生化方法高效提取黄豆粉中_淀粉酶
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固定2.1的操作条件不变，分 别 考 察 了 盐 、表 面 活 性 剂、还原剂/螯合剂对β-淀粉酶提取的影响，以便确定正交 试验的合理因素。 2.2.1 盐
在酶的提 取 过 程 中 ，维 持 一 定 的 离 子 强 度 可提高酶 的回收率。这是因为（1）稀盐溶液中的盐离子能与蛋白质 部分结合，可稳定酶蛋白的构象；（2）稀盐溶液增加了浆 料的离子强度，能促进酶蛋白溶解。基于此，试验考察了 NaCl和Na2SO4对酶的提取效果（见图1）。研究表明，一定 量的NaCl和Na2SO4可加大黄豆粉中β-淀粉酶的溶出率。当 加入0.1mol/L NaCl时，可使酶产量提高10%；而要达到相 同的酶产量，Na2SO4的用量要提高为0.15mol/L。但提取酶 蛋白时，盐用量不宜过大，否则会增加后续脱盐费用。为 此，在后续正交试验中，选用NaCl为一个考察因素。
表1 不同用量的表面活性剂与浆液中酶提取关系 Table 1. Relationship between surfactants and extraction contents of
β-amylase
用量/% 6501 PVP Tween-80 AES SDS CTAB
0.20
107
109
104
105
98
103
0.50
108
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103
92
97
97
0.80
109
104
100
87
96
97
注：未使用添加剂提取值26.80U/mL为100。（下同）
2.2.3 还原剂/鳌合剂 β-淀粉酶的催化活性基团至少含有一个或多个半胱
氨酸（Cys），该基团易被金属离子或氧化剂所屏蔽。所以， 提取该酶时要加入一定量的还原剂或螯合剂以排除重金 属离子和氧化剂的干扰，进而提高回收率。6种还原剂/ 鏊 合 剂 对 β- 淀 粉 酶 提 取 的 影 响 结 果（表 2）表 明 ，EDTA （螯 合剂）、L-胱氨酸和巯基乙醇能使酶产量略有增加； NaHSO3对酶提取贡献不大；适当的Na2SO3能提高约10% 的β-淀粉酶产量。为此，后续正交试验选用Na2SO3为一个 因素来考察。
Abstract: The extraction conditions of β-amylase from soybean powder were investigated. The effects of salts, surfactants and reducing reagents on extraction efficiency of β-amylases from soybean powder were discussed. The extraction conditions were optimized by orthogonal test as follows: ratio of powder to water 1:10, adding 1 mol/L NaCl, 0.2% (w/v) alkylolamide and 0.5%（w/v）Na2SO3, 0.5 h extraction at 50℃ and pH 6.5. The β-amylase yield was 34.78 U/mL, which was 29.8% higher than that extracted without any additives (26.80 U/mL). Key words: β-amylase; soybean powder; extraction; enzyme activity
创新与借鉴
中国酿造
2010 年 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 7 期
总第 220 期 ·143·
生化方法高效提取黄豆粉中β-淀粉酶
张 剑1，3，李 睿2，张开诚1，张选民1，周晓荣1，
(1.武汉工业学院 化学与环境工程学院，湖北 武汉 430023；2.武汉工业学院 生物与制药工程学院， 湖北 武汉 430023；3.湖北省农产品加工工程技术研究中心，湖北 武汉 430023)
黄豆（市售），晒干后经机械粉碎成粉，备用；可溶性淀 粉（洛阳化学试剂厂，AR）；3，5-二硝基水杨酸（湖州菱湖 望菱试剂厂，CP）；聚乙烯吡咯烷酮K 30（PVP，上海化学试 剂厂，进口分装）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，上海源 聚生物科技有限公司，AR）；十二烷基磺酸钠（SDS，上海 英鹏化工有限公司，CP）；其他试剂均为市售分析纯。
尽管有从细菌中提取β-淀粉酶的报道（如芽孢杆菌 Bacillus[8]，耐热梭状芽孢杆菌Clostridium[9）] ，但从细菌中 得到的β-淀粉酶除将淀粉转化成麦芽糖外，还产生大量的 麦芽三糖，而来自植物的β-淀粉酶产生相对较多的麦芽 糖。因此更适合于用在目的为得到尽可能甜的和/可发酵 的产品方法里，而且，利用细菌发酵很难大规模化生产高 活力的β-淀粉酶。所以国内外工业生产β-淀粉酶均采用植 物原料[10]。
好。事实证明，一定量的烷基醇酰胺（6501）、聚乙烯吡咯烷 酮-30（PVP）和吐温-80等非离子型表面活性剂能有效地将 酶蛋白从浆液中分散开，同 时 还 能 达 到 使 酶 活 性 保 持 完 好的效果。
由于物种有别，从黄豆粉与黑豆粉中提取β-淀粉酶， PVP和SDS所起的作用大相径庭[14]。如从黑豆粉中提取β淀粉酶，SDS是较好的分散剂；而对于黄豆粉中提取则影 响甚微；PVP能较好地分散黄豆粉中β-淀粉酶，但用于分 散黑豆粉中的β-淀粉酶就欠妥。为此，在酶蛋白的分离过 程中，必须考虑物种的差异，以便选择合适的表面活性剂， 达到提高回收率的目的。
102
Na2S2O3
108
102
100
Na2SO3
106
111
112
L-胱氨酸
100
103
105
CH3CH2SH
98
106
103
EDTA
102
104
103
2.3 优化黄豆粉β-淀粉酶提取工艺的正交试验 根据以上的单因素试验结果，设计了6因素3水平正交
试验（表3），正交试验级差分析结果（表4）表明，影响黄豆 粉β-淀粉酶提取效果的因素主次顺序为C＞E＞A＞F＞
取一定量干黄豆粉料，按1∶6比例加水后，14000r/min打 浆15min。倒出浆液，用缓冲液（或蒸馏水）洗涤器皿。洗涤 液一并归入浆液，保持最终料水比1∶10。将浆液分装，加入 盐、表面活性剂、还原剂或螯合剂后，再调节酸度。于给定 温度条件下提取一段时间。提取液经双层纱布过滤，滤液 于4000r/min离心20min。取上清液0.1mL，测β-淀粉酶活力。 1.2.2 β-淀粉酶活力测定
创新与借鉴
中国酿造
2010 年 第 7 期
总第 220 期 ·145·
B＞D，最 佳 提 取 工 艺 条 件 为 A1B2C3D2E1F2，即 提取时间 0.5h，提取温度50℃，提取酸度pH6.5，NaCl 0.10 mol/L，烷 基醇酰胺0.2%（w/v），Na2SO3 0.5%（w/v）。在上述条件下， β-淀粉酶提取量为34.78 U/mL，与未使用任何添加剂的 提取效果（26.80U/mL）相比，提高近30%。
表2 还原剂/螯合剂与酶提取量的关系 Table 2. Relationship between reducing reagents / chelating reagents
and extraction contents of β-amylase
种类
用量/%
0.20
0.50
0.80
NaHSO3
99
99
附图 盐用量对β-淀粉酶提取量的影响 Attached figure. Relationship between salt concentration and extraction
content of β-amylases
2.2.2 表面活性剂 一定量的表面活性剂可以与细胞膜中的磷脂和脂蛋
白相互作用，使细胞膜的结构破坏，从而增加细胞膜的通 透性[14]。表1列出了6种表面活性剂对提取β-淀粉酶的影 响。一般来讲，阴离子型表面活性剂如脂肪醇醚硫酸钠 （AES）、十二烷基硫酸钠（SDS），阳离子型表面活性剂如 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等能破坏酶蛋白的氢键 和疏水键，进而使酶的结构变化，导致酶催化活性丧失。 所以，在提取酶的过程中，选用非离子型 表面活性剂较
关 键 词：β-淀粉酶；黄豆粉；提取；酶活力
中图分类号：Q556
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2010）07-0143-03
Biochemical approaches of increasing extraction productivity of β-Amylase from soybean powder
摘 要：研究了黄豆粉中β-淀粉酶的提取工艺条件。分别讨论了外加盐、表面活性剂、还原剂等对黄豆粉中β-淀粉酶提取量的影响。
并通过正交试验进一步优化了提取条件。即：料水比1∶10，外加1 mol/L NaCl，0.2%（w/v）烷基醇酰胺和0.5%（w/v）Na2SO3，于50℃和 pH 6.5提取0.5h，β-淀粉酶的提取量为34.78U/mL，与未使用任何添加剂的对照提取效果（26.80U/mL）相比，产量提高29.8%。
收稿日期：2010-03-24 基金项目：湖北省教育厅科学计划研究项目（B20081801） 作者简介：张 剑（1970-），男，湖北汉川人，副教授，主要从事酶制剂的提取分离纯化以及应用研究工作。
2010 No．7
·144· Serial No．220
China Brewing
Innovation and Knowledge Transfer
按文献[13-14]。酶活力定义：在50℃、pH 6.0条件下，每 分钟水解2%（w/v）可溶性淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶 量为一个活力单位（U）。 2 结果与分析 2.1 无添加剂条件下的提取
保持料水比1∶10（w/v）不变，通过正交试验和单因素 试验考察可知，在磷酸缓冲体系中，提取酸度pH 6.0、提取 时间0.5h和提取温度50℃是黄豆粉中β-淀粉酶提取的最 适条件，其提取量为26.80 U/mL。 2.2 有添加剂条件下提取
β-淀粉酶含多个巯基，且至少有一个巯基直接或间接 参与了酶的催化反应[5]。目前，从植物中提取β-淀粉酶多 采用含硫的还原剂[11-12]。本试验讨论了外加盐、表面活性 剂、还原剂等因素对黄豆粉中β-淀粉酶提取量的影响，并 通过正交试验进一步优化了提取条件，有望为指导工业 化生产提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器
全自动电光天平，pHS-3C数字酸度计，DF-101B集热 式恒温加热磁力搅拌器，多功能食品加工机，HH-2数显恒 温 水 浴 锅 ，80-2 离 心 沉 淀 器 ，NDJ-1 旋 转 式 黏 度 计 ， DHG-9060A型电热恒温鼓风干燥箱，7200型分光光度计， 秒表等。 1.2 方法 1.2.1 提取方法
ZHANG Jian1,3, LI Rui2, ZHANG Kaicheng1, ZHANG Xuanmin1, ZHOU Xiaorong1
(1. School of Chemistry and Environmental Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 3. Hubei Technology Research Centre of Agricultural Products Process Engineering, Wuhan 430023, China )
β-淀粉酶（1，4-α-D-glucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2） 是一种外切型酶，作用于淀粉时，能从α-1，4糖苷键的非还 原性末端顺次切下一个麦芽糖单位，生成β-型麦芽糖及大 分子的β-界限糊精[1-2]。β-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、 玉米、大豆、甘薯等高等植物和一些微生物中[3-4]。除了用 于测定淀粉、肝糖及其衍生物的结构[5]外，β-淀粉酶还广 泛 应 用 于 葡 萄 糖 浆 、啤 酒 酿 造 、食 品 加 工 和 制 药 工 业 的 生产 。 [3，6-7]
在酶的提 取 过 程 中 ，维 持 一 定 的 离 子 强 度 可提高酶 的回收率。这是因为（1）稀盐溶液中的盐离子能与蛋白质 部分结合，可稳定酶蛋白的构象；（2）稀盐溶液增加了浆 料的离子强度，能促进酶蛋白溶解。基于此，试验考察了 NaCl和Na2SO4对酶的提取效果（见图1）。研究表明，一定 量的NaCl和Na2SO4可加大黄豆粉中β-淀粉酶的溶出率。当 加入0.1mol/L NaCl时，可使酶产量提高10%；而要达到相 同的酶产量，Na2SO4的用量要提高为0.15mol/L。但提取酶 蛋白时，盐用量不宜过大，否则会增加后续脱盐费用。为 此，在后续正交试验中，选用NaCl为一个考察因素。
表1 不同用量的表面活性剂与浆液中酶提取关系 Table 1. Relationship between surfactants and extraction contents of
β-amylase
用量/% 6501 PVP Tween-80 AES SDS CTAB
0.20
107
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0.80
109
104
100
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注：未使用添加剂提取值26.80U/mL为100。（下同）
2.2.3 还原剂/鳌合剂 β-淀粉酶的催化活性基团至少含有一个或多个半胱
氨酸（Cys），该基团易被金属离子或氧化剂所屏蔽。所以， 提取该酶时要加入一定量的还原剂或螯合剂以排除重金 属离子和氧化剂的干扰，进而提高回收率。6种还原剂/ 鏊 合 剂 对 β- 淀 粉 酶 提 取 的 影 响 结 果（表 2）表 明 ，EDTA （螯 合剂）、L-胱氨酸和巯基乙醇能使酶产量略有增加； NaHSO3对酶提取贡献不大；适当的Na2SO3能提高约10% 的β-淀粉酶产量。为此，后续正交试验选用Na2SO3为一个 因素来考察。
Abstract: The extraction conditions of β-amylase from soybean powder were investigated. The effects of salts, surfactants and reducing reagents on extraction efficiency of β-amylases from soybean powder were discussed. The extraction conditions were optimized by orthogonal test as follows: ratio of powder to water 1:10, adding 1 mol/L NaCl, 0.2% (w/v) alkylolamide and 0.5%（w/v）Na2SO3, 0.5 h extraction at 50℃ and pH 6.5. The β-amylase yield was 34.78 U/mL, which was 29.8% higher than that extracted without any additives (26.80 U/mL). Key words: β-amylase; soybean powder; extraction; enzyme activity
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2010 年 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 7 期
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生化方法高效提取黄豆粉中β-淀粉酶
张 剑1，3，李 睿2，张开诚1，张选民1，周晓荣1，
(1.武汉工业学院 化学与环境工程学院，湖北 武汉 430023；2.武汉工业学院 生物与制药工程学院， 湖北 武汉 430023；3.湖北省农产品加工工程技术研究中心，湖北 武汉 430023)
黄豆（市售），晒干后经机械粉碎成粉，备用；可溶性淀 粉（洛阳化学试剂厂，AR）；3，5-二硝基水杨酸（湖州菱湖 望菱试剂厂，CP）；聚乙烯吡咯烷酮K 30（PVP，上海化学试 剂厂，进口分装）；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，上海源 聚生物科技有限公司，AR）；十二烷基磺酸钠（SDS，上海 英鹏化工有限公司，CP）；其他试剂均为市售分析纯。
尽管有从细菌中提取β-淀粉酶的报道（如芽孢杆菌 Bacillus[8]，耐热梭状芽孢杆菌Clostridium[9）] ，但从细菌中 得到的β-淀粉酶除将淀粉转化成麦芽糖外，还产生大量的 麦芽三糖，而来自植物的β-淀粉酶产生相对较多的麦芽 糖。因此更适合于用在目的为得到尽可能甜的和/可发酵 的产品方法里，而且，利用细菌发酵很难大规模化生产高 活力的β-淀粉酶。所以国内外工业生产β-淀粉酶均采用植 物原料[10]。
好。事实证明，一定量的烷基醇酰胺（6501）、聚乙烯吡咯烷 酮-30（PVP）和吐温-80等非离子型表面活性剂能有效地将 酶蛋白从浆液中分散开，同 时 还 能 达 到 使 酶 活 性 保 持 完 好的效果。
由于物种有别，从黄豆粉与黑豆粉中提取β-淀粉酶， PVP和SDS所起的作用大相径庭[14]。如从黑豆粉中提取β淀粉酶，SDS是较好的分散剂；而对于黄豆粉中提取则影 响甚微；PVP能较好地分散黄豆粉中β-淀粉酶，但用于分 散黑豆粉中的β-淀粉酶就欠妥。为此，在酶蛋白的分离过 程中，必须考虑物种的差异，以便选择合适的表面活性剂， 达到提高回收率的目的。
102
Na2S2O3
108
102
100
Na2SO3
106
111
112
L-胱氨酸
100
103
105
CH3CH2SH
98
106
103
EDTA
102
104
103
2.3 优化黄豆粉β-淀粉酶提取工艺的正交试验 根据以上的单因素试验结果，设计了6因素3水平正交
试验（表3），正交试验级差分析结果（表4）表明，影响黄豆 粉β-淀粉酶提取效果的因素主次顺序为C＞E＞A＞F＞
取一定量干黄豆粉料，按1∶6比例加水后，14000r/min打 浆15min。倒出浆液，用缓冲液（或蒸馏水）洗涤器皿。洗涤 液一并归入浆液，保持最终料水比1∶10。将浆液分装，加入 盐、表面活性剂、还原剂或螯合剂后，再调节酸度。于给定 温度条件下提取一段时间。提取液经双层纱布过滤，滤液 于4000r/min离心20min。取上清液0.1mL，测β-淀粉酶活力。 1.2.2 β-淀粉酶活力测定
创新与借鉴
中国酿造
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总第 220 期 ·145·
B＞D，最 佳 提 取 工 艺 条 件 为 A1B2C3D2E1F2，即 提取时间 0.5h，提取温度50℃，提取酸度pH6.5，NaCl 0.10 mol/L，烷 基醇酰胺0.2%（w/v），Na2SO3 0.5%（w/v）。在上述条件下， β-淀粉酶提取量为34.78 U/mL，与未使用任何添加剂的 提取效果（26.80U/mL）相比，提高近30%。
表2 还原剂/螯合剂与酶提取量的关系 Table 2. Relationship between reducing reagents / chelating reagents
and extraction contents of β-amylase
种类
用量/%
0.20
0.50
0.80
NaHSO3
99
99
附图 盐用量对β-淀粉酶提取量的影响 Attached figure. Relationship between salt concentration and extraction
content of β-amylases
2.2.2 表面活性剂 一定量的表面活性剂可以与细胞膜中的磷脂和脂蛋
白相互作用，使细胞膜的结构破坏，从而增加细胞膜的通 透性[14]。表1列出了6种表面活性剂对提取β-淀粉酶的影 响。一般来讲，阴离子型表面活性剂如脂肪醇醚硫酸钠 （AES）、十二烷基硫酸钠（SDS），阳离子型表面活性剂如 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等能破坏酶蛋白的氢键 和疏水键，进而使酶的结构变化，导致酶催化活性丧失。 所以，在提取酶的过程中，选用非离子型 表面活性剂较
关 键 词：β-淀粉酶；黄豆粉；提取；酶活力
中图分类号：Q556
文献标识码：A
文章编号：0254-5071（2010）07-0143-03
Biochemical approaches of increasing extraction productivity of β-Amylase from soybean powder
摘 要：研究了黄豆粉中β-淀粉酶的提取工艺条件。分别讨论了外加盐、表面活性剂、还原剂等对黄豆粉中β-淀粉酶提取量的影响。
并通过正交试验进一步优化了提取条件。即：料水比1∶10，外加1 mol/L NaCl，0.2%（w/v）烷基醇酰胺和0.5%（w/v）Na2SO3，于50℃和 pH 6.5提取0.5h，β-淀粉酶的提取量为34.78U/mL，与未使用任何添加剂的对照提取效果（26.80U/mL）相比，产量提高29.8%。
收稿日期：2010-03-24 基金项目：湖北省教育厅科学计划研究项目（B20081801） 作者简介：张 剑（1970-），男，湖北汉川人，副教授，主要从事酶制剂的提取分离纯化以及应用研究工作。
2010 No．7
·144· Serial No．220
China Brewing
Innovation and Knowledge Transfer
按文献[13-14]。酶活力定义：在50℃、pH 6.0条件下，每 分钟水解2%（w/v）可溶性淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶 量为一个活力单位（U）。 2 结果与分析 2.1 无添加剂条件下的提取
保持料水比1∶10（w/v）不变，通过正交试验和单因素 试验考察可知，在磷酸缓冲体系中，提取酸度pH 6.0、提取 时间0.5h和提取温度50℃是黄豆粉中β-淀粉酶提取的最 适条件，其提取量为26.80 U/mL。 2.2 有添加剂条件下提取
β-淀粉酶含多个巯基，且至少有一个巯基直接或间接 参与了酶的催化反应[5]。目前，从植物中提取β-淀粉酶多 采用含硫的还原剂[11-12]。本试验讨论了外加盐、表面活性 剂、还原剂等因素对黄豆粉中β-淀粉酶提取量的影响，并 通过正交试验进一步优化了提取条件，有望为指导工业 化生产提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器
全自动电光天平，pHS-3C数字酸度计，DF-101B集热 式恒温加热磁力搅拌器，多功能食品加工机，HH-2数显恒 温 水 浴 锅 ，80-2 离 心 沉 淀 器 ，NDJ-1 旋 转 式 黏 度 计 ， DHG-9060A型电热恒温鼓风干燥箱，7200型分光光度计， 秒表等。 1.2 方法 1.2.1 提取方法
ZHANG Jian1,3, LI Rui2, ZHANG Kaicheng1, ZHANG Xuanmin1, ZHOU Xiaorong1
(1. School of Chemistry and Environmental Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 2. School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China; 3. Hubei Technology Research Centre of Agricultural Products Process Engineering, Wuhan 430023, China )
β-淀粉酶（1，4-α-D-glucan maltohydrolase，EC 3.2.1.2） 是一种外切型酶，作用于淀粉时，能从α-1，4糖苷键的非还 原性末端顺次切下一个麦芽糖单位，生成β-型麦芽糖及大 分子的β-界限糊精[1-2]。β-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、 玉米、大豆、甘薯等高等植物和一些微生物中[3-4]。除了用 于测定淀粉、肝糖及其衍生物的结构[5]外，β-淀粉酶还广 泛 应 用 于 葡 萄 糖 浆 、啤 酒 酿 造 、食 品 加 工 和 制 药 工 业 的 生产 。 [3，6-7]