第10章 植物遗传转化

2，较高的遗传稳定性 通过遗传转化导入外源基因的目的是在保 持物种原有性状不变的基础上增加某一（些） 性状或对某一特定性状进行改良，因此，受体 材料的遗传稳定性十分重要。 原始自然的材料（例如叶片、子叶、胚轴 等）比经过脱分化离体培养的材料在保持遗传 的稳定性方面具有优点。
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第二节

转化的受体系统
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第二节

转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
2，Vir基因活化的诱导物
Vir基因的活化是农杆菌Ti质粒转移的首
要条件。 在转化实验中，最常用的诱导物是乙酰丁 香酮（AS），浓度在5－200微摩尔/升，并且 需要其他培养条件的配合以发挥更好的作用。
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第二节

转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素 3，外植体的类型和生理状态 只有处在细胞分裂的S期（DNA合成期） 的细胞才具有被转化的能力，这个时期 称为“转化的敏感期”。 能够进行活跃分裂的细胞组织，例如， 分生组织，形成层组织，愈伤组织等， 都是合适的转化受体组织。
第二节

转化的受体系统
一、转化受体的条件
4，抗生素敏感性 4.1，对于抑制农杆菌的抗生素的敏感性 在利用农杆菌转化植物材料时，需要在转 化事件完成后采用抗生素抑制农杆菌的生长。 抗生素对植物材料也可能产生伤害作用，因此， 要求受体材料能够比农杆菌耐受更高浓度的某 种抗生素的毒害作用。
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第二节
第十章 植物遗传转化
植物遗传转化是遗传工程的主要内容，遗传工 程包括基因工程和细胞工程两部分。 基因工程包括目的基因的克隆，转化载体的构 建和目的基因的表达；细胞工程在遗传工程中 的作用是提供外源基因的受体材料和创造使目 的基因能够表达的条件。 外源基因的转化是连接基因工程和细胞工程的 技术环节。 细胞工程是连接基因工程和生产应用的桥梁。
一、转化受体的条件
3，具有稳定的外植体来源 转基因研究的工作效率不高，同一实验内 容往往需要多次重复进行。 只有稳定的外植体来源，才能够方便科学 研究的进行，并从材料的源头上提高实验结果 的重现性，便于对实验结果的总结。 由种子萌发得到的子叶、胚轴；以及无菌 培养的小苗叶片，都是比较理想的材料。
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第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.1，形式 1）直接对植物材料进行遗传转化操作，然 后诱导这些材料脱分化形成愈伤组织； 2）首先诱导外植体受体材料形成愈伤组织， 然后对愈伤组织进行遗传转化操作。 两种方式的最后步骤都是诱导愈伤组织再 生植株，但各有异同。
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第二节

转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
5，转化受体的接种及共培养 将转化受体材料和农杆菌工程菌株接触称为转 化受体的接种，通常的接触方法是一定时间的浸泡。 合适的浸泡时间和材料种类状态以及活化的菌 液浓度有关，一般在几分钟到1个小时。 浸泡完毕后，用无菌干滤纸吸除材料表面过多 的菌液，然后进行共培养。共培养时间一般为3天。 过长过短都不好。 在共培养过程中添加AS往往可以提高转化效率， 培养基中的激素对转化效率也可能有影响。
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第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
4，悬浮培养细胞系及体细胞胚胎受体系统 悬浮培养细胞系的细胞通常比固体培养基上培养 的愈伤组织具有较高的活力和比较一致的生理状态， 团块也比较小，有相对更大的表面积以接受转化； 悬浮培养细胞系比原生质体系统的稳定性好，操 作技术要求相对较低； 悬浮培养细胞系通过合适的培养基成分调节可以 诱导形成体细胞胚胎，通过胚胎形成的再生途径可以 减少嵌合体的发生。 以体细胞胚胎作为转化受体时转化效率往往比较 低，转化体的筛选比较困难，并且嵌合体出现的频率 很高。
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第一节 植物遗传转化的基础
4，植物遗传转化的技术流程
取得目的基因→目的基因的修饰→目的基 因扩增与回收→载体的构建与组装→目的基因 导入受体生物细胞→转基因体的筛选与鉴定→ 获得转基因体
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第一节 植物遗传转化的基础
5，导入外源基因的方法
目前应用最多的是基因枪法和农杆菌介导法 （具体参考实验指导书）
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第二节

转化的受体系统
一、转化受体的条件
1，高效稳定的再生能力 通过基因枪或农杆菌转化的转化率都还比 较低，转化过程还可能对细胞造成损伤，导致 植株再生能力的下降。 再生能力的高低直接影响了遗传转化的工 作效率；高的转化效率建立在高的受体材料再 生能力的基础上。
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第二节

转化的受体系统
一、转化受体的条件
6，单倍体细胞组织受体系统 以花粉（或未受精卵子）细胞培养形成的单 倍体愈伤组织（或悬浮培养细胞），以及再生 的单倍体植株的各部分器官组织为基因转化的 受体的技术系统。 这些细胞和组织经转化和加倍后再生成为基 因纯合的个体，是最为理想的受体系统。 单倍体细胞在增殖过程中容易自发加倍，目 前还没有维持细胞单倍体状态的有效方法，因 此，单倍体植株的组织的利用更加可靠可行。
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第二节

转化的受体系统
一、转化受体的条件 6，和研究的目的相适应 单纯以理论研究或方法的建立为目 的的实验在转化受体的选材上受到的限 制相对要小一些；有应用目的的研究则 除了受到以上各方面的限制外，还需Baidu Nhomakorabea 采用优良品种作为材料，通过遗传转化 改良成为更加优秀的新品种，在产业上 直接推广应用。
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功能基因组学
（functional genomics）
基因加标(gene tagging) 基因敲除(gene knock-out) 候选克隆的功能互补试验
植物代谢工程
( plant metabolic engineering )
利用转特殊基因的植物作为生物反应器 (bioreactor)工厂化生产工业或医药用品
第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性 大多数的基因转化系统都是建立在受体 材料的离体培养技术之上；由于离体培 养技术内容的多样化，目前有多种遗传 转化受体系统可供选择。 对转化受体各种类型及其特性进行了解， 是根据实际情况合理选用转化受体类型 和进行高效的转基因工作的前提条件。
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第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性 5，生殖细胞受体系统
以花粉粒或卵细胞为受体细胞进行直接的 转化的技术系统，也叫种质系统。 5.1，花粉管通道法； 5.2，花粉粒浸泡法； 5.3，花粉粒基因枪转化法； 5.4，子房微注射法。
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第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性


常常是多拷贝转化和整合，因而易造成转基 因沉默和转基因后代目的基因分离复杂化。
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第二节

转化的受体系统
植物基因转化的受体是指直接接受基因 转化的细胞（包括原生质体）、组织或 器官； 转化受体系统除了受体材料外，还包括 能够使受体在接受转化操作后，其中的 非转化细胞受到抑制和淘汰、转化细胞 得到选择和受到定向诱导，发育再生成 为完整植株的一系列技术过程。
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第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.3，两种形式的共同特点：
1）外植体材料来源广泛； 2）适用的植物物种范围广； 3）再生植株群体变异大。
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第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
2，不经过愈伤组织的受体系统 也称直接分化受体系统，指直接对外植体 材料进行遗传转化操作，然后经过培养直接在 外植体上形成不定芽的情况。 这种系统的特点是 1）获得再生植株的所 需时间短，操作简单；2）遗传变异少；3）外 源基因稳定性高；4）嵌合体比例偏高；5）受 植物物种的限制比较大。
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第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
3，原生质体受体系统 可采用由天然植物材料分离的，也可以采用离 体培养细胞分离的原生质体作为外源基因受体。 原生质体作为受体的转化系统的特点是，1） 可以采用多种转化方法；2）转化体的筛选效率高； 3）基本不产生嵌合体；4）由原生质体形成的培养 系统不稳定，实验重现性比较差；5）操作技术水 平要求高；6）遗传稳定性虽然与原生质体的材料 来源和植株再生方式密切有关，但通常都较低。
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第二节

转化的受体系统
二、转化受体系统的类型和特性
1，经过愈伤组织的受体系统 1.2，两种形式的不同点 1）在用农杆菌进行转化时，前一种形式的 带菌培养的时间比较长，需要采用添加抗生素 的培养基在抑制农杆菌增殖的情况下诱导愈伤 组织的形成和增殖愈伤组织。 2）前一种形式的扩繁量较大，来自同一转 化事件的个体数目相对较多，转化体为嵌合体 的情况相对较少。

转化的受体系统
一、转化受体的条件
4，抗生素敏感性 4.2，对于作为筛选剂的抗生素的敏感性 通过转化处理，接受外源基因的细胞总是少数。这些 细胞还可能因为转化而受到某些损伤而在群体中处于劣势。 为了使这些转化的细胞能够在与非转化细胞的竞争中 取胜，通常的策略是在转化外源基因的同时也转化了一种 能够解除某种抗生素的毒性的基因。将该种抗生素（筛选 剂）加入到培养基里，就可以使对该种抗生素敏感的没有 转化的细胞受到抑制，使转化的细胞得到相对的选择。
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第二节

转化的受体系统
三、转化受体系统的建立 1，高频再生系统的建立 外植体、培养基 2，抗生素（筛选剂）敏感性实验 农杆菌、筛选压 3，农杆菌敏感性实验 野生菌株接种、乙酰丁香酮处理
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第二节

转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
1，农杆菌菌株 1.1，菌株类型 不同菌株的寄主范围不同， 因此对不同植物的侵染力也有所不同。多数情 况下的侵染能力顺序是：农杆碱（琥珀碱）型、 胭脂碱型、章鱼碱型。 1.2，侵染活力 在增殖最快的时期（对数 生长期）的侵染活力最高。在标准的培养条件 下（培养基成分、温度、接种量、容器形状、 摇床摇荡频率等）可以通过检测培养液的OD值 来确定细菌群体的增殖生长状况。
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第二节

转化的受体系统
一、转化受体的条件
5，农杆菌敏感性 对于农杆菌介导的基因转化来说，需要受 体材料对农杆菌敏感，因为只有对农杆菌敏感 的材料才能够接受农杆菌的转化。一般认为， 大多数双子叶植物对农杆菌敏感而单子叶植物 不敏感。 农杆菌有不同的菌株，同一材料对不同菌 株的敏感程度可能存在不同；目前，还可以采 用化学试剂（乙酰丁香酮）来弥补敏感性的不 足。


3，植物转基因的优越性
对植物基因型和表现型的改变只作用于目标性状，不 涉及非目标累赘基因，因而更具有针对性，可加快育 种进程； 可克服传统育种中不同生物之间的生殖隔离等限制， 扩大可利用的资源库（动物、植物、微生物、人工合 成基因均可利用）； 可创造出自然界所没有的新种质； 以转基因植物为主体的植物化工厂具有高效、低污染、 可再生的优点。
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农杆菌和基因枪转化的特点比较
1，农杆菌转化的特点： 多为单拷贝或寡拷贝转化与整合，减少了 共抑制等基因沉默现象，转基因遗传较稳 定； 不需要特殊设备，实验成本较低。

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农杆菌和基因枪转化的特点比较

2，基因枪法转化的特点： 不受基因型限制，并且可用各种组织或细胞 作为靶材料。 操作简便。
植物口服疫苗
（edible vaccines）
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植物口服疫苗

转基因植物口服疫苗，是将病原微生物 的抗原编码基因导入到植物细胞内，然 后诱导细胞再生得到转基因植物。人类 食用这种转基因植物的产品，因为其中 包含有抗原基因表达的产物，就可以激 发黏膜免疫，使机体产生特异性抗病能 力。
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第一节 植物遗传转化的基础

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第十章 植物遗传转化
植物遗传转化的基础
植物基因转化受体系统
转化体的筛选与鉴定
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第一节 植物遗传转化的基础
1，植物遗传转化的定义
外源遗传物质进入植物细胞，与染色体整 合并通过减数分裂进行遗传。
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2，植物遗传转化技术的应用领域
作物育种 ( plant breeding )
抗病虫育种、抗逆境育种、品质改良
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第二节

转化的受体系统
四、影响系统转化效率的因素
4，外植体的预培养 目的是调整受体的状态，促进细胞分裂，提高 转化效率。预培养时间一般是2－3天。 以天然材料为外植体的，通过预培养可以使切 口初步愈合，外植体定型，在共培养中能够和培养 基保持比较密切的接触，利于农杆菌的转化。 以培养组织或细胞为受体的，预培养使细胞度 过相当于细胞增殖培养“S”曲线的滞后期而进入旺 盛的细胞分裂期。 预培养的培养基成分也可能和后来的共培养的 培养基不同；培养基的成分影响预培养的效果。