食品中常规项目的微生物检验

国标法
国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵 试验、分离培养和证实试验。 乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度， 每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36± 1℃培 养24± 2h，观察是否产气。 分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝 琼脂平板上，36± 1℃培养18-24h，观察菌落形态。 证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏 染色观察。同时接种乳糖发酵管36± 1℃培养24± 2h， 观察产气情况。 报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表， 报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。
（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估 计，选择 2 ～ 3 个适宜稀释度，分别在作 10 倍递增稀 释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于 灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 （5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至460C营养琼 脂培养基 [可放置在（（46±1）0C）水浴锅内保温] 注入平皿 15ml ～ 20mL ，并转动平皿使混合均匀，同 时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品） 的灭菌平皿内作空白对照。 （6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）0C恒 温箱内培养（48±2）h取出，计算平板内菌落数目 乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。
8.3.5志贺氏杆菌的检验
志贺式菌属的细菌通称为痢疾杆菌，是细菌性 痢疾的病原菌。临床上能引起痢疾症状的病原 微生物很多，如志贺氏菌属、沙门氏菌属、变 形杆菌属、艾希氏菌属等，还有阿米巴原虫、 鞭毛虫及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志 贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。人类对志 贺氏菌的易感性较高，所以在食物和饮用水的 卫生检验时，常以是否含有志贺氏菌作为指标。 志贺氏菌属是由四个亚群组成，即A、B、C、 D四个亚群。
8.3.6致病性葡萄球菌的检验
典型的葡萄球菌呈球形，直径0.4～1.21m； 致病性葡萄球菌一般较非致病性菌小，且各个 菌体的大小及排列也较整齐。细菌繁殖时呈多 个平面的不规则分裂，堆积成为葡萄串状排列。 在液体培养基中生长，常呈双球或短链状排列， 易误认为链球菌。葡萄球菌无鞭毛及芽孢，一 般不形成荚膜，易被碱性染料着色，革兰氏染 色阳性，当衰老、死亡或被白细胞吞噬后常转 为革兰氏阴性，对青霉素有抗药性的菌株也为 革兰氏阴性。
8.3 食品中常规项目的微生物检验
8.3.1食品中菌落总数的测定
菌落总数的定义 菌落总数：是指食品检样经过处理，在一 定条件下培养后，所得1g或1mL或1cm2表 面积检样中所含细菌菌落的总数。
测定原理：
菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件 下培养后（如培养基成分，培养温度和时间， PH，需氧性质等），所得1ml (g) 检样中所含 菌落的总数。本方法规定的培养条件下所得结 果，只包括一群在培养琼脂上生长的嗜中温性 需氧的菌落总数。菌落总数主要作为判定食品 被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察 细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进 行卫生学评价时提供依据。
②稀释度的选择 应选择平均菌落数在 30 ～ 300 之间的稀释度， 乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的 菌落数均在 30 ～ 300 之间，则视两者之比如何来决 定。若其比值小于或等于 2 ，应报告其平均数；若 大于2则报告其中较小的数字。 若所有稀释度平均菌落数均大于 300 ，则应按 稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按 稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于 1 乘以 最低稀释倍数报告之。
8.3.2食品中大肠菌群的测定
大肠菌群的定义:大肠菌群并非细菌学分类命 名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一 个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一 组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及 血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及 兼性厌氧、在37℃24 h能分解乳糖产酸、产气、 需氧和兼性厌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠 檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
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在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群 1 ～2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置 （36±1）0C的温箱内培养（24±2）h，观察产气情 况。 凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆 菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气 或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。 5.报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表， 报告每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。
3.分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或 麦康凯琼脂平板上 ，置（ 36±1 ） 0C 温箱内，培养 18h ～24h，然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染 色镜检和复发酵试验。
4.乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳 糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏 阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。
3、菌落计算方法
（1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜 检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释 度的各平板平均菌落总数。 （2）菌落计数的报告 ①平板菌落数的选择 选取菌落数在30～300之间的平板作为菌落总数测定 标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数， 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应 以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状 菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀， 即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。平皿内如有链 状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链， 可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每 条链作为一个菌落计。
8.3.4沙门氏杆菌的检验
沙门氏杆菌是一群形态和培养特性都类似的肠 杆菌科中的一个大属，也是肠杆菌科中最重要 的病原属，它包括将近2 000个血清型。沙门 氏菌病常在动物中广泛传播，人的沙门氏菌感 染和带菌也非常普遍。由于动物的生前感染或 食品受到污染，均可使人发生食物中毒。世界 各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首 位或第二位。沙门氏菌常作为进出口食品和其 他食品的致病菌指标。因此，检查食品中的沙 门氏菌极为重要。
三、实验方法
1、检验程序 菌落总数检验程序： 检样→做成几个适当倍数的稀释液 →选择 2-3 个适宜稀释度各以 1ml 之量 分别入灭菌平皿内→每皿内加入 460C 适量营养琼脂→菌落数→报告
2、检样稀释及培养
（ 1 ）以无菌操作，将检样 25g （或 25ml ）剪碎以后，放于 含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶 内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇 或研磨做成1：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中 以 8000r/min~100000r/min 的速度处理 1min ，做成 1 ： 10 的 均匀稀释液。 （ 2 ）用 1ml 灭菌吸管吸取 1 ： 10 稀释液 1ml ，沿管壁徐徐注 入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖 端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做 成1：100的稀释液。 （ 3 ）另取 1ml 的灭菌吸管，按上项操作顺序作 10 倍递增稀 释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
大肠菌群=大肠杆菌吗？
大肠菌群包括大肠杆菌。大肠菌群指能 够发酵乳糖产酸产气的革兰氏阴型无芽 孢杆菌。 大肠埃希氏菌(E. coli)习惯称为大肠杆 菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌 属。
大肠菌群的卫生意义
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程 度，也反映了对人体健康危害性的大小。 食品中有粪便污染，则可以推测该食品中 存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着 食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人 体健康具有潜在的危险性。
若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之 间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接 近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 ③菌落数的报告 菌落数在100以内时，按其实有数报告，大 于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字 后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数 字后面的零数，也可用10的指数来表示。
三、实验方法与步骤
1、采样及稀释 ①以无菌操作将检样25g（或25ml）放于含有225ml灭 菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置 适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研 磨做成 1 ： 10 的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均 质器，以 8000r/min ～ 10000r/min 的速度处理 1min ， 做成1：10的稀释液。 ②用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做 成1：100的稀释液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操 作依次作10倍递增稀释液
8.3.3粪大肠菌群的检验
根据国家颁布的食品卫生微生物检验标准方法 (GB4789.3-1994)，粪大肠菌群系指一群能在 44℃ 24h内发酵乳糖产酸产气和利用色氨酸产 生靛基质，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽 孢杆菌。表8-3中的大肠艾希氏菌I型即属粪大 肠菌群。粪大肠菌群的唯一来源是粪便，因此， 唯有粪大肠菌群是粪便污染的确切指标。在被 检样品中，如果有粪大肠菌群存在，则在大肠 菌群检验中也被计入。因此，也有将大肠菌群 数称为总大肠菌群数者。
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计， 选择三个稀释度，每个稀释度接种 3管。也可直接用 样品接种。 2. 乳糖初发酵试验
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中 有无发酵乳糖产生气体的细菌。 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在 1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管； 1ml及1ml以下 者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种 3管，置 （ 36±1 ） 0C 温箱内，培养（ 24±2 ） h ，如所有乳糖 胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性， 如有产生者，则按下列程续进行
实验三
一、实验目的
食品中大肠菌群的测定
1、学习食品中大肠菌群检测程序、方法； 2、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。
二、实验材料
1、设备和材料 温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温 度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种 针 2、培养基及试剂 乳糖 — 胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基 质试剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（EMB）、远腾氏琼 脂、革兰氏染色液
实验二 食品中细菌总数的测定
一、实验目的
1、学习或均技术的技术方法； 2、掌握食品细菌总数的测定报告方式。
二、实验材料
1、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、托 盘天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻 璃珠、平皿、试管、试管架、酒精灯、均质 器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、75%酒 精棉球、玻璃蜡笔、登记薄 2、培养基和试剂：75%乙醇、生理盐水、15% 氢氧化钠溶液、营养琼脂培养基