细胞培养中的细节问题.ppt

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细胞培养的注意事项

细胞培养的注意事项细胞培养技术是现代生物技术的重要组成部分，它广泛应用于生物医学研究、药物筛选、病原体繁殖和疫苗生产等方面。

然而，在进行细胞培养时，需要注意一些细节问题，以确保细胞的生长繁殖和培养结果的稳定性。

下面，就对细胞培养中需要注意的事项进行介绍。

一、无菌操作细胞鲜活度非常敏感，细胞培养最重要的是保持无菌状态，避免细胞感染，而这需要在实验室中采取无菌操作。

在一些细胞培养实验操作中，需要消毒实验器材，瓶口、瓶盖和培养皿盖等操作工具。

要确保使用的培养基和培养液都是无菌的。

在培养细胞时候，尤其要注意勿触碰到其它无菌品或样品。

二、选择适当的细胞种类生物体内细胞种类繁多，每一种细胞都有其特定的培养条件。

因此，选择最适合自己研究的细胞类型，比如从同一物种的组织细胞、肿瘤细胞、细菌、病毒中选取。

在选择种类时，要注意是否具有比较稳定的特性，易于培养、扩增、观察，同时可用于大量研究和应用，如肝脏细胞、淋巴细胞、上皮细胞等。

三、培养条件和培养基培养细胞需要准备培养基和培养条件。

培养基中必须含有所需的营养成分，而不同类型细胞所需营养物也各不相同，所以要选择适宜的培养基，如黄草酸-蛋白酶消化培养基、麦芽糖琼脂-方解石培养基等。

同时，还应注意控制培养条件，如细胞的生长条件、生长周期、接种密度、污染、氧气浓度调节、CO2浓度，以及培养时温度、湿度、光线和气体供应控制。

四、防止细胞污染细胞培养容易受到细菌、真菌、病毒、和其他污染物的污染，这不仅对培养的细胞产生破坏，也会对实验研究造成很大的干扰。

在进行细胞培养实验之前，要先将操作工具、培养皿、试管等器具进行消毒，然后再通风室中进行操作。

同时，也应注意实验室的环境要保持干净，衣着要规范。

五、监测细胞状态细胞状态监测是细胞培养实验的重要环节，实验者需要不间歇地检查细胞的状态，如生长状况、细胞形态、生长周期、污染情况等，如果出现细胞损伤、变异、感染等，应及时将污染的细胞删除，更换培养基和器具，努力保证培养状态的良好.细胞培养是较为复杂的实验，它需要实验者细心谨慎，把握好每一个环节。

种细胞细节控制

一、细胞传代细节控制1、细胞传代所使用一次性细胞培养克氏瓶在开封前应先逐瓶拧紧瓶盖后在开封，若一次性用不完一袋，将剩余培养瓶放入超净台内，或将自封口完全封闭后放入原箱内或整理箱内。

2、细胞传代前应仔细对其进行观察，除在显微镜下观察细胞形态密度确定传代比例外，还应仔细逐瓶对比观察营养液是否澄清，是否有浑浊现象。

3、在多瓶传代时为保证细胞质量，应将原细胞分瓶分组传代分装，培养液与与胰酶也应对应分组，并做好标记。

4、、传代用具准备应严格检查，10ml吸管与巴氏吸管在装筒时应检查筒内纱布是否放置、是否存在老旧掉渣现象，并定期对其进行更换。

5、在完成一天细胞传代工作时，应合理安排时间，在完成一项细胞传代时应视时对超净台进行10~15min的照射消毒。

6、细胞传代操作人员在操作时尽量不要离开超净台和细胞室，若要离开超净台，在重新开始操作时要对手部进行消毒，若要离开细胞室，在离开时应脱掉无菌服与手套，返回操作时穿好无菌服后，应对手部进行重新消毒。

7、在正常生产期间，任何时后，开启超净台隔离窗时，应先开启风机，在保证超净台内正压环境后在开启隔离窗。

8、在进行细胞传代操作时应注意各个操作细节，应特别注意因废液缸引起的污染，倾倒废液时，应注意废液流出速度与培养瓶高度，以防废液溅到培养瓶上，使用吸管打出废液时也应注意角度与力度，防止废液溅到吸管上。

二、细胞室内卫生安全1、操作前开启超净台紫外灯照射15~30min，同时可将营养液，胰酶等放入，用紫外线进行外壁消毒2、若营养液胰酶温度较低（刚从冷藏中取出），可让其基本恢复室温后再进行操作，为消化达到最好的程度，提高效率，可将胰酶置37℃培养箱内预孵。

3,、操作完后，清理超净台内杂物，用浸有新洁尔灭的丝光毛巾擦拭台面，将台面物品归类摆放整齐，用紫外灯照射15~30min。

4、操作完成后，应对细胞室内进行清场，用浸有消毒液的吸水拖把对细胞室内地面进行清洁。

废液缸内废液、杂物及垃圾桶内杂物及时清理。

细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项

【1】细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项细胞培养是生物学实验中常见的一项重要技术，它广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药理学等领域。

通过细胞培养，科研人员能够研究细胞的生长、分化、凋亡等生物学过程，同时也可以进行药物筛选、生物学效应观察等实验。

然而，细胞培养是一项复杂的工作，需要严格遵循一系列步骤和要求，并且需谨慎对待各项注意事项。

在本文中，我将以从浅入深的方式，全面探讨细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项，帮助你更深入地理解这一技术。

【2】细胞培养的具体步骤和要求让我们来了解细胞培养的具体步骤。

通常情况下，细胞培养的主要步骤包括：细胞分离、细胞计数、细胞传代、培养基准备、细胞接种、培养条件控制等。

具体来说，细胞培养的步骤包括收获细胞、细胞解聚、细胞计数、调整细胞密度、接种细胞、培养细胞、处理细胞等。

在进行这些步骤时，需要保持实验操作台面清洁整洁，常备所需培养工具、培养耗材和培养试剂，并且要准确记录实验过程中的重要参数和数据。

细胞培养的要求也是至关重要的。

要选择合适的细胞系，确保来源纯净、鉴定正确、培养活力好。

培养基的选用也十分重要，要根据不同细胞类型的需求来选择适当的培养基，并添加必要的生长因子、氨基酸、维生素等。

培养条件的控制也十分重要，包括温度、湿度、二氧化碳浓度、通风情况等。

细胞培养的灭菌和无菌操作更是必不可少，细胞培养过程中的任何污染都可能对实验结果产生影响。

【3】细胞培养的注意事项在进行细胞培养时，需要特别注意一些细节和注意事项。

要保持室内整洁，操作台面、培养箱、生物安全柜等工作台要保持干净，并且要经常消毒。

要做好个人防护工作，戴口罩、手套、工作服等，避免人体细胞对培养的影响。

要定期检查培养箱、生物安全柜等设备的运行情况，确保培养环境的稳定性和安全性。

对细胞的培养时间、传代次数、细胞密度等也需要严格控制，不可随意增加培养时间或传代次数，以免细胞出现突变或异常。

【4】对细胞培养的个人观点和理解从事细胞培养工作多年，我深知细胞培养的重要性和复杂性。

细胞培养板的选择和使用问题与解决方法-3

细胞培养板的选择和使用问题与解决方法-3问：看到很多讨论说 96孔四周不做数据处理，那么还是要加细胞或培养基吗？如果我把四周设为空白孔（不加细胞）作为阴性对照，可以用来调零或计算抑制率不？答：可用只加培养基组作为正常对照组，来计算细胞生存率=给药组MTT/正常组MTT×100%，余空可不加任何物质。

MTT不同与做 ELISA需要设立空白对照、阴性对照和阳性对照，这其中的空白对照一般用P BS，目的是去除板底效应。

实际上，对于96孔板的细胞培养可以采取一个方法来改变出现误差的情况，就是将你的分组打乱，不要让你同一组的细胞集中排在一个区域，尽量打乱，就可以了首先，分析原因，即必须知道在96孔板四周做数据处理会有什么影响。

因为96孔板的密封性比较良好，也就是说培养箱内空气中的O2是透过板四周很小的空隙进入培养板的，细胞代谢产生的CO2也是通过四周空隙从板内排出来的。

在板内外气体交换时，37度条件下，板内的水汽也被大量带出板外。

这样，就会造成96孔四周孔内的体积减少，如果细心一点，就会发现外外周孔内培养基的体积明显小于内部的体积。

因此，如果最外一周有细胞进行培养，则会因培养基成分的浓度偏高而对细胞有影响，同时也会因为体积变化在做加入药物干预实验时，药物浓度偏高而对测定结果有影响。

因此，在具体操作时，可以采用以下对策：知道原因，我们可以跟据实验情况选择PBS或D－Hanks溶液，因为外周加入这种成本低廉的溶液，一方面可以减少内部各孔中细胞培养液中水份的损失，另一方面，可以做为分析染菌等突发事故的原因，进行排查，找到染菌源头。

当然，因为作MTT时，你本身会做空白对照与阳性对照，所以你可以完全不用管本底带来的误差了（建议你采用中间列6个孔为空白对照组，剩下共有9组54个孔，正好可以做三个药，每个药可设高、中、低三个浓度；加细胞时，你采用随机加细胞法，反正60孔细胞你加满就可以放心去培养了！）。

2．细胞培养板与ELISA问：请教各位，做ELISA能否用培养板呢，有什么差别呢？答：应该用ELISA试验专用板子。

MTT试验的一些细节问题

MTT试验的一些细节问题MTT试验的一些细节问题细胞：细胞：1.选择适当的细胞接种浓度。

一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.药物浓度的设定。

一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。

根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。

切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。

在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4.培养时间。

200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。

做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。

6.理论未必都是对的。

要根据自己的实际情况调整。

7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。

调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。

对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。

8.避免血清干扰。

用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。

由于试验本底增加，会试验敏感性。

因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。

在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。

实验步骤贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。

[课件]动物细胞体外培养知识PPT

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3、细胞传代操作（1）先用酒精棉擦拭需要放入超净台的物品，然后将物品放入超净台进行操作。（2）无菌取样，通常检测细胞密度、活度、葡萄糖、乳酸，根据实验优化等还需要检测其他各项生化指标。（3）根据预先实验设计的传代密度或者稀释比例来添加新鲜培养基进行传代，记录代次。（4）在进行方瓶、滚瓶等大瓶传代时，需要两名实验员密切配合操作，并由监控员协助进行物品传递等工作。因此熟练各环节的细节操作对于保证无菌来说非常重要。
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一、基本概念

1、细胞培养：动植物细胞在体外条件下存活和生长，此时细胞不再形成组织，主要是指用来生产次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。 2、动物细胞体外培养的生长类型：贴附型和悬浮型。 3、动物细胞大规模培养技术：是建立在贴壁培养法和悬浮培养法的基础上，融合了固定化培养、流式细胞术、生物反应器技术等而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中控纤维培养等。
液氮中长期保存。
温度降低原则：达到4度，然后达到-20度冷冻状态，再转移到-70度，18h后，在液氮中保持。
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2、细胞复苏操作（1）登记要取用的细胞。（2）快速取出细胞放于准备好的37度水浴中，快速溶解。

（3）将溶解的冻存管细胞离心，根据细胞特性，选择合适的离心强度。
（4）酒精棉擦拭冻存管后放于超净台，将细胞沉淀用新鲜培养基重悬后臵于离心管中进行离心。洗涤步骤，去除 DMSO。（5）细胞用新鲜培养基传入培养瓶中。

化学限定培养基---不含蛋白水解物，均为已知化学结构。
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三、基本过程

1、从整个操作过程来说包括：（1）细胞小瓶培养---传代操作（2）细胞大规模培养---转瓶、反应器操作（3）细胞冻存和复苏---原则

包被细胞培养板的相关问题

培养板的包被及相关问题：为了适应不同的实验需要，可对培养板用不同的物质进行包被后使用，这其中有促进细胞黏附的，也有用于一些特殊检测需要的。

不同的实验目的可能具体的方案亦不同，根据需要灵活掌握。

(一)多聚赖氨酸包被：问：我要培养原代神经细胞培养，要用多聚赖氨酸铺细胞培养板，请问赖氨酸液怎么配，怎样铺扳子答：配制0.01%的多聚赖氨酸: 首先买来sigma 公司的多聚赖氨酸，如是25mg，就需要250ml三蒸水，用移液管将少量三蒸水加到多聚赖氨酸的小塑料瓶中，然后将溶解的多聚赖氨酸加到200ml左右三蒸水中，(已置烧杯中)。

最后加三蒸水达250ml，过滤除菌分装与小瓶中即可。

保存于-20度，近期用的话可放于4度冰箱内保存。

注意每一小瓶的量不要太满，若20ml的瓶子，只装15ml可，若太满，放于-2度有可能会将瓶子弄碎，因冻后体积增加。

(我就有这个教训) 另外烧杯，小瓶、移液管都要灭菌处理的，泡酸高压什么的。

我们用的是一种用注射器过滤的过滤器，一次性的。

一个能最多有效过滤200ml。

铺板的操作:首先要在消毒实验室，包括超净台，紫外消度20-30分钟。

消毒后30分钟进入实验室。

事先准备100ml三蒸水，经高压灭菌处理。

具体细节就不多说了。

首先打开板子，用消毒好的试管将0.01%的多聚赖氨酸加入每一孔中，大概每孔3-4滴吧。

将板子盖好放到培养箱中(37度 5%CO2)30分钟。

取出板子，用吸管将多聚赖氨酸吸出。

换吸管，加入三蒸水，冲洗三次，即将每孔内加入三蒸水，没过底，多点也行。

再将水吸出来。

反复三次。

注意换吸管，要无菌操作的。

最后将铺好的板子放于培养箱待用。

如果你做免疫组化，需要放小的玻片到孔内，就在加多聚赖氨酸之前用无菌的镊子将无菌的玻片夹到孔内即可。

问：PLL的分子量有3-5万，7-15万，15-30万几种，应怎样选择？？谢谢：）答：我们养神经细胞，用的是分子量3万到7万的pll 。

以PBS配成1mg/ml的母液，－20度保存。

关于细胞培养中的污染

细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。

或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。

CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。

并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。

待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。

孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。

其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。

预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml 的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。

，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

而且它不能用过滤的办法除去。

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。

Sigma公司的使用时用50ug/mlTylosin培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。

细胞培养常见细菌污染原因

细胞培养常见细菌污染原因细胞培养是生物学研究中常用的实验技术，用于研究细胞的生理、生化和分子生物学特性。

然而，细胞培养过程中常常会受到细菌污染的影响。

细菌污染会对细胞培养的可靠性和准确性产生不良影响，因此控制细菌污染是细胞培养实验中至关重要的一步。

细胞培养常见的细菌污染原因主要有以下几个方面：1. 操作不当：细胞培养的整个过程都需要严格的无菌操作，而操作不当是导致细菌污染的主要原因之一。

无菌操作包括更换培养基、移液操作、接种细胞等，如果在操作过程中没有严格遵守消毒和无菌操作规范，就会导致细菌的进入和繁殖。

2. 试剂和培养物污染：试剂和培养物是细胞培养中常用的重要物质，如果试剂和培养物本身存在细菌污染，那么在培养过程中就会引入细菌。

试剂如培养基、酶、胎牛血清等的批次变化或不良质量，都可能导致细菌污染。

此外，非无菌的操作也会导致试剂和培养物的污染。

3. 实验室环境污染：实验室环境中存在微生物的存在，如桌面、空气、实验器皿等都可能存在细菌。

如果实验室的环境清洁度不够高，容易造成细菌污染。

此外，实验器皿如培养皿、离心管等的洗涤和保存也需要保证无菌操作。

4. 人员因素：人员的操作能力和操作习惯也会影响到细菌污染的发生。

操作人员应该保持良好的个人卫生习惯，定期对手套、实验服等进行更换和清洗。

如果操作人员不注意操作细节，如不合理的移液操作、使用不干净的仪器等，都可能导致细菌的污染。

5. 培养器具污染：培养器具如试管、离心管、细胞培养板等在使用之前需要经过高温和化学消毒处理，以杀灭其中潜在存在的细菌。

然而，如果器具处理不彻底或者保存环境不好，就容易导致细菌的残留或再次感染。

细胞培养中细菌污染的危害是非常严重的。

首先，细菌污染会干扰细胞培养体系的稳定，导致无法准确观察和研究细胞的生理和生化特性。

其次，细菌代谢产物和细胞培养物中含有的抗生素等成分会干扰细胞培养的正常生长和发育，降低实验结果的可靠性和准确性。

此外，由于细菌的存在，还容易导致细胞死亡和污染的蔓延，对细胞培养的连续性和稳定性造成不可逆的伤害。

高中生物选修1微生物的实验室培养ppt(共54张PPT)

稀释涂布平板法
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。
微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
微生物的恒温培养
3类。
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后
分装前，要进行的是
。调整pH
（6）右表中各成分重量确定的原则
是依微生物的生长需要确定。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该
增加的成分
琼脂（或凝固。剂）
一、课题目标：
了解有关微生物及培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。
二、课题重点和难点：
如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构
青霉
生殖孢子生殖
直立菌丝营养菌丝
腐生生活
（二）培养基
培养基（培养液）是由人工方法配制
而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养
液。
1.培养基的类型
（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、
半固体培养基。（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。
（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。
芽孢又小又轻，可以随风飘散。
平板划线的操作方法
C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；
且体内一般不含有叶绿素.
寄生菌大部分病原菌
消毒与灭菌的概念及两者的区别
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。
有的碳源同时是能源，如葡萄糖；
掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。

免疫细胞培养细节

2015-4-12 学习细胞装袋CIK细胞（悬浮细胞，生长良好时偶尔会贴壁）培养第4天装袋进行扩大培养，T-75瓶内观察到培养基颜色为清亮的橙黄色，一旦污染则变成柠檬黄。

每两瓶T-75细胞装一个细胞培养袋，T-75每瓶50mL细胞，两瓶即100mL细胞装袋，再加300mL配好的III培养基。

每2-3天补一次液，补液按照细胞密度及数量级添加相应体积的培养基。

除了装袋时不留样本外，以后每次补液都要留样，留样加入T-25的培养瓶中培养。

最终培养的CIK细胞产品浓度要达到2-3×109个/mL。

DC细胞（贴壁细胞）培养每天都要加细胞因子刺激（3种各100微升），第五天加相应的抗原肽刺激致敏，第三天显微镜下观察DC细胞圆形，有极少的树突，第五天显微镜下观察细胞表面有较多的树突（细细的如树枝一样的）。

进入实验室准备及注意事项：0、脱掉外套，头发扎起，刘海扎起。

1、在准备间换拖鞋，洗手，打洗手液，手心手背手指间手腕洗干净。

将实验用品放进传递窗。

2、在一更换鞋。

3、在二更，登记进出记录（时间，事件，人员），手上喷酒精，晾干后，戴口罩和帽子，将头发完全用帽子盖住，手上喷酒精，两手抓住两衣袖穿隔离服，戴手套，喷酒精，进入风淋室，两手举起缓慢转圈30秒。

4、进入缓冲走廊。

5、将实验用品放进小推车，进入实验室。

进出都要确定关好门。

6、打开超净台，点燃酒精灯，用无纺布喷酒精擦拭传递窗带进来的物品（培养基等），放入超净台。

用注射器、吸管、移液管之前检查包装是否完好，若不小心将带包装的物品掉地上，则喷酒精擦拭后再放入超净台，若已经拆开包装后掉地上，则丢弃不用。

7、补液：将T-75培养瓶口在酒精灯上灭菌，拧松瓶盖，将培养基瓶口在酒精灯上灭菌，拧松瓶盖，拆开移液管包装，手指抓取移液管上端插入电动移液枪，吸取相应的培养基依次悬空加入T-75培养瓶（注意勿碰培养瓶瓶口，防止污染）。

补完液后将移液管扔掉，T-75瓶口拧紧，在酒精灯上灭菌，平放入小推车。

细胞培养教学中的常见问题及应对措施教育文档

细胞培养教学中的常见问题及应对措施细胞培养技术已经成为当今生命科学各研究领域的基本技术, 是生命科学工作者必备的实验技能。

细胞培养的成败受细胞生长的各种条件,个人操作手法、操作环境、使用器具等多种因素的影响[1] 。

在多年的教学实践中, 笔者发现细胞培养过程一些常见的问题直接影响到教学的顺利进行, 针对这些问题,笔者采取了一些应对措施, 取得了较好的效果。

1 细胞培养教学中的一些常见问题1.1培养的细胞易被污染离体培养的细胞没有抗感染能力, 因此防止污染是细胞培养成败的关键。

笔者在教学中发现因各种因素导致学生培养的细胞被污染的比例达30%~40%。

1.2细胞培养对操作环境要求高, 不易组织教学细胞培养需要在无菌室的超净台中进行, 空间较小, 教师无法面对大量的学生进行实验示教, 因此在组织教学上有一定的困难。

1.3实验过程较长, 操作步骤多, 不易监控细胞培养实验的特点是实验的前期准备工作多, 实验过程长操作步骤多。

进行一轮完整的实验, 往往需数天时间, 而且在实验过程中, 学生来做实验的时间不固定, 因此教师不容易对学生的实验全过程进行监控。

1.4实验评价标准单一, 不适于这一类实验的教学以往对学生细胞培养实验的评价是以学生培养的细胞的生长状况和实验报告为依据, 其缺陷是只注重结果而忽视实验的过程,而学生是否真正掌握细胞培养技术, 主要体现在实验的过程中。

笔者曾在中国科学院生物物理研究所、北京大学医学部、解放军传染病研究所等国内一些重点实验室学习和进修, 虽然细胞培养只是这些实验室最基础的一种技术, 但其做细胞培养实验的一些有益的经验非常值得参考和借鉴。

笔者针对在教学中学生经常出现的一些影响实验教学的问题, 综合这些经验, 提出了相应的处理对策。

2 应对措施2.1完善细胞培养室设施, 规范实验操作步骤2.1.1细胞培养室应单独隔离出来专用, 能建立一定清洁级别的培养室是最好的, 考虑到用于教学的实验室需要较大的面积, 可能不易达到这样的清洁级别要求, 但至少要有一个洁净的环境和隔离出一个专用的无菌区[2] 。

细胞培养中无菌操作的要求和注意事项

细胞培养中无菌操作的要求和注意事项细胞培养中无菌操作的要求和注意事项细胞培养是现代生物学中不可或缺的研究手段之一，而无菌操作是细胞培养的基础，但是在实际操作中我们可能面临着许多不同的挑战。

本文将从材料准备、无菌环境、操作要求和注意事项等方面，为读者呈现一些关于细胞培养中无菌操作的基本知识和注意事项。

一、材料准备在进行细胞培养之前，首先要准备好一系列的培养物和材料。

这其中的细节非常重要，因为若未经过足够净化、消毒、或者已经超过了过期日期，就会影响细胞的生长和繁殖。

你需要注意以下几点：1. 无菌哺乳牛血清：血清最好是由经典的公司购买并确保无菌，并且应在低温下储存。

2. 玻璃仪器及塑料制品：使用新的、未污染的塑料制品和玻璃仪器。

3. 消毒工具和消毒剂：①折射率大于或等于1.49的70%的乙醇消毒剂。

② 2g/L的有效次氯酸钠，最好制备新的浓度。

③ 0.1%的氢氧化钠溶液是无菌操作的首选。

二、无菌环境一个无菌环境可以显著减少细菌和真菌感染的发生率。

以下三个因素是细胞培养室无菌操作的关键：1. 洁净的工作台面：必须将工作区域保持洁净干燥。

实验室内的空气含有许多菌落数量，而在工作室内，热气上升，带着灰尘和污染物质，堆积在培养物中，导致细胞的污染。

2. 过滤空气：在培养室内可以使用HEPA过滤器，过滤空气中的微生物。

3. 严格的个人防护措施：可以使用手套、口罩等工作装备，防止口咳嗽和其他体液通过呼吸进行感染。

三、操作要求在日常操作中，细胞培养技术无疑是最需要注意无菌操作的实验之一。

下面是一些操作要求的细节：1. 洗手：在接触细胞培养物或配制培养液之前，应先彻底洗手。

2. 消毒工具和仪器：使所有的工具，包括显微镜、显微镜片、移液器、离心机、传染性物质涂片、细胞培养器等，都要经过彻底的消毒。

3. 改变培养物：更换培养物前，一定要将培养瓶洁净清理，并将外部污染物完全清除。

4. 替换培养基：在更换培养基时，应注意平衡一下体积，尽量减少气泡的形成。

细胞培养的基本方法-V1

细胞培养的基本方法-V1
细胞培养是一种常见的实验技术，用于对细胞进行研究和应用。

细胞在培养的过程中需要提供适当的营养和环境条件。

下面将介绍细胞培养的基本方法。

一、准备培养皿和培养基
在细胞培养实验中，培养皿和培养基的选择非常重要。

培养皿可以选择培养板、培养瓶等不同类型的培养容器。

培养基是指包含细胞所需的营养成分和生长因子的液体。

根据不同的细胞类型，需要选择适当的培养基。

二、细胞的维护和传代
在进行细胞培养之前，需要对细胞进行维护和传代。

维护细胞需要提供适当的培养基和环境条件。

传代细胞需要进行细胞的剥离和重新种植。

细胞传代过多会导致细胞老化和变异，因此需要定期进行细胞株的新建。

三、细胞的分离和分化
细胞培养实验需要分离和分化细胞。

分离细胞可以通过消化酶和机械分离的方法。

分化细胞可以通过特定的培养基和生长因子的添加来实现。

四、细胞凋亡和衰竭
在细胞培养实验中，常常会出现细胞凋亡和衰竭的现象。

细胞凋亡是
指细胞自身程序性死亡。

细胞衰竭是指细胞逐渐停止生长并死亡的过程。

这些现象可能导致实验结果的不准确，因此需要注意细胞的状态和处理方法。

五、细胞的检测和观察
在进行细胞培养实验时，需要对细胞的状态进行检测和观察。

可以通过显微镜观察细胞的形态和数量，或者通过生化实验检测细胞的代谢和功能。

细胞培养实验是一项复杂的技术，需要按照规范操作和注意细节。

以上介绍的基本方法仅供参考，实验者在进行实验时应根据实际情况进行具体操作。

细胞培养单手操作方法

细胞培养单手操作方法细胞培养是一项重要的实验技术，对于成功进行细胞培养实验来说，良好的实验技术和规范的操作是至关重要的。

在进行细胞培养实验时，单手操作是非常常见的情况，在这种情况下，如何正确地进行细胞培养实验就显得尤为重要。

本文将从实验前的准备、器材选择、实验操作等方面进行详细介绍，帮助读者了解细胞培养单手操作的具体方法。

1. 实验前准备在进行细胞培养实验前，首先要进行充分的准备工作。

实验室应保持清洁，确保所有的器材和试剂都是干净的，并且要保证所有试剂的有效期。

同时，应对实验室进行消毒处理，以防止细菌、真菌等污染细胞培养的环境。

2. 器材选择在进行单手操作的细胞培养实验时，选用合适的器材非常重要。

首先，要选择适当大小的培养皿和培养瓶，以保证细胞的生长和扩增。

其次，要选择合适的培养基和补充物，如细胞因子、抗生素等，以促进细胞的生长和存活。

最后，在器材选择上，要使用一次性的器材，以减少交叉感染的风险。

3. 实验操作（1）操作前准备：洗手后，手部要经常进行消毒，消毒方法可以选择用70%的乙醇或1%的过氧化氢溶液消毒。

同时佩戴手套，以防止细胞和培养物的污染。

（2）细胞分离：在进行细胞分离时，使用离心管和移液管等设备。

在单手操作时，可以将离心管放置立式离心机中，使用一个手将离心管拧紧，另一个手将离心管放到离心机中进行离心。

（3）培养基更换：在进行培养基更换时，可以使用培养基抽吸器或移液器等设备，将培养基吸出或注入培养皿中。

在单手操作时，可以将培养基抽吸器或移液器等设备固定在一个平台上，用一个手操作移液管进行吸取或注入。

（4）细胞接种：在进行细胞接种时，可以使用一次性的移液管或吸管等设备。

在单手操作时，可以使用一只手将接种液吸入移液管中，然后用另一只手将细胞接种到培养皿中。

（5）观察细胞：在观察细胞时，可以使用显微镜等设备。

在单手操作时，可以固定显微镜，用一个手操作样品平台，将培养皿放置在显微镜下进行观察。

细胞培养室建立的细节问题

细胞培养室建立的细节问题前段时间,经受了几个月的时间,为试验室建了一个细胞培育间.目前这个细胞培育间运转良好,培育的神经元长了10来天,长势不错,已经可以认为细胞培育室建立胜利.在建立细胞培育间的过程中,遇到了很多问题,逐一解决后,觉得大家假如要建立细胞培育间,确定也会遇到很多相同的问题,所以将我遇到的问题整理出来.首先向大家推举一本书,个人认为是比较经典的《动物细胞培育-基本技术指南》科学出版社,英,R.I.弗雷谢尼.内容不多,但以下的资料大部分是书上找不到的.1.甲醛薰蒸:40％甲醛溶液(药用规格、福建三明化工总厂出品),用量30 ml ／m3,室内温度21～24℃,相对湿度75％～85％,加热薰蒸使蒸汽充满全室,关闭门窗1 h.甲醛水溶液为无色,具有剧烈刺激性气味的液体,可杀灭多数微生物,价廉,熏蒸消毒时不损坏衣服、家具、皮革、橡胶等.市售的甲醛水溶液中一般含37－40%的甲醛.其主要用法为:①熏蒸消毒:对室内消毒其用量为20－25%毫升/米,在加热该溶液时最好同时煮沸一壶水,使室内相对温度保持在70-90%左右,室内温度最好在20摄氏度以上,作用时间12-24小时.如消毒皮毛服装,甲醛水溶液的用量可加至125毫升/米,挂衣密度为每平方米3套为宜.熏蒸消毒时应密闭门窗.消毒后一般多用自然通风驱散甲醛气体,其需时较长,急于排出气体,可将25%氨水加热蒸发中和.氨水用量为所用甲醛水溶液的一半,中和时间为30分钟.②自然挥发: 将较大量的甲醛水溶液放入一放开容器中,室内温度保持在18摄氏度以上,同时室内喷水以保持相对湿度在70%以上,经16小时可达到室内消毒的目的.关于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比较:甲酸的毒性比甲醇大6倍,甲醛的毒性比甲醇大30倍.所以吃进4-10克甲醇,就能引起慢性中毒.它的毒性作用主要表现在损伤视力,使视力减退(不能矫正),视野缩小,以致双目失明,直到死亡.我的每个房间是7个平方,约20个立方.按书上的算要福尔马林300ml,高锰酸钾100g.高锰酸钾放入甲醛液体中后,在开头的3秒钟内没有反映,3秒钟以后,会产生大量烟气.所以一旦在甲醛中加了高锰酸钾请立刻离开灭菌室,并关上门.高锰酸钾放入甲醛液体中会使液体沸腾,所以反应要在比较大的大口径容器进行,本人用的是脸盆.甲醛气体毒性特别强,所以操作时肯定要带上防毒面具.2.关于紫外线:紫外线的穿透力量特别弱的,主要靠电离产生氧自由基来消毒.细胞培育室里面一些不能照耀紫外的物件可以用一般的材料盖住.如:玻璃和有机玻璃都可以的.紫外有些人认为大型精密的显微镜是不行以照紫外的,由于它们的镜头上涂的膜会被分解掉,但我特意问了我校光学系的老师,他们认为是没有关系的.紫外线在很多试验室被认为是起心理劝慰作用的.我参观过的一个细胞培育间他们的房间大约6平方米,但是只装了30W的紫外灯,但前提是他们有一个层流系统.个人认为,假如细胞培育间有层流系统,那紫外的作用是可以被忽视的,但假如没有层流系统,那么紫外的作用还是相当重要.此外,不要担忧紫外不能照耀到的角落,由于紫外杀菌功能除了紫外本身以外,还可以由产生的臭氧来完成.臭氧过量吸入的作用应当和双氧水的作用是一样的,个人认为或许有肯定的致癌性.所以紫外灭菌以后,最好过一个小时再进去.。

细胞培养-Protocol

细胞培养是一项常用的生物技术，其原理是基于细胞在适当的培养条件下能够维持存活和增殖的能力。

通过细胞培养，可以获得大量的细胞样本，用于研究、药物筛选、疾病治疗等应用。

以下是细胞培养的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。

一、原理细胞培养的基本原理是模拟细胞在生物体内的生长环境，提供细胞生存和增殖所需的基本条件。

这些条件包括适当的温度、湿度、营养物质（如氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等）和气体环境（如氧气、二氧化碳等）。

通过提供这些适宜的条件，细胞可以在体外环境中维持生存和增殖。

细胞培养中涉及的关键生物学过程包括细胞的贴壁、增殖和传代。

细胞的贴壁是指细胞在培养瓶内附着于瓶壁上的过程，这通常发生在细胞悬液加入培养液之后。

细胞贴壁后，会开始进行有丝分裂，进行增殖生长。

当细胞数量增加到一定程度时，需要将培养瓶中的细胞传代到新的培养瓶中，以维持细胞的适宜生长密度。

二、所需试剂和耗材细胞培养所需的主要试剂和耗材包括：1.培养基：为细胞提供基本的营养物质，如胎牛血清、氨基酸、葡萄糖等。

2.添加剂：包括抗生素、抗真菌药物等，用于防止培养过程中的污染。

3.培养瓶：用于细胞的培养，有不同的规格和形状。

4.移液器：用于吸取和转移细胞悬液和培养液。

5.离心管：用于离心收集细胞。

6.过滤器：用于过滤培养液中的杂质和颗粒。

7.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。

8.无菌操作台：用于进行无菌操作，防止污染。

三、实验仪器细胞培养常用的实验仪器包括：1.细胞计数器：用于细胞计数和细胞密度测量。

2.显微镜：观察细胞的生长情况和形态变化。

3.CO2培养箱：为细胞提供适宜的生长温度和气体环境。

4.高压灭菌器：用于消毒处理实验器材和试剂。

5.超净工作台：用于进行无菌操作。

6.分光光度计：用于测量细胞生长的生化指标，如蛋白质含量等。

四、准备工作在进行细胞培养前，需要进行以下准备工作：1.选择适当的细胞：根据实验需求选择适合的细胞，了解其特性、来源和培养条件。

细胞培养操作步骤

细胞培养操作步骤细胞培养是生物学实验中常用的一项技术。

通过细胞培养，可以研究细胞的生理活动、疾病发生机制以及药物的毒性和疗效等。

本文将为大家介绍细胞培养的基本操作步骤，帮助读者更好地进行细胞培养实验。

一、实验前准备1.1 材料准备首先，准备好所需的实验材料和试剂。

主要包括细胞培养基、培养皿、移液器、离心管、冰桶、显微镜和相应的培养器具等。

1.2 密切关注无菌操作细胞培养需要在严格无菌条件下进行，以避免细胞受到污染而影响实验结果。

实验前要正确佩戴防护服和洗手，确保操作台面、培养皿和使用的器械都经过高温高压消毒。

二、细胞的处理2.1 细胞种植将培养基加热至37摄氏度，并取出暖培养皿备用。

从细胞库中取出所需细胞的冻存管，在冰上迅速解冻，并将细胞转移到暖培养皿中。

注意，细胞数量应适量，不宜过多，否则会影响细胞的生长和适应。

2.2 细胞传代当细胞在培养皿中达到一定的密度后，需要进行传代操作，以保证细胞的健康和活力。

传代前，首先用生理盐水或PBS洗净细胞，并加入胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养皿表面脱落。

然后，将细胞转移到新的培养皿中，并加入新鲜的培养基。

三、细胞培养条件的控制3.1 细胞培养环境将细胞培养皿置于37摄氏度的培养箱内，以提供适宜的温度和湿度。

此外，还要保持适当的氧气和二氧化碳浓度，可以通过培养箱上的气体调节装置进行控制。

3.2 培养基的更新培养基中含有丰富的营养物质，但随着时间的推移，这些营养物质会逐渐降解消耗，影响细胞的生长。

因此，需要按照一定的时间间隔进行培养基的更新，保持细胞在新鲜和富有营养的环境中。

四、细胞观察与处理4.1 细胞观察使用相差显微镜或荧光显微镜观察细胞的形态、数量和状态。

可以观察细胞的生长情况、染色效果以及细胞内特定蛋白的表达等。

4.2 细胞处理根据实验需求，可以对培养的细胞进行不同的处理。

例如，给细胞添加特定的药物、激素或化合物，刺激细胞产生某种反应或模拟特定的生理环境等。

细胞培养注意细节

无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。

每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。

实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。

操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。

2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。

实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。

实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。

3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。

勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。

容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。

对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。

操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。

5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。

5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水请问工作浓度的胰酶是不是应保存在－20度？如果放在4度冰箱可以保存多久呢？是不是几个小时就会失去活性？平时放在-20度，分装在50毫升螺口管，用时拿一管放4度用。

聚焦显微成像细胞培养注意事项

聚焦显微成像细胞培养注意事项
1. 嘿，你知道吗，在进行显微成像细胞培养时，可千万别像个马大哈一样！比如说，你得时刻留意培养液的情况，这就好比给宝宝喂饭，得精心照顾着呀！要是培养液出了问题，那细胞可就遭罪啦！
2. 哎呀呀，细胞培养的时候温度可重要啦！这就像人要待在舒适的环境里一样，温度不合适，细胞能开心成长吗？你想想，要是大冷天让你待在冰窖里，你能舒服吗？
3. 喂喂喂，别忘了给细胞提供干净的“家”呀！就像我们自己住的地方要干净整洁，细胞的培养环境也得一尘不染呢，不然它们怎么能茁壮成长呢？
4. 嘿，你晓得不，操作的时候可得轻点儿呀！这细胞多脆弱呀，跟小婴儿似的，你能粗手粗脚对待它们吗？一不小心碰坏了咋办哟！
5. 哇塞，细胞培养过程中观察得仔细点呀！这就跟侦探找线索一样，稍有疏忽可能就错过重要细节啦，到时候后悔都来不及啦！
6. 哎呀呀，细胞培养的器具也得选对呀！这就好像战士上战场得拿趁手的武器，器具不合适，怎么能打好这场“细胞培养战”呢？
7. 嘿，可别乱给细胞加东西呀！你想想，乱吃东西会肚子疼，细胞也一样呀，不合适的添加物会让它们“生病”的呀！
8. 哇哦，细胞培养可真是个精细活儿呀！就像雕琢一件艺术品，得慢慢来，急不得，你说是不是？
9. 哎哟喂，培养细胞的时候要多用心呀！别三心二意的，这可是关系到实验成败的大事呢，你能不上心吗？
10. 嘿，记住啦，细胞培养的每一个环节都不能马虎呀！这就像建房子，一块砖没砌好可能整栋楼都不稳呢！
我的观点结论：细胞培养真的要特别注意各种细节，只有这样才能让细胞好好生长，实验才能顺利进行呀！。