血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
医学免疫学：血清免疫球蛋白的纯化
实验原理
• 蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水 基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带 有电荷的情况决定的。
• 当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的 亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化 膜层减弱乃至消失;同时，中性盐加入蛋白质溶液 后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大 量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质 分子之间聚集而沉淀,这个过程叫做盐析。
• 边加PBS，边关注核酸蛋白检测仪的数值变化， 当数值到达5时收集核酸蛋白检测仪出水口的液体， 当数值下降到10时，停止收集。
• 将收集到的蛋白质液体用OD280和OD260测蛋 白质浓度。
实验结果
• 用紫外分光光度计测全血清和纯化后蛋白质溶液 的吸光度值，并求出蛋白质浓度。
蛋白质含量(mg/ml)= (1.45×OD280－0.74×OD260) ×稀释倍数
1.45和0.74是常数
注意事项
• 实验步骤中，用红色标出的地方。
实验原理—盐析
• 不同性质的蛋白质可通过加入不同浓度的中性盐 而分阶段从溶液中沉淀出来。
• 分离提纯IgG最常用的中性盐是硫酸铵。 • 30～50%的硫酸铵可以沉淀IgG。
实验原理—分子筛层析
• 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利 用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分 离物质的分子大小不同来进行分离。它的突出优 点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷， 吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温 度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成 分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质 有很好的分离效果。
液。置室温15min，离心3500rpm×10min，弃 上清。 沉淀物用2mlPBS重悬。
IgG的分离、提取与鉴定
IgG 分离、纯化与鉴定操作步骤：1、取2.5ml 血清，加pH7.0PBS 2.5ml，再逐滴加入（NH 4）2SO 4饱和溶液1.25ml，使成20%（NH 4）2SO 4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置20min。
2、3000r/min 离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。
3、在上清液中再加（NH 4）2SO 4饱和溶液3.75ml，使成50%（NH 4）2SO 4溶液，充分混合，静置20min。
4、3000r/min 离心20min，弃上清，以除去白蛋白。
5、于沉淀中加5ml PBS ，使之溶解，再加（NH 4）2SO 4饱和溶液3.2ml，使成33%（NH 4）2SO 4溶液，充分混合后，静置20min。
6、3000r/min 离心20min，弃上清，以除去其它球蛋白。
7、用1ml PBS 溶解沉淀，装入透析袋。
8、透析除盐，在蒸馏水中透析过夜，再在pH6.7的磷酸盐缓冲液中于4℃透析24h，中间换液数次。
8、SephadexG50除盐：用蒸馏水浸泡5小时或在沸水浴中溶胀2小时，倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液（0.0175mol/L，pH6.7）搅拌成悬浮液，按下述方法装柱。
9、DEAE-纤维素的活化：称取1g DEAE32或52，放入5ml 量筒中，加蒸馏水浸泡过夜，观察溶胀后DEAE 的体积。
根据所需层析柱的柱床体积计算所需DEAE 的用量，称取所需DEAE 用蒸馏水浸泡过夜，其间换几次水，每次除去细小颗粒。
抽干，改用0.5mol/L NaOH 溶液浸泡1h 以上，抽干（可用布氏漏斗），用无离子水漂洗，使pH 至8左右（用pH 试纸检查）。
再改用0.5mol/L HCl 溶液浸泡1h 以上，去酸溶液，用无离子水洗至pH6左右。
本实验中在用前应以0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，浸泡平衡后使用。
10、装柱用0.0175mol/L,pH6.7,磷酸盐缓冲溶液浸泡已处理好的DEAE-纤维素，并更换1～2次。
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第24页
DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白
血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白等电点为：
清蛋白pI=4.64，
α2球蛋白 pI=5.06， β球蛋白pI=5.12，
γ球蛋白pI=7.3
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第28页
五、γ－球蛋白判定
用醋酸纤维素薄膜电泳方法，以血 清电泳图谱为对照，判定所分离蛋白质 种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维 素薄膜电泳）。
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第29页
蛋白质电离示意图
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第30页
基本原理
1、以醋酸纤维薄膜作为支持体一个电泳方法。 2、在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第35页
操作步骤：
1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极 。
2、点样：浸于巴比妥溶液中薄膜，滤纸轻轻吸
干 — 半干燥态。
快
铅笔标识；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样。
3、放入电泳槽，使膜保持水平。
4、通电：110伏，1小时。断电后，取膜。
5、染色：氨基黑10B染色5min。
6、漂洗：漂洗液浸洗3次，每次5-10min。
沉淀即为初步纯 化γ－球蛋白
倾弃上清液（主要含 α、β球蛋白）
加入0.0175mol/L磷酸缓冲液 （pH=6.3)1ml溶解
γ－球蛋白 粗提液
第9页
二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐
欲去除盐析法分离得到球蛋白粗提液中大量盐， 通常有两种方法：
凝胶层析法、透析
本试验采取葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法 除去球蛋白粗提液中盐硫酸铵，方便下一步用离子交 换层析方法深入提纯球蛋白。
血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定
清蛋白及α 清蛋白及α、β球蛋白 被层析柱吸附, 被层析柱吸附 γ-球蛋白被洗脱 球蛋白被洗脱
0.06mol/LNH4Ac pH6.5 DEAE带正电荷
清蛋白pI 清蛋白 4.9，带负电荷多 ， α、β球蛋白pI 5.0～5.2， 球蛋白 ～ ， 带负电荷少
α、β球蛋白被洗脱, 球蛋白被洗脱 清蛋白仍被吸附
血清清蛋白、γ-球蛋白的 分离、提纯与鉴定
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2009年秋季学期
内
1 2 3 4 5
容
实验目的 实验原理 实验材料 实验过程 注意事项
2
生物化学与分子生物学实验教学中心
2009年秋季学期
一、实验目的
（一）掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 （二）掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 （三）掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本 方法 （四）掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 （五）了解柱层析技术
2009年秋季学期 21
生物化学与分子生物学实验教学中心
南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心
2009年秋季学期
2009年秋季学期
4
生物化学与分子生物学实验教学中心
蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法
蛋白质的理化性质 常用的纯化方法
分子质量 透析、 透析、超滤 凝胶层析 离心 溶解度 调整pH 调整 调整离子强度 降低介电常数 电荷 电泳 等电聚焦 离子交换层析 特异结合部位 其他性质 亲和层析 吸附层析 液相层析 气相层析
2009年秋季学期 19
生物化学与分子生物学实验教学中心
3. 染色和漂洗 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出， 电泳完毕后，关闭电源，将膜取出， 直接浸于染色液中5min。 直接浸于染色液中 。 取出膜，尽量沥净染色液， 取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗 液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜 液中浸洗脱色（一般更换 次），至背景颜 色脱净为止。 色脱净为止。 取出膜，用滤纸吸干即可。 取出膜，用滤纸吸干即可。
实验层析技术血清球蛋白的分离纯化与鉴定正式版ppt
G-75 G-100
40～120 40～120
12～15 15～20
3×103 ～ 8×104 4和个性
共性： *生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析 *蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷→盐析/
有机溶剂沉淀 *两性电解质和等电点：pH> pI，蛋白质带负电；反之带正 电→电泳、离子交换层析 *有一定的功能：抗原性→ 免疫沉淀
交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数
凝胶型号 颗粒大小（μm) 溶胀体积(ml/g) 分离范围（Mr）
G-10 G-15 G-25 G-50
40～120 50～150 50～150 40～120
2～3 2.5～3.5 4～6 9～11
＜7×102 ＜1.5×103 1×103 ～5×103 1.5×103 ～ 3×104
*洗脱液：溶解待分离物质，不变性
阳离子交换剂 带负电荷，与混合物中带正电的组分结合 阳离子交换层析
交联葡聚糖凝胶
➢多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗 粒，商品名为Sephadex G系列 ➢G—交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型 号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100， G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10 倍或吸水量（g）/10g干胶 ➢交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小， 吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此， “G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。
异—吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子 ③浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。
01M磷酸盐缓冲液（0. 分离依据：蛋白质理化性质的和个性
极性、分子亲和力以及分配系数。 蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构
IgG的分离与提纯
IgG的分离与提纯：硫酸铵沉淀法以抗原免疫动物来制备的抗血清是一个非常复杂的混合物，包括血清的全部成分。
但是同抗原特异性结合的抗体则主要是血清中的免疫球蛋白组分。
通常用于制备酶标抗体或荧光抗体的免疫球蛋白必须高度纯化并具有特异性，不应含有非抗体的血清蛋白。
因此，为了浓缩和提高抗体的效价，或为制备免疫球蛋白特异性抗体时，通常也需要分离和纯化免疫球蛋白。
γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75%，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。
纯化IgG小量几十ml的话，用protein A或protein G就可以，疏水柱等也可以纯化；大量的话，上百ml，可以使用streamline protein A。
之前根据载量估计一下需要的柱子体积。
实验室中常用硫酸铵沉淀后过DEAE 纤维素柱，比较简便可获较纯的抗体。
下面以此方法为例介绍IgG的分离与提纯。
一、材料与试剂配制1、动物血清2、硫酸铵饱和溶液硫酸铵800g~850gH2O 1 000ml加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。
注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。
如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。
3、0.01Mol/L pH7.4PB液A液：0.10Mol/L NaH2PO4液NaH2PO4·2H2O 15.60g加H2O至1000.mlB液：0.10Mol/L Na2HPO4液Na2HPO4·12H2O 35.80g加H2O至1 000ml取A液19ml，B液81ml加水至1000ml即可。
4、1%BaCl2溶液5、纳氏液HgI 115.00gKI 80.00g加H2O至500.00ml溶化后过滤，然后再加20%NaOH500.00ml，混合即可。
6、0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液7、洗脱液0.03Mol/L的NaCl液。
血清IgG的分离
血清IgG的分离
引言
血清IgG的分离是一种常见的实验操作，用于从血清样品中纯化和分离出IgG抗体。
IgG作为一种免疫球蛋白，在研究和诊断中具有重要的应用价值。
本文将介绍一种简单的方法来实现血清IgG 的分离。
实验材料
- 血清样品
- 柱层析试剂盒（例如，Protein A/G柱）
- 洗涤缓冲液
- 结合缓冲液
- 洗脱缓冲液
- 分离缓冲液
操作步骤
1. 准备工作：
- 将柱层析试剂盒按照说明书准备好，确保所有的缓冲液和试剂适当配置。
- 样品处理前，将血清样品离心以去除杂质。
2. 结合IgG抗体：
- 将血清样品加入结合缓冲液中，根据比例稀释适量的样品。
- 在离心前，静置样品与结合缓冲液的混合物反应一段时间（例如，30分钟）。
3. 柱层析操作：
- 将混合物通过装有填充物的柱层析柱。
- 打开流量，并在结合完毕后关闭。
- 使用洗涤缓冲液进行洗脱，以去除非特异性结合物。
4. 洗脱和收集：
- 使用洗脱缓冲液进行洗脱，以从柱层析柱上洗脱结合的IgG 抗体。
- 收集洗脱液中的纯化的IgG抗体。
5. 质量检测：
- 通过测量IgG抗体的浓度或使用其他质量检测方法来确认分离的IgG抗体的纯度和活性。
结论
血清IgG的分离是一种简单且常用的实验方法，可以用于纯化和分离血清样品中的IgG抗体。
通过选择适当的柱层析试剂盒和正确操作步骤，可以高效地获得纯化的IgG抗体。
分离的IgG抗体可以用于各种研究和诊断应用中。
第五组血清IgG的分离纯化及鉴定
Байду номын сангаас样缓冲液
甘油：蛋白质沉到样品孔底部，不漂浮 β-巯基乙醇：切断二硫键，是蛋白质分 为两单条链 SDS:是蛋白质带负电荷并呈棒状
7
（四）SDS-PAGE测IgG分子量结果
猪血清、纯化的IgG样品经SDS-PAGE电泳结果如下：
1标准蛋白
2 血清
3 纯化的IgG样品
8
活性鉴定
琼脂扩散
开展讨论的过程中，同学们互相学习，对实验的
设计流程有了深刻的认识。实验其间，对于细节
上的问题我们更加耐心，为将来毕业论文的开展 提供了有力的基础。
11
12
Contents
材料与方法 结果与讨论
总结与感想
2
一、材料与方法
（一）试验材料 1、试剂和材料
血清、饱和硫酸铵、0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PH=7)、 吸管、高速冷冻离心机
3
方法及步骤
方法 通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中 的各个成分分步盐析出来，达到目的蛋白质。 不同饱和度硫酸铵浓度：V=V0（C2-C1)/(1-C2) V 应加入饱和硫酸铵溶液的体积 V0 蛋白质溶液的原始浓度 C1 原来溶液的硫酸铵饱和度 C2 所要达到硫酸铵饱和度
4
步骤
1、取5mL血清和5mL0.01mol/L磷酸盐缓冲 液于小烧杯中，混匀，滴加饱和硫酸铵 溶液，使溶液浓度达到20%，4℃静置 15min 2、4℃ 3000r/min离心10min,弃沉淀（沉淀 为纤维蛋白原） 3、向上清中滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液 浓度达到50%，4℃静置15min
5
4、4℃ 3000r/min离心10min,弃上清液（上 清为清蛋白，沉淀为球蛋白） 5、向沉淀中加5mL 0.01mol/L磷酸盐缓冲 液，重悬沉淀，滴加饱和硫酸铵溶液， 使溶液浓度达到35%，4℃静置20min 6、4℃ 3000r/min离心15min,弃上清液（上 清为α、β球蛋白）沉淀为IgG
血清免疫球蛋白(Immunoglobulin,IgG)的分离制备―盐析法
血清免疫球蛋白（Immunoglobulin，IgG）的分离制备―盐析法（一）原理IgG是免疫球蛋白（Immunoglobulin，简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万~16万，沉降生活费数约为7s。
IgG是动物和人体血浆的重要成分之一。
血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG，首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。
盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一。
许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象称为“盐溶”（Salting in）。
而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为“盐析‘（Salting out）。
这些现象的原理大致是由于蛋白质是亲水胶体，带有羧基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证蛋白质形成溶于水的溶胶状态。
当加入少量盐时，增多了蛋白质分子上的极性基团，因而增大了蛋白质在水中溶解度，出现“盐溶”现象。
钽当盐浓度增加到一定浓度时，一方面大量的水同盐分子结合，使得蛋白质没有足够的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白质亲水胶的水膜，容易沉淀出来；另一方面加入的盐离子中和了蛋白质分子相互磁撞时即发生相互聚集沉淀出来，这样就出现了“盐析”现象。
由于各种蛋白质“盐析”出来所需的盐浓度也各异，盐析所需的最小盐量称做盐析浓度。
盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合溶液中的各个成分分步“盐析”出来，达到分离目的蛋白质。
盐析法是1878年Hammarster首次使用的，他用硫酸镁成功地将血清蛋白分成为清蛋白、球蛋白两部分。
自那以后曾使用过硫酸钠、氯化钠、磷酸钠和硫酸铵等中性盐来盐析蛋白质，其中运用最广的是硫酸铵。
因为硫酸铵有许多其他盐所不具备的优点，如在水中化学性质稳定；溶解度大，25℃时能达到4.1mol/L的浓度；溶解度的温度系数变化较小，在0~30℃范围内溶解度变化不大，如25℃时饱和溶解度为4.12mol /L，即767g/L，0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L。
血清蛋白、-球蛋白的分离纯化与鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定（一）血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化【目的要求】1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。
【实验原理】血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-β-γ-球蛋白等），由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。
本实验应用不同浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。
用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。
本实验采用凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差异除去粗制品中盐类。
脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。
DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
将醋酸铵溶液的浓度提高至0.3mol/L，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。
经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。
为便于鉴定，常需浓缩。
浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。
血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。
【试剂与器材】1.试剂.（1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定
I 血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。
掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。
一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。
一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。
(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。
制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。
将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。
为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。
2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。
每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。
将已抗凝的全二于2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。
血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。
3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。
抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。
（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。
每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃烘箱烤干（若超过150 ℃则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。
g-球蛋白分离技术
最多合并三管即可
Company Logo
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
3.离子交换层析：将-球蛋白与、-球蛋白分离。
（1）装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测
• 装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测等操作步骤及有 关注意事项同前述。 留少量做电泳
•上样前DEAE-纤维素柱的平衡：装柱后用0.02 M乙酸铵 （pH6.5）冲洗2遍。 • 将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE-纤维素阴离子交换柱 上，用乙酸铵洗脱，样品进入柱床后立即开始收集洗脱液 ， 检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。 •此次收集的即为纯化的-球蛋白溶液，留待浓缩及鉴定。
ComBiblioteka any Logo血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤 2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐 （脱盐） （1）装柱：
（a）固定层析柱，保持垂直。 （b）排气，并检查是否通畅。柱内留下约5ml乙酸铵。 （c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打 开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少 许溶液。关闭出口。
Company Logo
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
（2）浓缩
将纯化的-球蛋白溶液量体积，每毫升加葡聚糖凝胶G-25 干胶0.25g，摇动2-3分钟，离心5分钟（10000r/min）， 上清即为浓缩的-球蛋白溶液，留待电泳鉴定。
（四）如何鉴定-球蛋白及纯度？
• 纯化前后的-球蛋白可用电泳法进行比较鉴定。
Company Logo
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
血清IgG的分离纯化及测定
SPA-sepharose亲合层析法
• protein A上柱
•
• •
血清与protein A结合
清洗掉杂蛋白 洗脱下所需IgG
IgG浓度测定
• 物理性质：紫外分光光度法 化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry 法 (Folin-酚法)， BCA法，胶体金法 染色性质：考马氏亮蓝染色法、银染法 其他性质：荧光法Βιβλιοθήκη 体分离多抗纯化方法有很多种：
• • • • • 盐析法 辛酸-硫酸铵沉淀 冷酒精沉淀 离子交换层析 Protein A,G亲和层析
盐析法
• 蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分 子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的 水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质 溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电 荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，导 致蛋白质分子之间聚集而沉淀。
1000—10000 540 20—500 750 595
考马氏亮蓝G-250 50—500
BCA
20—200
562
紫外吸收法测蛋白质含量
• 因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm处具有最大吸收量，且各种蛋白质的这三 种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液 在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
• 葡萄球菌A蛋白（SPA）具有与多种哺乳动物IgG 分子fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力 有所差别。改变pH及离子强度可洗脱结合于SPAsepharose 柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯 化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
SPA-sepharose亲合层析法
• • • • • Protein A — 葡萄球菌A蛋白 Buffer A — PH8.6 磷酸盐缓冲液 Buffer B1 — PH5.5 枸橼酸缓冲液 Buffer B2 — PH4.0 枸橼酸缓冲液 Buffer C — PH8.6 Tris缓冲液
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定
阳离子交换剂具有带负电荷的酸性基团作 为离子交换基团，能吸附流动相中的阳离 子。
阴离子交换剂具有带正电荷的碱性基团作 为离子交换基团，能吸附流动相中的阴离 子。
0.02M NH4AC
AC-
++
AC-
+
AC- + AC++
AC- AC-
蛋白样品
NH4AC
-
++ -
- +-
- +-
++
- --
AC-
原理: 当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝 聚并析出沉淀。该技术为“盐析”。
• 不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀。在 半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白会沉淀，经 离心后，可与白蛋白分离开。
• 影响因素：PH、温度、蛋白质纯度等。 • 逐渐改变硫酸铵浓度可分段盐析出不同的蛋白。
操作
一、盐析
－－ 白蛋白、γ球蛋白的粗分离
血清白蛋白、γ-球蛋白 的分离、纯化及鉴定
分离纯化的一般程序
选择材料 破碎细胞
提取 （预处理） 分离纯化 （粗分级，细分级） 分析及鉴定
实验目的
通过从血清中分离、纯化、鉴定血 清白蛋白和γ-球蛋白的实验，培养学 生综合应用盐析、离心、色谱、电泳 分光等技术来分离纯化特定蛋白质的 技能。
实验原理
++
AC-
+
AC- + AC- 阴离子交换剂 ++
AC- AC- γ-球蛋白带正电
NH4+
+ +
得到纯化的γ-球蛋白
白蛋白,α、β
球蛋白带负电
-
-
血清免疫球蛋白IgG提取
此处添加副标题内容免疫球蛋白IgG提取原理；
熟悉血清免疫球蛋白IgG提取操作过程和方法
原理 1
IgG是血清中主要的免疫球 蛋白，占全部抗体含量的70 ％－75％，在临床免疫学检 验技术中常用到的第二抗体 就是通过用纯化人IgG作抗 原免疫动物而来
结果判断
效价可用免疫双扩散试验判断 特异性则可通过双扩、免疫电泳或交叉凝集试验进行考察
1
思考题
2
盐析法提取免疫球蛋白的实验 原理？
盐析法提取免疫球蛋白时，主 要的影响因素有哪些？
注意事项
蛋白质的浓度、盐的浓度、PH值、 温度对盐析的效果有影响
饱和硫酸铵溶液的滴加方式
盐析后放置时间、离心操作的速度、 时间
透析袋的使用
01 方法评价
02 硫酸铵水中溶解度高，受温度影响小，不易使蛋白质变性，操 作简单，为盐析中常用的中性盐
硫酸铵中含有氮，会干扰蛋白质的测定，且溶液的缓冲能力差， 故多用于大量蛋白的粗提。若要获得纯化的免疫球蛋白，必须 经过凝胶过滤、离子交换层析和亲和层析进一步提纯
分在此时不易沉淀，通过离心可将两者分离。
原理
02
材料
样本 正常人血清
试剂
○ 生理盐水、饱和硫酸铵溶液、 ○ 透析缓冲液
主要器材 离心机 冰箱 透析 袋 紫外分光光度计等
操作步骤
1.25ML血清＋1.25ML生理盐水 滴加饱和硫酸铵溶液2.5ML
室温静置30min, 离心4000rpm,10min
弃去上清液（含清蛋白）
沉淀溶于生理盐水,使体积达1.25ML 滴加饱和硫酸铵溶液0.625ML
室温静置30min,
重
离心4000rpm,10min
血浆IgG的分离_纯化及鉴定实验报告
血浆IgG的分离，纯化及鉴定实验报告一、实验目的掌握盐析法的原理及盐析法分离制备血浆IgG的基本过程。
二、实验原理1.血浆IgG是免疫球蛋白（简称Ig）的主要成分之一，相对分子质量为15~16万。
要从身姿中分离出血浆IgG，首先要尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使血浆IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得血浆IgG。
2.盐析法是粗分离蛋白质的重要方法，许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶液度低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种现象为盐溶。
而当盐浓度继续继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不溶而自动析出，这种现象称为盐析。
这现象的原理大致是由于蛋白质带有羟基解离的负电荷或氨基解离的正电荷，其极性基团使分子间相互排斥，同时与水分子形成水膜，这些因素保证了蛋白质不溶于水，当加入少量盐后，破坏水膜结构，增多了蛋白质的极性基团，蛋白质的溶解度增大，出现盐溶的现象，另一方面加入的盐离子中和蛋白质表面电荷，蛋白质分子相互蛋白质混合溶液中的各个成分分步盐析出来，达到分离目的蛋白质。
3.用硫酸铵分级盐析蛋白质时，盐析出某种蛋白质成分所需的硫酸铵浓度一般饱和度来表示。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度为100%或1。
盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或1的百分之几。
即称为该蛋白质盐析的饱和度。
4.饱和度可以用饱和硫酸铵溶液法计算：在蛋白质要求达到50%以下时采用：V＝V0*（C2－C1）/（1－C2）V0－－蛋白质溶液的原始体积C1－－所要达到硫酸铵饱和度C2－－原来溶液的硫酸铵饱和度三、试剂与仪器饱和硫酸铵溶液，0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，0.0175mol/L,PH6.7的磷酸盐缓冲溶液四、实验步骤1.取1支离心管，向其中加入5ml血浆和5ml0.01mol/l,PH7.0的磷酸盐缓冲溶液，混合。
向其中加入2.5ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为20%（加入过滴加边搅拌），加完后，应在4度放置15min，使之充分盐析，然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白）2.量取10ml清液体积，置于另一离心管，用滴管加入6ml饱和硫酸铵溶液，使其饱和度达到50%，加完后，4度放置15min，以3000r/min离心10min，弃去溶液，留下沉淀。
血清球蛋白的分离纯化与鉴定
实验血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】1.熟悉蛋白质分离提纯的技术路线2.掌握盐析、凝胶过滤层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。
【实验原理】血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α_1 -球蛋白、α_2 -球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白室一类结构及功能相似的蛋白质，绝大多数免疫球蛋白属于γ-球蛋白，因此γ-球蛋白的分离纯化在医学研究中非常重要。
蛋白质的分离纯化室研究蛋白质结构及其生物功能的重要手段。
分离提纯γ-球蛋白时，首先利用各种清蛋白在中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，因为中性盐可使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定因素去除而沉淀。
半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，而33%的饱和硫酸铵溶液只能使γ-球蛋白沉淀，α-球蛋白和β-球蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离，沉淀部分即为含有γ-球蛋白的醋制品。
用盐析法分离而得的γ-球蛋白中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此必须去除。
常用的方法有透析法、凝胶层析（凝胶过滤）法等。
本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异将蛋白质与无机盐分离。
当溶液通过SephadexG-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在凝胶柱中会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。
脱盐后的蛋白质溶液可能仍含有其他球蛋白，利用它们等电点的不同，通过DEAE（二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析可进一步分离、纯化出γ-球蛋白。
因为α-球蛋白、β-球蛋白的pI﹤6.0；γ-球蛋白的pI为7.2左右。
因此，在pH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同，经DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；而带正电的γ-球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合从而直接从层析柱流出。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实验八血清免疫球蛋白G的分离纯化及鉴定
为了初步掌握蛋白质的分离纯化技术，选择了从家畜血清中分离纯化免疫球蛋白G （Immunoglobulin G，简称IgG）的实验。
血清中的蛋白质有数十种之多，IgG是球蛋白的一种。
分离纯化蛋白质的方法是利用不同蛋白质的某些物理、化学性质（如在一定条件下带电的情况、分子量、溶解度等）的不同而建立起来的，其中有盐析、离子交换、凝胶过滤、亲和层析、制备电泳和超速离心等。
在分离纯化时，要根据情况选用几种方法互相配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
本实验采用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素离子交换及凝胶过滤等方法，提取家畜血清中IgG。
其原理及操作如下：
㈠硫酸铵盐析
1.试剂
饱和硫酸铵溶液pH7.0：称取（NH4）2SO4760g,加蒸馏水至1000ml，加热至5℃，使绝大部分硫酸铵溶解，置室温过夜，取上清液，用氢氧化铵调pH至7.0。
（内含0.15mol/L NaCl，简称PBS）：取0.2mol/L Na2HPO4磷酸缓冲溶液（0.01mol/L，pH7.0）
溶液30.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液19.4ml，加NaCl8.5g，加蒸馏水至1000ml。
磷酸缓冲溶液（0.0175mol/L，pH6.7）（不含NaCl，简称PB）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。
2.操作①取家畜血清5ml，加磷酸缓冲溶液（0.1mol/L，pH7.0）5ml，混匀，滴加（边摇边搅拌）饱和硫酸铵4ml（此时溶液硫酸铵饱和度约为20%）。
静置20min，以3000r/min 离心15min，沉淀为纤维蛋白（弃去），上清液中含清蛋白、球蛋白。
②取上清液，再加饱和硫酸铵溶液6ml（方法同前），此时溶液硫酸铵饱和度为50%，静置20min，以3000r/min 离心15min，上清液中含清蛋白，沉淀为球蛋白。
③倾去上清液，将沉淀溶于5ml磷酸缓冲液（0.01mol/L pH7.0），再加饱和硫酸铵
3.2ml，此时溶液硫酸铵的饱和度约为33%，静置20min，以3000r/min离心15min，除去上清液，沉淀即为γ-球蛋白。
㈡凝胶过滤脱盐
1.试剂①Sephadex G-25：用前以蒸馏水浸泡5h或在沸水浴中溶胀2h；②磷酸盐缓冲液（pH6.7，0.0175mol/L）：见前；③磷酸盐缓冲液（pH7.0，0.01mil/L）见前；④奈氏试剂；
⑤20%磺酰水杨酸。
2.操作①取层析柱一根（1.5cm×20cm），垂直于固定架上，夹住流出口。
加10ml磷酸缓冲液（0.0175mol/L, pH6.7）于柱中。
将已溶胀好的Sephadex G-25倾倒去水，加入磷酸盐缓冲液并搅拌成悬浮液，慢慢装入柱中，打开流出口，继续加入Sephadex G-25使自然沉降至15cm高，关闭出口。
②打开出口，使柱中多余的磷酸缓冲液流出凝胶柱床面（切勿低于柱床面）。
用吸管吸取盐析所得的蛋白质溶液2ml，沿管壁加入凝胶面上，打开流出口，让样品进入凝胶柱，再用滴管小心加入磷酸盐缓冲液至离凝胶面2～3cm高，编号，按顺序放在试管架上。
③在收集的同时，检查蛋白质是否流出。
于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水杨酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱，如此直检查到蛋白质全流出为止。
与此同时，再从含蛋白质的管中取出1滴于白色比色板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去，合并无硫酸铵的蛋白质管，待用。
㈢DEAE-纤维素纯化免疫球蛋白G
1.试剂①DEAE-纤维素：DE-11、DE-22、DE-32、DE-52均可；②0.5mol/L HCl溶液；③0.5mol/L NaOH溶液；④pH6.7，0.0175mol/L磷酸盐缓冲液。
2.操作
（1）DEAE-纤维素的活化处理称取20gDEAE-纤维素，浸泡过夜。
次日倾去水，加0.5mol/L NaOH溶液100ml，轻轻搅拌。
静置，沉降后倒出NaOH溶液，用蒸馏水洗至pH为8左右，倒出上清液。
加0.5mol/L HCl溶液100ml，轻轻搅拌，静置10min，小心倒出HCl溶液，用蒸馏水洗至pH为6，待用。
（2）装柱取层析柱一根（1.5cm×20cm），按照安装Sephadex G-25柱的方法装柱。
待纤维素自然沉降后接通洗脱瓶让磷酸缓冲液（pH6.7，0.0175mol/L）流经柱床，待流出液的pH为6.7为止（充分平衡）。
（3）加样与洗脱关闭洗脱瓶，让柱内缓冲液流出至纤维素柱面，关闭流出口，用吸管将已脱盐的γ-球蛋白沿柱壁缓缓加入柱内，打开流出口，让样品进入柱床（勿使空气进入）。
立即用滴管向柱内沿管壁加入磷酸缓冲液至高出柱面2cm，接通洗脱瓶，调整流速至1.5ml/min，按每管1.5ml连续收集，出现白色沉淀者，即含有纯的IgG，继续收集，直至不发生白色沉淀反应时为止，合并蛋白管，置冰箱保存。
㈣免疫球蛋白G纯度的鉴定
免疫球蛋白G纯度的鉴定办法很多，最常用的是电泳。
免疫电泳、凝胶电泳等都可。
注：
[1]如在柱层析时连接核酸蛋白检验仪，则免去用磺酰水杨酸检测的步骤。
[2]50%饱和的硫酸铵使血清中球蛋白沉淀，33%饱和的硫酸铵使γ-球蛋白沉淀。
[3]在粗提的γ-球蛋白溶液中，当pH为6.7时，除IgG外，其他杂质蛋白均带不同数量的
负电荷。
因此，当粗提的γ-球蛋白在pH为6.7的溶液中经DEAE-纤维素柱时，IgG不发生交换而直接流出，其余蛋白质则发生交换而吸附，从而能得到较纯的IgG。