病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒71型比较

病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR法检测肠道病毒71型比较
评价病毒分离培养、RT-PCR及实时荧光RT-PCR法对于肠道病毒71型的检测效果。

方法分别用病毒分离培养、RT-PCR、实时荧光RT-PCR方法对2009年龙岩市手足口病哨点监测医院送检的153份手足口病患者咽拭子样本进行EV71检测，并对检测结果进行配对卡方检验。

结果3种方法总体符合率为81.0%，3种检测方法对样本中EV71阳性检出率差异无统计学意义（P＞0.05）。

结论病毒分离、RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法均适用于EV71的检测，可以作为EV71的日常临床诊断方法。

手足口病是全球性传染病，研究表明，主要由肠道病毒71型（EV71）和柯萨奇病毒A组16型（CA16）引起[1]。

2种病毒基因型相似并且表现类似的临床症状，其中EV71还能引起严重的神经系统疾病，甚至危及生命，因而具有更大的危害性[2，3]。

2008-04/05，通过病毒分离、RT-PCR、实时荧光RT-PCR 3种方法同时对2009年龙岩市手足口病监测哨点医院送检的153份手足口病患者咽拭样本进行EV71检测。

现将检测结果分析如下。

1 材料与方法
1.1 样本来源采集龙岩市手足口病监测哨点医院手足口病患者咽拭样本。

样本由专业人员采集，置于保冷箱送检。

所有样本置-70℃保存备用。

1.2 方法
1.2.1 样本处理咽拭子在样本保存液中充分搅动（至少40下），以洗下拭子上黏附的病毒及含有病毒的细胞等，然后在4℃条件下，1000r/min离心20min，用上清接种细胞及提取病毒RNA。

1.2.2 病毒分离咽拭子样本经过滤除菌后直接接种人横纹肌癌细胞（RD），每份样本同时接种两管，待管内细胞长满单层时，每管接种0.2mL，置于37℃、5％的二氧化碳培养箱内培养，每日观察细胞病变（CPE），待CPE达到+++以上将培养管置于－20℃保存，即为阳性分离株；如果无CPE，则盲传2代，每代连续观察7d以上，判为阴性株。

1.2.3 病毒RNA的提取用QIAGEN Viral RNA Mini Extraction Kit（CAT：52904）试剂盒分别从咽拭上清和病毒分离培养物中提取，具体的方法见文献[4]。

1.2.4 RT-PCR反应用EV71特异性引物对样本进行一步法RT-PCR反应，引物序列由国家CDC提供，EV71-S上游：5`-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3`，EV71-A下游：5`-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3`。

PCR产物长度为226 bp。

反应体系所有耗材均购自TaKaRa公司，反应体系25 μl，其中Taq DNA聚合酶0.15 ul，M-MLV 0.25 ul，PCR Buffer 2.5 ul，dNTPs 2.0 ul，RNase Free dH2O 12.1 ul，上游引物与下游引物（10μmol/L）各0.5 μl，模板7 ul。

在Life Pro基因扩增仪上进行扩增。

反应程序：42℃45min 1个循环，然后95℃20s、45℃30s、72℃30s 进行35个循环后转入72℃•10min。

取8μl扩增产物在2%琼脂糖（含EB）上电泳，在100V电压电泳30min，用自动凝胶成像系统分析结果。

1.2.5 实时荧光定量RT-PCR 采用深圳太太基因工程有限公司EV71实时荧光RT-PCR试剂盒，按说明书进行反应体系的配制和循环参数的设置，同时设置阳性和阴性对照。

在实时荧光PCR检测仪（ABI 7300）上进行PCR检测。

结果判定严格按照仪器操作说明书和PCR 检测试剂盒说明书进行。

1.3 质量控制由两位实验员分别用病毒分离、RT-PCR、实时荧光RT-PCR三种方法同时进行EV71检测。

正式实验前，对实验人员进行统一培训，统一实验标准和步骤，确保实验结果真实可靠。

对结果有差异的样本，由两人共同进行一次复检，根据复检结果修正试验结果。

2 结果
2.1 3种方法检测结果比较共对153份咽拭样本同时进行3种方法的检测，病毒分离培养法有病变的共有28份，经RT-PCR鉴定EV71阳性22份，阳性检出率为14.4%；RT-PCR 法检出EV71阳性17份，阳性检出率为11.1%；实时荧光RT-PCR法检出EV71阳性26份，阳性检出率为17.0%。

其中3种方法均检出阳性的样本有8份，阳性符合率为5.2%，3种方法均检出阴性的样本有116份，阴性符合率为75.8%，总体符合率为81.0%。

2.2 3种方法检测结果两两比较用配对设计下两组频数分布的卡方检验对3种实验方法的结果进行比较，P值均大于0.05，均无显著性差异，说明3种方法检测出阳性样本的概率是一样的，即3种方法从咽拭样本中检出EV71的结果差异无统计意义，见表1、表2、表3。

3 讨论
手足口病主要由EV71和CAl6引起，一般感染学龄前儿童，是一种可预防、可治愈的疾病，治疗关键在于早发现、早诊断。

对于实验室检测方法选择应用，主要是考虑方法本身的敏感度与特异性以及适用性，3种方法在阳性检出率方面没有统计学差异，特异性和适用性方面却各有所长。

分离培养可获得特定的病毒，对于疾病的诊断来说有直接证据的作用，对于确定诊断意义重大，但由于实验操作步骤烦琐、检测周期长，无法满足疫情早期诊断的需要[5]，但该方法适用于进一步病原研究。

近几年来，PCR技术已广泛应用于病原微生物的检测与诊断，RT-PCR法也是卫生部《手足口病预防控制指南》（2008年版）推荐的检测方法，它相对于病毒分离培养法节省了很多时间，仪器设备和试剂的费用相对便宜，容易在各级疾控部门开展，可以满足疫情流行期大量样本的快速检测。

实时荧光RT-PCR采用单管闭合及特异性标记的探针来实时监控扩增产物，扩增后不打开管盖直接通过管内荧光强度进行定量，在检测时间和检测灵敏度上均有了明显的提高，被广泛地应用于各种病原的检测[6]，但由于仪器的购置费用较高，较难在基层单位中推广。

本研究通过三种方法的比较，实时荧光RT-PCR阳性检出率略高于其他两种方法，但差异尚无统计学意义，各实验室可根据自身的条件及开展检测的目的选择相应的检测方法。

手足口病已在世界范围内流行，导致严重的并发症甚至死亡。

目前对其流行特点已有了较深的认识，建立高效、快速、简便、特异的检测方法以适应各层次检测部门为今后的重点。