传标记
遗传标记的概念及特征
遗传标记的类型 主要的分子遗传标记
分子遗传标记的应用
一、遗传标记的概念及特征
遗传标记(genetic marker): 指可追踪染色体、 染色体某一节段、某个基因座在家系中传递 的任何一种遗传特性。 遗传标记的基本特征：可遗传性、可识别性。
（二）分子标记的类型
1、以DNA-DNA杂交为基础的DNA标记
RFLP (Restriction fragment length polymorphisms) 限制性片段长度多态性 VNTR (Variable number of tandem repeats) 可变数串联重复序列标记
ISH (In situ hybridization)
细胞遗传标记经常伴有对生物有害的表型效应，难以获得相 应的标记材料，或者观测和鉴定比较困难；需要花费较大的
人力和较长时间来培育，难度很大；同时某些物种对染色体
变异反应敏感；还有些变异难以用细胞学方法进行检测。
生化标记：是指以生物体内的某些生化性状作遗
传标记，如血型、血清蛋白、种子贮藏蛋白、同
工酶和等位酶等。
随机引物合成法
用一些随机引物和探针DNA片段一起加热变性，退 火后，引物与单链DNA互补结合，再在大肠杆菌聚 合酶I的作用下，按碱基互补配对的原则不断在其3’ 端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的探针片 段。
末端标记法
标记的是线性DNA或RNA的5’端或3’端。 5’端标记时：先用碱性磷酸酶切除5’端的磷酸 基团，然后用 T4 多聚核苷酸激酶催化标记的 ATP连接到DNA片段5’端，从而使DNA片段成为 标记探针；
扩增的多态性DNA。由美国科学家Wiliams
和Welsh于1990年分别研究提出的，又称任
意引物PCR。
基本原理：用一个或两个随机引物（一般8-10个碱基）非定
点地扩增基因组DNA，然后用凝胶电泳分开扩增片段。
RAPD标记的特点：
（1）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息，且引物
无种族特异性；
伯乐相马
按图索骥
优点：简单直观、经济方便； 缺点：标记数少，多态性低，易受环境条件
的影响，并且有一些标记与不良性状连锁。
细胞学标记：能够显示遗传多态性的细胞学特征。主 要指染色体核型、带型和数量特征的变异等，它们反 映了染色体在结构和数量上的遗传多态性。
染色体核型：数量、大小、随体、着丝粒位置等；
（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳
（5）凝胶转移
（6）放射自显影
6、SSR
简单序列重复长度多态性( simple sequence repeat lengt h polymorphism ,SSR)，Moore 等于1991 年结合 PCR 技术创立的。SSR是一类由几个（多为1-5个）碱 基组成的基序串联重复而成的DNA序列，其长度一般 较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、 （AT）n、（GGC）n等重复。不同遗传材料重复次数 的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异 性正是SSR标记产生的基础。