丁酸梭菌

小鼠肠道内丁酸梭菌的分离及鉴定

小结：两种不同培养基分离丁酸梭菌的比较

1.实验材料

1.1样品来源：小鼠盲肠内容物

1.2 培养基：梭菌增殖培养基(RCM 培养基) :酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化钠5 g、三水合乙酸钠3 g、半胱氨酸盐酸盐0.5 g、0.5 %美蓝0.2 mL 、琼脂15g(固体培养基时用) 、蒸馏水1000 mL ；调节pH 7.1±0.1，1×105Pa，灭菌20min备用。

强化梭菌培养基：蛋白质10g，牛肉膏10g，酵母粉3g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH7.1±0.1，1×105Pa，灭菌20min。

硫乙醇酸盐流体培养基：胰蛋白胨，酵母浸出粉，葡萄糖，L-半胱氨酸，氯化钠，硫乙醇酸钠，刃天青，琼脂，蒸馏水1000mL，115℃，30min灭菌后备用。

产酸指示培养基：在强化梭菌培养基和硫乙醇酸盐流体培养基中加入3mL质量浓度为0.4g/dL的溴甲酚紫。

明胶液化培养基：在强化梭菌培养基和硫乙醇酸盐流体培养基中加入12g/dL的明胶即可。

醋酸铅琼脂培养基：强化梭菌培养基或硫乙醇酸盐流体培养基100mL，10%硫代硫酸钠溶液2.5mL，10%醋酸铅溶液3mL。

石蕊牛乳试验培养基：将脱脂牛奶的pH调至中性，用石蕊将牛奶调至淡紫色偏蓝为止。

2.实验方法

2.1分离培养方法

本实验中，运用厌氧菌培养罐(沈阳市第五人民医院生产) 来进行厌氧菌液体培养、分离和稀释平板计数。丁酸梭菌的分离：1) 取小鼠盲肠内容物，以1：3加入无菌水中，置80 ℃水浴10 min ，杀死非芽孢菌，转入梭菌增殖液体培养基，37 ℃厌氧培养48h。2) 将上述培养液转入强化梭菌液体培养基和硫乙醇酸盐流体培养基中，37 ℃厌氧选择性富集培养48h。3) 梯度稀释培养液，分别涂布于相应的强化梭菌液体培养基和硫乙醇酸盐流体培养基平板，置入厌氧培养罐，37 ℃培养48h。4) 影印好养和厌氧培养,除去好氧和兼性厌氧菌，得到严格厌氧菌。5) 选取培养特征、菌落形态和显微形态均符合丁酸梭菌培养特征的菌株

2.2分离菌株生理生化实验鉴定

先革兰染色，再进行明胶液化试验、淀粉水解试验、硫化氢试验和石蕊牛乳试验。

3.结果

小鼠内容物0.543g，未经过富集培养的得到厌氧菌为：强化梭菌培养基培养得到3株菌株分别为A1，A3，B6；硫乙醇酸盐流体培养基培养得到9株菌株分别为B1，B6，B18，B24，B20，B13，A21，A22，A18。经富集培养后得到的厌氧菌为：强化梭菌培养基培养得到5株菌株分别为A13＇，A15＇，A6 ＇，A7＇，A4＇；硫乙醇酸盐流体培养基培养得到8株菌株分别为A1＇，A3＇，A2＇，A4＇，A5＇，B2＇，B4＇，B6＇。

强化梭菌培养基上：3个

厌氧菌数

增殖分区划线影印硫乙醇酸盐流体培养基上：9个

强化梭菌培养基上：41个

兼性厌氧菌数

富集硫乙醇酸盐流体培养基：31个

强化梭菌培养基上：5个

厌氧菌数

分区划线硫乙醇酸盐流体培养基上：8个

强化梭菌培养基上：23个

兼行厌氧菌数

硫乙醇酸盐流体培养基上：18个

表1分离菌种的显微形态

菌株鉴定步骤：

（－）（＋）排除A2＇

（－）排除A22，A18

A13＇，A15＇，A6＇，A7＇，A4＇，B1，B6，B18，B24，B20 ，

B13，A1＇，A2＇，A3＇，A4＇，A5＇，B2＇，B4＇，B6＇

+）排除A21

A1 ，A3 ，A6）

小鼠C、D实验结果：经富集，影印后得到结果如下表：

4.后期计划

根据文献：1）丁酸梭状芽孢杆菌的研究进展冉雪松王振华潘康成

2）酒窖底泥中丁酸梭菌的分离及其特性研究谢树贵戴青赵述淼等

3）丁酸菌的分离、鉴定及筛选赵建新张灏田伟

4）猪粪中丁酸梭菌的分离杜云平周庆丰余国莲等

针对丁酸梭菌的鉴定均做了密二糖和松三糖的生化试验。

针对第一只小鼠肠道分离出的A1 ，A3 ，A6菌株进行进一步的鉴定。

小鼠C和D的肠道中分离得到的菌株要进行菌种鉴定。