革兰氏染色技术的相关探讨研究

甘肃科技纵横2012年（第41卷）第1期

革兰氏染色技术的相关探讨研究

白菊萍

（高台县人民医院，甘肃高台734300）

摘要：目的：深入了解革兰氏染色法的机制及相关学说，分析各影响因素，完善并改进简化方法，积极开展辅助鉴别技术，以期达到最快的速度和最高的结果准确率。方法：对处于不同生长期的细菌分别进行传统的革兰氏染色，快速革兰氏染色，三步法革兰氏染色，比较分析各方法的优缺点及影响因素。结果：传统方法制片110张，成功85张，成功率77.3%，制片染色时间8分钟；快速法制片72张，成功58张，成功率80.6%，制片染色时间4min；三步法制片88张，成功80张，成功率90.9%，制片染色时间5min。结论：改良的三步法革兰氏染色技术容易掌握，制片成功率高，染色需要的时间短。

关键词：革兰氏染色；影响因素；辅助鉴别；方法改进

革兰氏染色法是细菌学中最基本,最重要的鉴别染色技术。它是1884年由丹麦细菌学家Christain Gram 建立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进[1]。革兰氏染色法的基本步骤是：将干燥固定好的涂片先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如复红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），为革兰氏阴性菌[2]。革兰氏染色鉴定反应受多种因素影响，如染色液的质量及脱色剂乙醇含量，染色的PH环境，脱色的时间，另外对数期生长细菌反应典型而衰老或死亡G+菌结果呈G-反应[3]，染色可能出现革兰氏变性（阳性与阴性不规则出现），此种情况过于复杂影响因素太多，为了得到最高的准确率，必须对诸多影响因素加以分析，需要对该方法进行简化改进。

1革兰氏染色的影响因素

1.1培养菌的菌龄

革兰氏染色要求菌种被染色时处于对数增殖期，此时菌体的细胞壁的成分和结构最为典型,经革兰氏染液染色处理后,能典型正确地反映染色的结果，若菌体细胞未成熟或已老化,染色结果可能会出现完全相反的情况，造成假阳性或假阴性的产生。我们对不同培养时间的大肠埃希菌作了革兰氏染色试验分析。如表1。

表1不同培养时间大肠埃希菌的染色结果

我们对不同培养时间的肠球菌作了革兰氏染色试验分析如表2。

表2不同培养时间肠球菌的染色结果

由表1表2可见，培养时间对革兰氏染色结果影响巨大。其中，大肠埃希菌培养时间24h左右为宜，而肠球菌培养时间15h左右为宜。实验对比也从侧面反映出不同菌种对培养时间有不同的要求。

1.2涂片的厚度

涂片时，先在载玻片上滴加一滴生理盐水，再用灼烧过且冷却的接种环取少量培养基上的细菌与玻片上的盐水相混合，从中央逐步向外围涂开，厚度以肉眼稍觉浑浊即可。若涂片太厚，菌体在中央集中，影响观察效果。若涂片太薄，菌体过于稀少，观察时难以找到视野。用直径2mm的接种环培养24h的大肠埃希菌满环，半环，更少量，均匀涂片，直径12—15cm，革兰氏染色，实验结果如表3。

表3涂片厚度对染色结果的影响

表3结果表示，涂片菌膜过厚时，因大肠埃希菌密集成堆造成不易脱色或脱色不完全而常常呈G+反应；涂片薄而均匀能得到正确结果。

1.3媒染时间对染色结果的影响

对于G-菌而言，媒染时间过长容易造成假阳性。可能与媒染时间过长使结晶紫复合物和细胞结合过紧

染色制片编号12345678910菌种培养时间(小时)18202223242526283032革兰氏阴性表型数(%)708090100100100100100100100染色制片编号12345678910菌种培养时间(小时)9111314151617192124革兰氏阳性表型数(%)8085909510010090807060

涂片情况G-菌数涂片结果正确率（%）

满环1/250

半环2/370

更少量＞95/100约100

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有关。

1.4脱色时间对染色结果的影响。

革兰染色法是细菌学中最经典，应用最广泛的染色法之一。脱色是影响革兰氏染色的关键步骤，脱色时间长短直接关系到染色结果的准确性。规范的乙醇脱色使革兰氏阳性菌细胞壁脱水,肽聚糖层网状结构孔径缩小,通透性降低,从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。但通透性降低不等于无通透性,不易被洗脱不等于不被洗脱。因此,若脱色时间过长,革兰氏阳性菌也有可能被脱色,成为假阴性菌。同样若脱色时间不足,革兰氏阴性菌细胞壁的部分类脂质未被乙醇溶解,使结晶紫—碘的复合物不能被洗脱出来成为假阳性菌，初学者难以掌握。我们选择5s至90s的脱色时间范围,分7个时间分别进行试验。革兰氏阳性菌的试验结果见表4,革兰氏阴性菌的试验结果见表5。

表4肠球菌不同脱色时间的染色结果

表5大肠埃希菌不同脱色时间的染色结果

表4表5结果表示，革兰氏染色的最佳脱色时间是25s。

1.5干燥的温度

细菌涂片一般让它自然干燥，有时为了干燥快些，可以把涂片很小心地在酒精灯火焰上轻轻摆动，温度以不超过手背的耐受为限。若温度太高，细菌会发生菌体变形，影响结果观察。

1.6固定的操作

固定的目的是为了杀死细菌，使涂抹在玻片上的菌体很好地附着其上，防止被水冲掉，因为死的蛋白质比活的蛋白质着色力更强。因此固定时，玻片慢慢地在火焰上通过2-3次，使菌体受热附着在玻片上。当固定温度不够，菌体固着不够牢，则很易被洗脱。

2革兰氏染色辅助鉴别

长期实践表明，革兰氏染色常因各种因素造成误差，引起结果不稳定，如菌龄不同，操作方法不当等。为了提高结果的准确性，可采用氢氧化钠拉丝反应作为

辅助鉴别实验。本方法是：在干净的载玻片上滴1滴3g/dl NaOH，再从固体培养基上挑取一较大的菌落，把菌落放在NaOH液滴上，用接种环在液滴上研磨10-15s，然后将接种环提起，在黑色背景下观察；60s内出现细丝为拉丝反应阳性，不出现细丝为拉丝反应阴性，同时与革兰氏染色结果作对照比较。氢氧化钠拉丝阴性的细菌符合革兰氏阳性，氢氧化钠拉丝阳性的细菌符合革兰氏阴性。

3革兰氏染色改良方法。

3.1快速法

具体步骤是:（1）在固定好的涂片上，滴加结晶紫液2滴，再加入0.5mol/LNaHCO

3

缓冲液2滴，摇动3～5s后冲洗。（2）滴加碱性碘溶液几滴，摇动3～5s后冲洗。（3）滴加脱色剂液几滴，摇动3～5s后冲洗。（4）滴加碱性复红液几滴，摇动3～5s后冲洗，待干镜检。

3.2三步法

具体步骤是:（1）取少量菌种均匀涂片,干燥,固定;（2）结晶紫1min,水洗（3）碘液1min,水洗（4）0.4％复红酒精30s,水洗；（5）干后镜检。对几种革兰氏染色法进行了实验对比如表6。

表6革兰氏染色方法的比较

4总结与讨论

革兰氏染色法，是广大微生物工作者在微生物基础实验中最常用的方法之一，也会在未来的细菌学研究中扮演着重要角色；因此，熟练掌握，并且大胆创新革氏染色法有着非常重要的意义。进行革兰氏染色时，除操作正确适当外，更重要的是：对不同菌种选择适合菌龄，准确把握脱色时间，采用先进的三步法，并且必要时对结果辅助鉴别。

参考文献：

［1］俞树荣.微生物学和微生物学检验（第二版）［M］.北京:人民卫生出版社，2001：9~104.

［2］周德庆.微生物学教程［M］.北京:高等教育出版社, 1993，18~401.

［3］俞树荣.微生物学和微生物学检验（第二版）［M］.北京:人民卫生出版社，2001,9~104.

编号1234567

脱色时间（S）5101525406090

G+百分数100100100100807060

编号1234567

脱色时间（S）5101525406090

G-百分数708090100100100100

方法类型实验涂片数成功涂片数成功率（%）制片时间（min）

传统方法1108577.38

快速法725880.64

三步法888090.95

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