酶学分析技术优秀课件

特点：
若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方 成正比，为一级反应。
第二节 酶学分析的类型
➢工具酶：将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。 ➢偶联：工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。
分类：
工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类
表7-2 常用工具酶的名称及其缩写符号
线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％ 线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15％，否则判为非线性
（三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ）
进入非线性期的原因：
反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应 增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。
如 ALT测定 工具酶是LDH
二、 酶活性的测定方法
测定方法分类：
按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、 放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。
按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。
按照检测对象分类：分为直接法和间接法。
2
吸
3
光
度
1
A
1、定时法
原理：
t1
t2
时间t
图5-6 定时法的三种反应进程
名称
缩写符号
乳酸脱氢酶
LDH
苹果酸脱氢酶
MDH
6-磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PD
谷氨酸脱氢酶
GLDH
葡萄糖氧化酶GOD Nhomakorabea胆固醇氧化酶
COD
磷酸甘油氧化酶
GPO
过氧化物酶
POD
名称
缩写符号
己糖激酶 肌酸激酶 丙酮酸激酶 甘油激酶 脂蛋白脂肪酶 胆固醇酯酶 脲酶 肌酐酶
HK CK PK GK LPL CE
常用品工具酶主要是氧化还原酶类，部分 转移酶类和水解酶类。
酶学分析技术
什么是酶enzyme?
酶是生物体内活细胞合成的具有高效、 特异催化作功能的蛋白质。
目前将生物催化剂分为两类: 蛋白质酶 、 核酶（脱氧核酶）
几个有关名词
❖ 底物(substrate, S)：被催化的物质。
❖ 产物(product, P)：反应生成的物质。
❖ 酶促反应：酶催化的反应。
❖ 酶活力：酶所具有的催化能力。
定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1～t2）
产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反
应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。
特点： ➢优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要 保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。
二、酶活性单位
（一）酶活性单位
定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内 生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。 表示方法：
➢惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间） ➢国际单位IU（µmol/min） ➢Katal单位（mol/s）
1．惯用单位：
20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位
定义：酶活性（enzyme activity）也称为酶活力，指 酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成 量或底物的减少量。
表示方法：
v d[P] dt
或
v d[S] dt
式中v：反应速率，[P ]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。
注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的 生成量为好。
3．Katal单位
✓定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的 酶量。1Katal＝1mol/s。
IU与Katal单位的关系：1katal = 60×106U，1U = 16.67nkatal
三、酶促反应动力学
吸 光 度
A
以产物生成量（或反应 物减少量）为纵坐标、反 应时间为横坐标作图所得 到的一条曲线，称为反应 进程曲线（或反应时间曲 线、速率曲线、时间曲线）
✓特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测 定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较 少。
IFCC,2001年
2.国际单位IU（µmol/min）
37℃
✓定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol 底物转变为产物的酶量，为1U，1U=1µmol/min。
✓举例：
ALP的金氏单位（King） 氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）
金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。
卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径 1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.82 10-4μmol NADH为一个卡门氏单位
➢此阶段酶促反应速率基本保持恒定； ➢对底物而言，为反应速率与底物浓度[S]的零次方成正比的零级反应， 即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比 ； ➢此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。 ➢酶活性浓度越高，线性期就越短
线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受 的程度 。
非
线
延
性
滞
期
期
线
性
期
t1
t2
时间t
图5-1 酶促反应进程曲线
（一）延滞期（lag phase、延迟期 ）
特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟
吸 光 度
A
延 滞
非 线
期
性
期
孵延
线
育滞 期期
性 期
R1 R2 t1
t2
时间t
图5-1 酶促反应进程曲线
（二）线性期
特点：可代表酶促反应速度
转 氨 酶
A l a + α - 酮 戊 二 酸
丙 酮 酸 + G l u
丙氨酸
谷氨酸
常见酶类
❖ 丙氨酸氨基转移酶ALT或GPT ❖ 乳酸脱氢酶（LDH） ❖ 天冬氨酸氨基转移酶（AST或GOT） ❖ 肌酸激酶（CK） ❖ 5′-核苷酸酶（5′-NT) ❖ α -羟丁酸脱氢酶（α -HBD)
一、酶活性
工具酶的质量要求 工具酶的用量一般较多，故 要求工具酶来源广泛，价廉易得，纯度要求不 太高，可降低制备成本，但对工具酶中的杂质 也要有一定的限制，以保证工具酶有一定的比 活性，减少或避免一些能干扰测定的副反应。
NAD(P)＋或NAD(P)H偶联的脱氢酶及指示反应， NADH和NADPH在340nm有光吸收特性，可用紫 外分光光度计直接测定，另外，NAD(P)H还有强 烈荧光，其激发光波长为 365nm， 荧光波长 为 460nm，荧光法的灵敏度比分光光度法高。