生物碱类成分分析
05-1生物碱类成分分析
N
奎宁
pKb29.7
O CH3
H3C N
N
OH
N ON
H3C N ON
N N
CH3
咖啡因 （pKb14.15）
CH3
茶碱 （弱酸性）
N CH3
HCl 3H2O
HO
O
OH
盐酸吗啡（两性）
（3）立体结构与碱性的关系
CH3O
N N H
O
OC
OC
OCH3 OCH3
利血平（pKa 6.07）
OCH3 OCH3
残渣加稀盐酸1ml使溶解，加碘化铋钾试液1~2滴,
即生成黄棕色沉淀。
（二）色谱法鉴别
1. TLC法 TLC法是Ch.P.中药制剂常用
鉴别方法，大多用硅胶为吸附剂
硅胶是弱酸性吸附剂，会吸附生物 碱，用中性展开剂时，Rf 小，并会产生 斑点拖尾现象
防止斑点拖尾的措施 A. 展开剂中加入碱性试剂
（例氨水、二乙胺、吡啶） B. 用硅胶铺板时加碱液（例氢氧化钠） C. 改用其他吸附剂（例碱性氧化铝）
有些小分子的呈液态（烟碱、槟榔碱)
麻黄碱具有挥发性 咖啡因具有升华性
O H3C
N
CH3 N
N ON
CH3
咖啡因
OH NHCH3 CH CH CH3
麻黄碱
COOCH3
N 槟榔碱
CH3
N
N
CH3
烟碱
2. 溶解性
游离生物碱OHH 生物碱盐
难溶于水 易溶于有机溶剂
易溶于水 难溶于有机溶剂
例 盐酸吗啡
Ch.P.（2010）
苦味酸钠
K 2HPO4
buffer
过滤
溶醇解、水定容
第五章生物碱介绍
第七页，编辑于星期日：七点 十四分。
极性溶剂系统：极性较大的生物碱可用
中性甲醇、乙醇、酸水（常用0.1%-1%的盐酸、硫酸等）以及缓冲液提取，
但提出的杂质较多，需净化。
第五章 中药制剂中各类化学成分分析
第一节 含生物碱（alkaloid）类成分的分析
第一页，编辑于星期日：七点 十四分。
生物碱的分布
含生物碱量多的科有罂粟科、防已科、茄科、小 檗科、毛茛科、芸香科、夹竹桃科、马钱科及茜 草科等，中药有三尖杉、麻黄、黄连、黄柏、乌 头、延胡索、粉防已、颠茄、洋金花、贝母、百 部等。
品精密称定，加无水乙醇溶液并放置24小时，过滤，减压
回收乙醇，至残留液至小量时加2%盐酸溶液（注2），
移入分液漏斗中，用乙醚萃取3次（注3），在样品液中
滴 加 氨 试 液 调 PH9 10 （ 注 4 ） ， 再 用 乙 醚 - 氯 仿 （3:1）混合液提取３次（注5），合并萃取液，蒸干， 加无水乙醇溶解．精密加入硫酸液（0.01mol/l）与
通常用磷酸盐缓冲液，但操作时由于存在 盐，做过后应充分洗柱，以免腐蚀柱子。
第二十六页，编辑于星期日：七点 十四分。
（2）、固定相方面的改进 A：选择C链较短的键合相硅胶为固定相，如C8
比C18好，原因是由于硅烷的C链较短则覆盖硅 胶的表面较好，只有较少的游离硅醇基。 B：封尾技术可使填料的键合更彻底，常用三甲 基氯硅烷（TMCS）处理，可减少残余羟基，增 加单体覆盖度。
人有了知识，就会具备各种分析能力，
明辨是非的能力。
所以我们要勤恳读书，广泛阅读，
生物碱类药物的分析
生物碱类药物的分析掌握盐酸麻黄碱、硫酸阿托品、硫酸奎宁、盐酸吗啡和硝酸士的宁的鉴别、杂质检查和含量测定方法。
一、概述（一）定义：生物碱是一类存在于生物体内的含氮有机化合物。
（二）分类1.芳烃胺类硫酸苯丙胺，精神振奋药pKb=9.9盐酸麻黄碱，肾上腺受体激动药pKb=9.62.异喹啉类盐酸吗啡，镇痛药pKb1=8.0，pKb2=9.9磷酸可待因，镇痛镇咳药；盐酸黄连素，抗菌药；度冷丁等3.喹啉类硫酸奎宁，抗疟药；异构体硫酸喹尼丁，抗心率失常药；pKb1=5.07，pKb2=9.74.托烷类硫酸阿托品，抗胆碱药pKb=9.9氢溴酸东莨菪碱，抗胆碱药pKb=7.6；5.黄嘌呤类咖啡因，pKb=14.15（碱性极弱）；茶碱，平滑肌松弛药，含活泼氢酸性；6.吲哚类硝酸士的宁，中枢神经兴奋药pKb1=6.0，pKb2=11.7（酰胺）硫酸长春新碱，抗肿瘤药；利血平，抗高血压药；7.其他类硝酸毛果芸香碱，缩瞳药。
由上可知，生物碱类药物有如下特点。
（三）特点1.数量多，绝大多数存在于植物体内；已发现3000多种，100多种有效，中成药中富含生物碱。
2.生理活性强，但大都有毒性因此，质量控制和临床应用尤应慎重，许多为特殊管制药物，并已超出药物分析的范畴，体育运动中的兴奋剂问题，世界关注的毒品问题，许多是生物碱类成分。
该类药物的质量应严格控制，以保证用药的安全和有效。
（四）结构特征和分析方法间的关系1.碱性：N原子的存在，强弱从N上的取代基是供电子还是吸电子基团，空间位阻两方面考虑。
1）一般情况：季铵>仲铵>伯铵>叔铵>NH3>环酰铵2）脂肪铵>脂环铵>芳铵3）个别两性化合物如吗啡有酸性（酚羟基），茶碱只有酸性（活泼氢）2.存在状态多数以盐的形式存在1）植物中多与有机酸成盐如吗啡罂粟酸盐，鞣酸奎宁盐；2）药用多为多为无机酸盐如盐酸、硫酸、磷酸和硝酸盐。
含量测定应考虑上述2个因素，碱性强弱选择滴定溶液和指示剂，成盐的情况在非水滴定时要考虑对滴定的干扰。
中药制剂分析第五章各类成分分析
第一节 生物碱类成分分析
定性鉴别 一般理化鉴别 沉淀反应是生物碱理化鉴别常用方法，此反应一般在酸性水溶液中进行 制备样品供试液时必须净化处理，防止假阳性结果
药物分析学科
第一节 生物碱类成分分析
第一节 生物碱类成分分析
三、定性鉴别 2、薄层色谱法 ①吸附剂：硅胶、氧化铝； ②展开剂：多以氯仿、苯等低极性溶剂，加入其他溶剂调整展 开剂的极性； ③由于硅胶显弱酸性，强碱性的生物碱在硅胶色谱板上能形成 盐，使Rf值很小或拖尾、形成复斑等。 ④显色剂：常用改良碘化铋钾试剂，有时喷碘化铋钾试剂之后 再喷硝酸钠试剂，可使样品斑点更加清晰。如有荧光，不用显色 ⑤ 亦可用碘蒸汽、硫酸铈、碘铂酸等其他的试剂显色。
第一节 生物碱类成分分析
四、含量测定 （二）单体生物碱成分含量测定 1、TLCS ①生物碱不具有紫外吸收或挥发性时可用本法测定； ②选用的吸附剂、展开剂及显色方法与鉴别相似； ③使用改良碘化铋钾等作为显色剂时，必须完全挥干展开剂后（尤其在碱性环境下展开的）才可喷洒，否则背景深、反差小，影响测定。
第二节 黄酮类成分分析
四、含量测定 1、总成分的含量测定 直接测定：常用芦丁作对照测定 显色测定：常用铝盐做显色剂 2、单体黄酮成分的含量测定 TLCS HPLC（05版药典全部使用此法） 五、常见黄酮类成分（略）
第三节 三萜皂苷类成分分析
概述 概念 含三萜皂苷类成分的常用中药
第三节 三萜皂苷类成分分析
第一节 生物碱类成分分析
二、理化性质 1、溶解性 大多数生物碱难溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂； 与酸结合成盐后水溶性增加，但酸不同，生成的盐水溶性有差异； 季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水 液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂； 含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液。
生物碱
Alkaloids生物碱(Alkaloids)多指一类从植物中获得的含氮碱性杂环有机化合物，通常具有明显的生理活性，是中草药的有效成分。
生物碱广泛分布于植物界，但含量多寡不定，其中在豆科、茄科、防己科、罂粟科、毛茛科等各科中含量较高。
生物碱在植物体内通常是与有机酸或无机酸结合成盐的形式存在，还有一些则是以苷类、酯类、N-氧化物类等形式存在，只有弱碱性的生物碱是以游离态形式存在。
生物碱具有多种生理功效。
如吗啡碱可以镇痛，可卡因碱可以止咳，麻黄碱可以止喘，阿托品碱可以解痉挛，紫杉醇、喜树碱、长春碱等多种生物碱还具有很好的抗肿瘤活性。
紫杉醇是一种四环二萜类生物碱，主要存在于红豆杉科植物中。
由于其抗癌机理独特且抗癌活性广谱、高效，紫杉醇已成为继阿霉素和顺铂后最热的抗癌药物。
喜树碱属喹啉类生物碱，广泛存在于喜树的果实、根、树皮中，是继紫杉醇之后第2个获准上市的具高效抗癌活性的天然药物。
1.喜树碱喜树(Camptotheca acuminata Decne.)属山茱萸目(Cornales)珙桐科（Nyssaceae)旱莲属植物，落叶乔木，分布于我国长江流域及西南各省和印度部分地区，台湾、广西、河南等地也有栽培，最早的文字记载在1848年的《植物名实图考》中。
1966年，美国的M o n e m e E.Wa l l从喜树的皮中分离出喜树碱(Camptothecin，CPT)，经肿瘤试验证明这种色氨酸-萜烯类生物碱具有抗癌活性，从而引起了人们的广泛关注。
人们先后从喜树果实、根、树皮中发现31种化合物，其中喜树碱及其衍生物10余种。
大量研究证实它们有良好的抗癌活性。
但由于喜树碱不溶于水，加之其钠盐毒副作用较大，因此，人们对喜树碱的结构改造进行了广泛研究，旨在提髙溶解度，降低毒性，延长内酯环在体内的保留时间及增加生物活性等。
迄今所报道的喜树碱衍生物已达数百种，目前，喜树碱类药物已进人临床阶段，并获美国FDA的批准，成为继紫杉醇之后第2个获准上市的具抗癌活性的天然药物。
第一节 含生物碱类成分的分析 一、含生物碱类成分中药制剂的定性
实例 疏风定痛丸中麻黄碱含量测定 P144
第二节 黄酮类制剂的分析
一、含黄酮类成分的定性鉴别 定性鉴别方法主要有化学显色反应，纸色谱和薄层色谱
(一)化学显色反应 1.还原反应 盐酸-镁粉反应显色反应的机理是黄酮类 成分经还原反应后生成花色甙元及其二聚物。
定性鉴别的操作：将中药制剂用适当方法提取分离。组 分较少的制剂可用有机溶剂提取，常用的溶剂有甲醇、乙 醇或乙酸乙酯；取样品液5～10mL，加入数滴盐酸，然后 加入少许镁粉，如果有黄酮、黄酮醇或其二氢化合物存在， 数分钟后则可产生橙色或红色。必要时，需作空白试验。
W =（ A/ε）×M×V/1000 式中，M：生物碱雷氏盐沉淀的分子量，W：生物碱雷氏盐沉淀 的重量；A：吸收度；ε：克分子消光系数；V：丙酮毫升数。 本方法可不需要标准对照品，但需注意生物碱生成单盐或双盐， 并要注意样品的净化。
(2)酸性染料比色法：在一定pH的介质中，生物碱B与氢离子H+ 结合成盐(BH+)，与某些酸性染料的阴离子In-结合成有色化合物 [BH+In-]，它能定量的被有机溶剂提取出来，此结合物碱化或酸化 后，即定量放出染料可进行比色，或测定该有色的有机溶液。
2．与金属盐类试剂的络合反应
黄酮类成分能与金属离子如Al3+，Zr4+等产生络合 作用，产生荧光或颜色加深等。
中药制剂中各类化学成分分析
中药制剂中各类化学成分分析第一节生物碱类成分分析1．含生物碱的中药有三尖杉、麻黄（麻黄碱）、黄连（小檗碱）、黄柏（小檗碱）、乌头（乌头碱）、延胡索（延胡索乙素）、粉防已（粉防已碱）、颠茄（莨菪碱、东莨菪碱）、洋金花（莨菪碱、东莨菪碱）、贝母（贝母素甲、乙，贝母碱）、百部等。
2．生物碱定性鉴别：取分离提取得到的生物碱（麻黄碱）供试品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为供试品溶液；另取盐酸麻黄碱对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
吸取供试品溶液2ul，对照品溶液1ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试剂（12:6:3:3:1）为展开剂，置氨蒸气预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外灯（365nm）下检视。
供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
3．生物碱含量测定色谱条件：以十八烷基硅烷键合相硅胶为填充剂；以甲醇-水（50:50）为流动相；流速1.0ml/min；检测波长为254nm；柱温为室温；理论塔板数按盐酸麻黄碱计算应不低于3000. 供试品溶液的制备：取分离提取得到的麻黄碱供试品，加醋酸乙酯制成每1ml含0.1mg的溶液，作为供试品溶液；对照品溶液的制备：取盐酸麻黄碱对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
第二节黄酮类成分分析1.含黄酮的常用中药有槐米（芦丁，槲皮素）、黄芩（黄芩苷）、葛根（葛根素）、陈皮（橙皮苷）、银杏叶（芦丁、槲皮素）、淫羊霍（淫羊苷霍）等。
2.黄酮的定性鉴别薄层色谱法：硅胶色谱分离弱极性化合物较好，聚酰胺色谱分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类较为理想，而纤维素薄层适用于分离多糖苷混合物。
取分离提取得到的黄酮葛根素液1ml，加75%乙醇溶液5ml,摇匀，作为供试品溶液；另取葛根素对照品，加75%乙醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
生物碱分析
2000
1500
杂质峰多 连翘中木脂素 类干扰测定 注射剂直接进样
麻黄碱 东莨菪碱
1000
500
0
0
10
20
30
40
min
生物碱
木脂素
碱化有机溶 剂法
注射剂加浓氨水 调pH12.0
酸碱处理法
注射剂加稀HCL 调pH3.0
氯仿萃取 水层加浓氨水 调pH12.0 氯仿萃取
碱性
麻黄碱 pKa9.58 东莨菪碱 pKa7.50
药材 酸水处理，过滤
原理 当溶液pH< pKa时， 以盐的形式存在 生物碱盐易溶于水
酸水液（盐）
酸水难以浓 缩？
不溶物 （脂溶性杂质）
碱化（游离） 氯仿萃取 氯仿液（游离）
碱水液 回收 （水溶性杂质） （水溶性生物碱） 较纯的总生物碱
3、醇-酸水-有机溶剂提取法
原理 生物碱及其盐类易溶于 甲醇或醇。 故用甲醇代替水或酸水
二、 分布
50多科，120属以上植物中有生物碱存在。
以双子叶植物最多，其次是单子叶植物、裸子植物。
以罂粟科、豆科、防己科、毛茛科、夹竹桃科、茄 科、石蒜科等科的植物中分布较多。 含生物碱的中药很多，如三尖杉、麻黄、黄连、乌 头、延胡索、粉防己、颠茄、洋金花、萝芙木、贝母 、槟榔、百部、苦参、马钱子等。
苦杏仁： 苦杏仁苷
主要成分：麻黄碱、东莨菪碱 具有显著生理活性 麻黄碱用药过量时易引起精神兴奋、 失眠、不安、神经过敏、震颤等症状
选择麻黄碱 和东莨菪碱 作为质控指 标
莨菪碱的治疗剂量具有安定镇静作用， 但可兴奋呼吸中枢
DAD1 C, Sig=210,8 Ref=off (YJ\08041461.D) mAU
生物碱
生物碱类成分含量测定分析方法研究进展摘要：生物碱类成分是一类重要的具有多种多样的生物活性的天然含氮有机化合物，其含量测定方法多种多样，关于其定性、定量的方法得到了广泛深入的研究。
本文就近年来有关生物碱类成分含量的测定分析方法研究进展作一综述，以期为生物碱类成分含量测定方法的进一步研究提供文献依据和分析思路。
关键词：总生物碱；单体生物碱；含量测定生物碱类成分是一类重要的天然含氮有机化合物，也具有多种多样的生物活性。
生物碱类成分是中草药中主要的化学和生物活性成分之一，因此，常常把生物碱类成分作为中药研究的一指标成分，关于其定性、定量的方法得到了广泛深入的研究。
绝大多数生物碱因为其分子中氮原子上的孤电子对能接受质子而显碱性。
溶解性方面，绝大多数仲胺和叔胺生物碱具有脂溶性，而水溶性生物碱主要包括季铵碱类和某些含N- 氧化物的生物碱。
这些生物碱的理化性质为其提取和含量测定提供了理论依据。
生物碱类成分含量测定方法分为总生物碱和单体生物碱含量测定两大类，目前有关总生物碱以及单体生物碱的含量分析测定方法有很多：化学分析法、酸碱滴定法、直接分光光度法、离子对萃取比色法薄层色谱法、高效液相色谱法和高效毛细管电泳法。
但各有其优点和不足，本文分别对近年来总生物碱和单体碱类成分的含量测定分析方法研究进展做一综述。
1 总生物碱含量测定方法1.1 化学分析法化学分析法包括重量分析法和酸碱滴定法，酸碱滴定法较为常用，此法灵敏度较低，但因操作简便、成本低廉、准确性和稳定性较好，而仍被用于某些生物碱的含量测定。
酸碱滴定法又根据所用溶剂性质不同，分为水溶液酸碱滴定法和非水溶液滴定法，根据生物碱成分碱性强弱的不同采用不同溶剂的酸碱滴定法。
如对于某些碱性较弱的生物碱类成分，因在水溶液中进行滴定时没有明显的滴定突跃，故选择非水滴定法，并用质子性溶液冰醋酸等增强其碱性。
王安行等[1]采用酸性染料两相滴定法测定浙贝母总生物碱的含量。
也有研究者用非水滴定法分别测定咳喘平胶囊[2]和黄杨宁片[3]的总生物碱含量Krisztina 等[4]通过研究比较非水滴定法测定13种生物碱类，发现当生物碱的pKa值大于7 时，此法具有良好的准确度和精密度。
中药制剂中各类化学成分分析
– 检测器 萜类内酯（蒸发光散射）
中药制剂中各类化学成分分析
§2 黄酮类成分分析
银杏叶提取物总黄酮醇苷含量测定
[含量测定]色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为 填充剂；以甲醇-0.4%磷酸溶液（50：50）为流动相；检测波长为360nm。 理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500，山柰素酚峰与异鼠李素峰的分离 度应大于1.5。
• 气相色谱法 中药制剂中各类化学成分分析
§2 黄酮类成分分析
O
HO
OH
• 概述 2-苯基色原酮
OH
• 理– 化物理性性质状（存在的形态，颜OH色，挥O 发性OH，光学活性）
– 溶解性 – 酸碱性
游离甙元—易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等 黄酮甙—易溶于水、甲醇、乙醇
• 酸性：与酚羟基的数目和位置有关
§1 生物碱类成分分析
• 含量测定
– 单体生物碱含量测定
• 薄层色谱法 • 高效液相色谱法
– 液—液分配色谱法（以反相为主，如ODS或C18） » 改进流动相（硅醇基抑制剂、低浓度的离子对试 剂、季铵盐试剂、电解质缓冲液） » 固定相改进（封尾技术）
– 液—固吸附色谱法 – 离子交换色谱法（阳离子交换树脂） – 检测器
P96
第五章 中药制剂中各类化学成分分析
楼一层
中药制剂中各类化学成分分析
§1 生物碱类成分分析
• 概述:--什么是生物碱 • 理化性质
– 物理性状（存在的形态，升华性，挥发性，光学活性） – 碱性 – 溶解性
游离—易溶于CHCl3，Et2O，EtOH等有机溶剂 生物碱盐—水溶性增强 – 沉淀反应
生物碱
生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合物（如氨基酸、蛋白质和B族维生素等）之外的所有含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的未共享电子对而大多具有碱性。
生物碱绝大多数具有显著的生物活性，且活性是多方面的，因此中药制剂中有含有生物碱类成分的中药时，常选择该中药含有的生物碱成分作为定性定量的依据。
结构特征生物碱大多由C、H、N、O元素组成，极少数分子中尚含有其他元素；大多结构复杂，结构类型较多，主要有杂环类、大环类、萜类、甾类及有机胺类等。
结构中的氮原子有多种形式：脂氮、芳氮；季胺、叔胺、仲胺及伯胺；游离状态和与酸结合状态；还有以氮氧配位键形式存在的。
此外，结构中除烷烃、羟基取代外还有羧基、酚羟基等酸性官能团及酯键的取代。
理化性质--物理性状多数生物碱为结晶型固体，少数为无定型粉末，还有一些小分子生物碱为液体，例如槟榔碱、菸碱等；液体状的生物碱及个别小分子生物碱尚有挥发性甚至升华性，如麻黄碱具有挥发性、咖啡因具有升华性等。
一般生物碱为无色或白色，但结构中具有较长共轭体系，并有助色团的，可显不同颜色。
生物碱结构中如有手性碳原子或为手性分子的具有旋光性，并大多与生物碱的生理活性有关，通常左旋体比右旋体生理活性强。
理化性质--溶解性由于生物碱结构复杂，生物碱的溶解性也是多样化。
大多数生物碱成分极性较小，游离状态下难溶于水，易溶氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等有机溶剂，与酸结合生成生物碱盐后水溶性增加，但与生物碱结合的酸不同，生成的盐水溶性也有差异，一般含氧无机酸及小分子有机酸的生物碱盐水溶性较大。
季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱易溶于水，液体生物碱及一些小分子固体生物碱则既溶于水也可溶于有机溶剂。
含有酸性官能团或酯键的生物碱还可溶于一些碱液或热苛性碱液。
此外一些液体状态的生物碱和分子量较小的固体生物碱，如麻黄碱等具有挥发性。
理化性质--沉淀反应大多数生物碱在酸性水溶液中可以与某些试剂生成不溶于水的复盐或分子复合物，这些试剂称生物碱沉淀试剂。
生物碱类成分的主要性质及分析特征
3、蒽醌类单体成分的测定
•中药制剂中蒽醌类单体成分的测定一般要将样品水解 后再进行测定，测定方法主要有薄层扫描法和高效液相 色谱法。 • 薄层扫描法为蒽醌类成分常用定量分析方法，经层析 分离后，可在可见光、紫外光及荧光下扫描测定。 • 蒽醌类成分在紫外及可见光下均有强吸收，利用高效 液相色谱-紫外可见光检测器测定蒽醌类单体成分，具 有灵敏、准确、简便等特点。在含蒽醌类化合物的中药 制剂分析中应用日趋增多。
（二）中药中生物碱分析 1、总碱分析 （1）定性鉴别 由于中药制剂中成分复杂，有些成分如蛋白质、多肽和 鞣质等也可与试剂生成沉淀而造成假阳性结果，因此，制 备样品供试液时必须净化处理，除去干扰成分，方能用沉 淀反应进行中药制剂中生物碱类成分的鉴别. （2）总生物碱的含量测定 • 化学分析法 化学分析法包括重量分析法和容量分析法。目前主要使 用酸碱滴定法。
强碱滴定生物碱盐时,在70%-90%的乙醇介质中终点比 在水中明显,因此常将生物碱盐溶于90%乙醇,再用标准碱 乙醇液滴定. 酸碱滴定法指示反应终点可用指示剂和各种电位法。 • 分光光度法 目前多用单波长光度法，测定波长可选用待测生物碱 成分本身的吸收波长，也可加入某些试剂如亚硝酸钠试剂、 雷氏盐试剂及酸性染料等反应显色后用可见光波测定。 常用方法：直接测定、离子对萃取比色法
（三）应用示例
戊已丸中生物碱的含量测定 处方组成：黄连、吴茱萸（制）、白芍（炒）。 取本品粉末（过三号筛）0.7-0.9g，精密称定，置索 氏提取器中，加盐酸-甲醇（1：100）适量，加热回 流至提取液无色，提取液浓缩后移至25ml量瓶中， 加乙醇稀释至刻度，摇匀。精密量取5ml，置氧化铝 柱（内径约0.9cm，中性氧化铝5g，湿法装柱，用乙 醇30ml预洗）上，用乙醇35ml洗脱。收集洗脱液， 置50ml量瓶中，加乙醇稀释到刻度，摇匀，照分光 光度法，在345nm处测定吸收度，按盐酸小糪碱的 吸收系数728计算，即得。本品按干燥品计算，每1g 含生物碱以盐酸小糪碱(C20H18ClNO4)计，不得少于 30mg。
GC-MS法分析两种石蒜中生物碱类成分
物质基 础方 面快速 准确鉴 别该属 植物 的相 关报 道 。 产 自贵州 的红 花石 蒜 （ｙｏｉｒｄａａ 和 黄 花石 蒜 Ｌｃｒ ａ ｉ ） ｓ ｔ （ｙｏ ａｒａ 均 为 石 蒜 属 主要 植 物 ， 药 用 部 位 Ｌｃ￣ ｕｅ） 其
均为鳞 茎 ， 观 相 似 。因 此 ， 研 究 拟 通 过 Ｇ 外 本 Ｃ— Ｍ Ｓ法对两 种植 物鳞茎 中生物 碱种类 及含 量进行 分
大 、 内形态 差异又 较大 ， 一些 种存 在多 型现 象 ， 种 且
仪 （ 国安捷 伦公 司 ） １０ 目金属筛 ；０ Ｌ容 量 美 ；０ ５０ｍ 瓶 ；０ ０ Ｌ分 液漏 斗 。乙醇 、 １０ ｍ 氯仿 、６ ～３％ 浓 ３％ ８ Ｈ１ Ｃ 溶液 、 无水 碳 酸钠 均 为 分 析纯 （ 庆 江川 化 工 重 有 限公 司 ） 甲醇 为 色 谱 纯 （ 津市 科 密 欧 化 学 试 ； 天
３２ 本研究 所 检 测样 品均 产 自贵州 ， 以该 数 据 ． 所
仅适 用 于 贵 州 本 地 及 周 边 地 区两 种 植 物 的 鉴 别 。
但石 蒜属植 物 同种不 同产地 营养 特征不 同 ， 否会 是 造成 同种植 物 化学成 分 的地 域性 差异 ， 还有 待进 一
步研 究 。
颖， ． 等 石蒜科植物生物碱成分的药理学研究 ［ ］ Ｊ ．中医药学刊 ，０ １ １ （ ） ５ ３ ７ ． ２ ０ ，９ ６ ：７ —５４ 巍 ，等 ．石蒜属植物分类鉴别、 药用成 分及生物技术应用研 究进展 ［ ］ Ｊ ．中草药 ，０ ７ ３ （ ２ ： ２０ ，８ １ ）
冰 ．石蒜属不同种间生 物碱含量差异性研究［ ］ Ｊ．江西农业大学学报 ，００， （ ）５ ０— ６． ２ １ ３ ３ ：６ ５ ５ ２
天然药物化学 生物碱类药物分析
梯度洗脱
第三节
含量测定
一、非水碱量法 在水中碱性较弱，不能顺利地进行中和 滴定（滴定突跃不明显，难以判断滴定 终点）。 在酸性非水介质中（如gHAc中），则能 显示出较强的碱性，滴定突跃增大，可 以顺利地进行中和滴定。
1．测定方法 ＊ 供试品：以消耗标准液8ml计算。 ＊ 溶剂：gHAc，一般用量10~30ml， ＊ 滴 定 剂 ： 0 . 1 mol/L HClO4/ 无 水 gHAc 溶液 ＊ 指示剂：结晶紫 ＊ 做空白试验
常用试剂：I2—KI 碘化铋钾 碘化汞钾 鞣酸 硅钨酸
2．显色反应 生物碱固体 + 生物碱显色试剂→颜色 常用：C· H2SO4、C· HNO3、钼硫酸 特征鉴别试验 1.双缩脲反应（具有氨基醇结构的生物碱 的特征反应）
例如：盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱
2.Vitali反应（托烷类）
供试品 发烟HNO3 黄色 醇制KOH 深紫色
2
反应的摩尔比是1∶1
ⅱ．加入高氯酸钡消除H2SO4的影响
CH CH2 CH(OH) CH3O N CH CH2 CH(OH) CH3O N
N 2 H 2 SO 4 N 2
N+ H
. SO2 4
N+ H
N 2 H 2 SO 4 2( N HClO 4 ) Ba (ClO 4 ) 2 BaSO 4 N 2 N 2
2( N HClO 4 ) 2( N HClO 4 ) 2HClO 4 N 2 2( N HClO 4 )
加入高氯酸钡，摩尔比是1∶2
iii 硫酸奎宁片的含量测定
供试品适量
分取氯仿液 氢氧化钠 溶液 高氯酸滴定 二甲基黄指示液 醋酐 氯仿
中药制剂分析第五章中药制剂中各类化学成分的分析
3BH3PO412MoO3·2H2O （白色至黄褐色,加氨水 转变为兰色）
4.呈色反应
+ 酸性染料 一定pH值 有色配合物
5.碱性 生物碱碱性强弱是中药制剂分析时供试 品溶液制备、某些分析方法建立及条件选择 的依据。
三、定性鉴别 （一）一般理化鉴别 沉淀反应是生物碱最常用的鉴别方法。 有些成分也可与试剂生成沉淀而造成假
本法测定的关键在于 介质的pH值， 酸性染料的性质， 有机溶剂的性质。
2.苦味酸盐法：
凡是在弱酸或中性溶液中能与苦味酸定量 发生沉淀的生物碱,都可按本方法测定含量。
a.是滤取生物碱-苦味酸盐沉淀，加碱使生 物碱-苦味酸盐解离，然后以有机溶剂提出生 物碱，将苦味酸的碱性水溶液进行比色，再 换成生物碱的含量。
(二)理化性质
1. 物理性质
多为结晶型固体，少数为液体
一般生物碱为白色或无色，但结构中具 有较长共轭体系，并有助色团的可显不 同颜色
旋光性与胜利活性相关，左旋体比右旋 体生理活性强
3. 沉淀反应
生物 碱的 酸性 水溶 液或 稀醇 溶液
硅钨酸 磷钨酸 磷钼酸
(BH+)4[Si(W3O10)4] (淡 黄色或灰白色)
生物碱的雷氏盐沉淀的丙酮溶液所呈现的 吸收特征，是由于分子结构中的硫代氰酸铬 铵部分，而不是结合的生物碱部分，其吸收 值与样品或溶剂无关。
硫代氰酸铬铵在丙酮中的克分子吸收 系数为106.5(单盐)或213.0(双盐)。故可 根据其吸收值A按下式直接测得样品重
W =（ A/ε）×M×V/1000
3．高效液相色谱法
在恒定的高效液相色谱条件下，各种生 物碱都具有一定的保留时间，可作为定性 鉴别的参数。一般要求取得两个色谱系统 的保留时间，或应用二级管阵列检测器作 出鉴定
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固 体 剂 型 回 流 提 取
——
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液 体 剂 型 液 液 萃 取
——
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固 体 剂 型 大 蜜 丸
——
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定性鉴别
色谱鉴别
2.纸色谱法： 显色：含硫酸的试剂不可 3.HPLC法： 快速、灵敏、微量
Rt值法，峰面积 or 峰高加大法（用内标）
经干燥滤纸滤过除去水分。
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2010版 乌头总生物碱+ 麻黄HPLC定量
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酸性染料分光 光度法 水相pH的选 择是分别取乌 头碱标准液， 以不同pH的 缓冲液进行试 验，pH3.0较 好。该条件下， 吸收度较大， 指示液空白对 照吸收度较小， 呈色稳定性好
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I 将此沉淀过滤洗净后溶于丙酮/甲醇直接比 色测定，换算生物碱的含量；
II 精密加入过量雷氏盐试剂，滤除生产的生物 碱雷氏盐沉淀，用滤液进行比色测定残存的过量 雷氏盐含量，间接计算生物碱的含量（雷氏盐剩 余比色法）。
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分光光度法
雷氏盐比色法
注意事项：
1.雷氏盐的水溶液室温可分解，应新鲜配制，沉
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分光光度法
酸性染料比色法
有机溶剂的选择：根据离子对与有机相能否形成氢键以及形
成氢碱能力的强弱，氯仿、二氯甲烷与离子对形成氢键，有
中等程度的萃取率，选择性好，是常用的提取溶剂 有机相中的水份的影响：微量水分使氯仿发生浑浊，且水相
中的过量染料影响测定结果。有机溶剂提取液可加脱水剂或
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分 光 光 度 法： 直 接 测 定 法
2010版药典：HPLC 定量黄连、炒白芍
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分 光 光 度 法： 直 接 测 定 法
2010版药典：HPLC 定量黄连
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分光光度法 离子对萃取比色法
范围：中药制剂中微量生物碱的含量测定
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分光光度法
酸性染料比色法
关键：介质的PH、酸性染料的种类、有机溶剂 pH值的选择：染料的性质及生物碱的碱性，生物 碱一元碱与溴百里酚蓝形成1：1的离子对，
pH(5.2~6.4)，二元碱形成1：2的离子对，
pH(3.0~5.8) 常用染料：溴百里酚蓝、溴甲酚绿、溴酚蓝、溴甲 酚紫
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7.检测器的选择：UVD 8.定量分析 8.1方法学考察：专属性，线性关系和范围，精密 度试验，重现性试验，稳定性试验 8.2含量测定：
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第五章 中药制剂中各类化学成分分析
第一节 生物碱类成分分析
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大纲要求
熟悉生物碱类成分结构特征及理化性质 掌握生物碱类制剂定性鉴别常用方法
含量测定
总生物碱含量测定 化学分析法
范围：处方药味少，内含成分简单的中药制剂 酸碱滴定法：生物碱碱性强弱，水/非溶液酸碱滴 定法
重量法：提取生物碱成沉淀 or 加生物碱沉淀试剂
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酸碱滴定法
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子对而大多具有碱性。
绝大多数具有显著的生理活性 中药材中生物碱多和植物酸性成分结合成盐的状态存在
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结构特征及理化性质
结构特征 CHON 理化性质
大多数生物碱 在酸性水溶液中可 以与某些试剂生成 不溶于水的复盐或 分子复合物，这类 试剂
物理性状：结晶性固体；液体、小分子固体（挥发性、升华性），多无色 溶解性：多样性 沉淀反应：生物碱沉淀试剂，定性（蛋白质、多肽、鞣质，避免假阳性） 显色反应：纯品，少用于制剂中生物碱分析 碱性：多呈碱性，碱性强成盐弱游离，供试品制备及分析方法建立及条件 选择的依据 紫外光谱特征：共轭体系，紫外吸收
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常见生物碱类成分的中 英文对照
小檗碱：berberine 士的宁：strychnine 乌头碱：aconitine 苦参碱：matrine 甜菜碱：betaine 麻黄碱：ephrine 水苏碱：stachydrine 吴茱萸碱：evodiamine
原理：一定PH介质中，有机碱与一些酸性染料或磺酸类、 酸类的阴离子，定量结合为有色离子对，离子对定量溶于 某些有机溶剂，一定波长下测定有机溶剂的或碱化后释放 出的染料的吸收度，按分光光度法计算有机碱的含量。
常用方法：酸性染料比色法和苦味酸盐比色法
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分光光度法
酸性染料比色法
适当PH介质中，生物碱可与氢离子结合成生物 碱盐的阳离子，而酸性染料在此条件下解离为阴离子， 生物碱盐的阳离子与染料阴离子定量地结合成有色的 配合物（即离子对），此离子对可定量地溶于某些有 机溶剂，测定有机溶剂的吸收度 or 经碱化后释放出 的染料的吸收度，即可计算生物碱的含量。
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定性鉴别
一般理化鉴别
沉淀反应多用：酸性条件，净化处理（除蛋白质、 多肽、鞣质），制剂中两种以上含生物碱药材（难 说明问题）
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马钱子主含生物碱。以番木鳖 碱(士的宁) 与马钱子碱(布鲁 生) 为主, 主效成分及毒性成 分。生物碱以盐的形式存在， 加浓氨水使生物碱盐转变成游 离碱，易溶于氯仿有机溶剂。 地龙含较多多肽、蛋白质等， 不溶于有机溶剂。
淀需在低温进行
2.中药制剂应先纯化处理 3.雷氏盐的丙酮or丙酮－水溶液吸收值，随时间 有变化，应尽快测定
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超声处理：
不同功率、频率 超声提取仪对含 量测定的结果不 同 在同一提 取器内由于摆放 部位不同提取效 果也不一致。
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含量测定
单体生物碱的含量测定
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含量测定
反映中药制剂中含生物碱的真实情况 提取、净化、分析测定均要准确
方法学考察内容
1.提取净化条件的考察 2.测定方法与条件的选择 3. 定量分析方法验证 3.1 专属性 3.2 线性关系考察 3.3 精密度试验
3.4 准确度试验 3.5 稳定性试验
3.6 测灵敏度及检测限的测定
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溶液后标示的“（1－10）”等符号， 系指固体溶质1.0g或液体溶质1.0ml 加溶剂使成10ml的溶液；未指明用 何种溶剂时，均系指水溶液；
重 量 法
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含量测定
分光光度法
样品分离、净化（化学法、柱色谱法、TLC法等） 直接测定法：不经过化学反应用生物碱物质自身 的吸收波长 范围：药物少，内含成分简单的中药制剂 离子对萃取比色法
C18)
硅醇基酸性大，生物碱可与其牢固键合，保留时间
延长，峰形变宽，拖尾，克服措施：
改进流动相
改进固定相
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含量测定
HPLC法：改进流动相： ①流动相中加入硅醇基抑制剂，竞争或部分阻断硅醇剂的 影响，最常用硅醇基抑制剂是二乙胺、三乙胺（TEA) 等。
②采用离子对色谱系统：合适的pH下，流动相中加入低
TLC
HPLC GC
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含量测定
单体生物碱的含量测定
TLC法：样品需纯化，吸附剂、展开剂及显色与鉴别相
似，要求更严格
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3
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2010版药典：HPLC法定量黄连
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含量测定
HPLC法：反相HPLC法应用多（ODS or
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定性鉴别
色谱鉴别
1.TLC法： 常用载体：硅胶 常用展开剂：氯仿、苯及相应极性调节剂
硅胶弱酸性，形成盐至Rf值小、拖尾、复斑，碱性展开系统or碱性条件下
显色剂：改良碘化铋钾（橘红色） 供试品的制备：处方、剂型、存在状态、溶解性、共存成分的性质
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思考题
小儿清热片质量分析方案设计，请设计本品定性鉴别、 检查及含量测定分析方案。 定性鉴别：对照品、对照药材、鉴别方法（要不少于5味 药材） 检查：片剂的检查内容
含量测定：所测成分、提取净化方法、测定方法、含量
测定方法学考察内容
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名称 处方 制法 性状 鉴别 检查 浸出物测定 含量测定 功能与主治 用法与用量 注意 规格 贮藏
掌握生物碱类制定量分析常用方法
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问题
生物碱类成分的理化性质？
含生物碱类成分的中药制剂制备供试品时需考虑
的问题？ 含生物碱类成分中药制剂定性鉴别，以硅胶为载 体时，展开系统需注意的问题？ HPLC法分析制剂中单体生物碱的含量时，改进流 动相的常用方法？
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概述
定义 生物碱是生物界除生物体必须的含氮化合物 （如氨基酸、蛋白质和B族微生素等）之外的所有 含氮有机化合物，因其结构中氮原子上的未共享电
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进展
High performance capillary electrophoresis, HPCE
高灵敏度 高分离效率（比HPLC 高得多:理论板数在百万以上，最高可达 10,000,000/m ） 高速度 （一般一次分离仅需几十秒钟至数分钟） 所需样品量少:进样量 1-10 Nl,样品量 5ul -5 mL 检测 :在线检测 自动化: 自动进样，缓冲液交换，数据处理 重现性: 迁移时间 0.5% 运行成本较低 应用范围极广 有多种模式 可免于接触HPLC流动相的毒性和污染