色氨酸及其主要代谢产物的分离和在生物样品中的测定

４ ｉ ， ｉ Ｗ Ｌ Ｘ ｔ Ｊ ｏ ａ ｇ， ９ ， Ｙ Ｙ Ｌａ Ｐ ｕ ｅａ Ｃ ｒ ｔ ｒ １９ Ｈ ｏ ， Ｆ ｌ ｈ ｍ ｏ ． ４
６ １： ４ － ４ ６ １ ３１ ８
５ 廖卫平， 陆雪芬 ． 色谱， ９， （）１８ １ １ ２１ ２： ～１９ ９ ０ １
６ ｈ ａｇ ， ａａ Ｆ Ｊ ｒｍ ｔ ｒ １９ ，３ ：３ Ｃ ｕｎ Ｃ Ｒ ｇｎ Ｚ Ａ． Ｃ ｏ ａｏ ， ９０ ５４１－ ｈ ｇ
Ｘ 故选 择紫 外波 长为 ２５ ｍ， Ａ， ４ ｎ 以利 于 Ｋ 和 Ｘ Ａ Ａ
的检测。 不少生物样品中的５ Ｔ等物质浓度很低， － Ｈ 需要电化学检测器检测， 其检测条件我们已报道 过［。－Ｋ ４ ３Ｈ Ｎ在检测电压为０４ ］ ． Ｖ以上时开始有响
应 ，． Ｖ 时响应 接近最 大 。而 Ｋ Ｘ ０７ Ｎ， Ａ和 Ｔ Ｐ在 Ｒ
样品 中 ３ Ｋ 检 獬成晌？赡 能。 流 鞫 嘀泻 ５ － 觳测 可 堋 Ｔ诹
ｍ ｏ／ ｍ ｌＬ三氯乙酸的情况下再观察ｐ Ｈ值对各物质
保 留时 间的影 响 ， 发现 其变 化 明显不 同于在 流动相
中胁不 三 含 氯乙 酸 的情 ，尤其 ｐ 那榭况 ≥ ． ５ ０ Ｔ Ｈ － 保
由于３ Ｋ － Ｎ保留时间短， Ｈ 而有的生物样品成分 复杂， 容积峰大，－Ｋ ３Ｈ Ｎ常被掩盖。Ｃ ｕｎ ６ ｈａｇ等［用 ］
研究报告
色氨酸及其主要代谢产物的分离和在生物样品中的测定＊
易咏红
提 要
廖卫平
赵绮华
广州 ５０６） １２０
陆雪芬
（ 广州医学院神经科学研 究所
建 立 以 砸酸 缓 冲 系统 和 联 用 的 高 效 液 相 色 谱 法 ， 离 和 测 定 了 色 分
μ Ｌ直接进样。 血清０５ Ｌ加３５ ｏ／ ．ｍ ．ｍｌ Ｌ过氯酸０２ ． ｍ ， Ｌ 振荡后 ４００ ｆ ０ ｇ 离心 １ ｍｉ， ０ ｎ取上清液 ５ 蘈 ０μ Ｌ
进 样 。
３Ｈ Ｎ无明显影响， －Ｋ 未用于生物样品测定。Ａ － ｓ ｍ ｓ］ ｕ［用三氯乙酸作离子对试剂以帮助分离儿茶酚 ７
胺［ ７ ］ 。 研 芯恐杏闷渥 为 胱 对 烈 加 本 究 用 作 离 佣试剂以增 ３－ ＫＮ
本研究使用的流动相在 ｐ ． 和三氯乙酸浓 Ｈ４０
Ｅ Ｄ上需要较高电压（．９Ｖ） ０９ 才有较好的响应［］ １， ０ 这不利于其它物质的测定， 故用ＵＶ检测。
度为５ ｍ ｏ／ ０ ｍｌ Ｌ时， 各物质可得到较好的分离。但 不同生物样品中Ｔ Ｐ各代谢产物浓度差别很大， Ｒ 其 来源、 意义也各不相同， 在有关研究中常根据不同目 的有所侧重， 检测条件可作一些调整。 与以往报道相似［］血标本中有一波峰出现在 １， ０ ３ Ｋ － Ｎ部位而干扰其检测， Ｈ 逐步降低电压后发现电 压在＋０５ ． Ｖ以下干扰物无响应， 故测定时可将Ｅ Ｄ 电压设在＋０５Ｖ， ． 此条件下 ５ Ｔ也有良好的响 － Ｈ 应， 但血液中许多其它物质则无响应， 从而减少干 扰。在此电压下 ５ Ｔ － Ｐ和 ５ ＩＡ无响应， Ｈ －Ａ Ｈ 但它主 要来源于中枢神经系统， 血中的检测临床意义不大。 Ｔ ＰＫ Ｘ Ｒ ，Ｎ，Ａ在Ｕ Ｖ波长２５ｎ ４ ｍ时可检测，Ａ在 Ｋ 生理状态下由于浓度低未能测到， Ｒ 但Ｔ Ｐ在负荷试 验时可测得。 以往我们已成功地应用乙酸缓冲系统和甲醇流 动相， Ｄ电压为 ０６Ｖ的条件下检测脑脊液中 在Ｅ ． Ｔ Ｐ及其经 ５ Ｔ途径的代谢物， Ｒ － Ｈ 本研究在此基础 上应用三氯乙酸使 ３ Ｋ － Ｎ保留时间延长而被检测。 Ｈ Ｋ Ｘ Ｎ，Ａ和Ｋ Ａ由于浓度太低未能测得，ａ等［在 Ｃｌ １ ］ 脑组织标本中可测到。 尿液是不少代谢物的最后排泄途径， 在一定程 度上能反映Ｔ Ｐ总的代谢情况， Ｒ 已有不少文献报 道［。 ８ 尿中Ｔ Ｐ， Ｈ Ｋ Ｋ ５ＨＡ ］ Ｒ ５ Ｔ，Ｎ，Ａ， ＩＡ等浓度不 － －
低 ， 方法可用 于尿 液检测 。 本
参
考
文
献
１ ｌ Ｍ ，Ｓ ｅｍａ Ａ Ｃａ Ｅ ｈ ｒ ｎ Ｄ．Ｊ ｕ ｏｈ ｍ，１ ７ ， ０ ６ ７ Ｎｅ ｒｃｅ ９ ８ ３ ：０ －
６３ １
２ ａｉ Ｉ Ｎ ｕｏｈｍａｏ， ９２２ ：２ ７１３ Ｌ ｐ Ｐ ｅｒｐ ａ ｃｌ １８ ，１１２－２３ ｎ ． ３ ｏｔ Ａ ，Ｖ ｚ ｎ Ａ，Ｆｅｃ Ｅ Ｓｈ ａｃ Ｒ Ｆ ｓｅ ｒ Ｃ ｅｚ ｉ ｒｎｈ Ｄ， ｃｗ ｒｚ ａ ． Ｎ ｕｏｃＬ ｔ， ９４４ ：７－７ ｅｒｓ ｅｔ １８ ，８１３１８ ｉ
情 见 况 图 。
３３ 各物质检测条件的分析 ． Ｔ Ｐ及其许多代谢产物在ＵＶ波长为 ２４ｎ Ｒ ５ ｍ 时均有一定的响应， 可用于其浓度较高的样品如尿 液中有关物质检测。Ｔ Ｐ在波长增加时响应有改 Ｒ
善， 故有的研究中使用波长为 ２０ ｍ８ ２０ ６ ｎ ［和 ８ ］
ｎ ９ ｍ［。本研究对紫外检测器波长分别为 ２０２５ ］ ４，４， ２４２０ ８ ｍ时各物质吸收情况进行了研究。 ５，６ 和２０ｎ 发现 Ｔ Ｐ在 ２０ｎ Ｒ ６ ｍ和 ２０ｎ ８ ｍ时有较好的响应。 Ｋ Ｎ在上述波长范围内变化不大， Ａ和Ｘ 但Ｋ Ａ的响 应却随着波长的增加而明显的降低， ２５ ｍ处响 在 ４ｎ 应最好。 生物样品中Ｔ Ｒ浓度一般明显高于Ｋ Ｐ Ａ和
条件进行 了讨论 。
关键词 高效 液相色 谱法， 色氨酸， 羟色 ， ５ － 胺 犬尿酸原， 犬尿酸， 羟犬尿酸原， ３ － 黄尿酸
分类号 Ｏ６８Ｑ５ ５／ １
１ 前言 色氨酸（Ｒ ） Ｔ Ｐ 为人体必需氨基酸之一， 其许多 代谢产物有重要生理功能。 在脑Ｔ Ｐ主要通过色氨 Ｒ 酸羟化酶的作用生成５羟色氨酸（－Ｔ ）再脱羧 － ５Ｈ Ｐ ，
３ Ｋ ５Ｈ Ｐ ５ Ｔ，－ Ｉ Ａ 等 ， 测 电压 ０ ４ － Ｎ， Ｔ ，－ ５ Ａ Ｈ － Ｈ Ｈ 检 ．～
０８ Ｖ。 ．５
表明该途径也存在于中枢神经系统。 Ｎ，－Ｋ Ｋ ３ Ｎ和 Ｈ
Ｑ Ｉ 等 有 经 性１，Ａ 有保 作 ［， ＵＮ 具 神 毒 ［］ 则 护 用３故 ，Ｋ ２ ］
Ｔ Ｐ及其上述产物分离与测定在神经科学研究中 Ｒ 十分重要， 以往已有不少报道［ １。 ４０ 但由于生物样品 ～］
３ 结果和讨论
３ １ 流 动 相 ｐ 值 对 各 物 质 保 留 羰 间的影 响 Ｈ
保留时间。以乙酸缓冲系统ｐ ． 为基础， Ｈ４０ 观察不
同三氯 乙酸 浓度对 各物 质保 留时 间的影 响， 结果 如
图 １ ａ 尽 Ｔ尤 黾 氯 纫宜酸 除Ａ Ｘ 留时 缩 齂 保 奔渌
采用乙酸缓冲流动相，Ｈ值对各物质保留时间 ｐ 的影响见图１ Ｔ Ｐ及 ５ Ｔ ， Ｈ ，－Ｉ Ａ的保 。Ｒ － Ｐ５ Ｔ ５ＨＡ Ｈ － 留时间改变已经报道［，－Ｋ Ｋ Ｘ ４ ３ Ｎ，Ｎ，Ａ及 Ｋ ］ Ｈ Ａ的 保留时间在ｐ ．～６０ Ｈ３０ ． 之间随ｐ Ｈ值升高而延 长。 如图１ 所示， Ｈ４０ ． 时可使Ｔ Ｐ各 － ａ 在ｐ ． 或５０ Ｒ
要通过肝 内色氨酸吡咯酶催化 ， 经犬尿 酸原 （ Ｎ） Ｋ 代
谢为犬尿酸（Ａ） ３羟犬尿酸原（－Ｋ ， Ｋ 或 － ３ Ｎ）后者 Ｈ 再继续代谢为黄尿酸（Ａ） Ｘ 或喹啉酸（ＵＩ 等。既 Ｑ Ｎ）
往 已发现 许多疾病该 代谢 途径 异常 ， 近年 来有研 究
控制器和 ２０ １ 型进样阀组成，ｌａｐｅ －Ｍ Ｄ Ｕｔ ｓｈｒ Ｔ Ｏ Ｓ ｒ ｅ 反相色谱柱（． ｍ ｉ ． ５ ｍ， μ 连接 １３ ４６ ｍ ｄ×２ ｃ ５ ｍ） ． ６ 型可变波长紫外检测器及Ｌ －Ｃ型电化学检测器 Ｃ４ （Ａ ＩＣ ， Ｓ 氧化型） Ｂ Ｓ ． Ｕ Ａ， Ｎ 。后者以玻璃碳电极为 工作电极，ｇＡ Ｃ 电极为参考电极。紫外检测器 Ａ ／ｇ ｌ 用于Ｔ ＰＫ Ｘ Ｋ Ｒ ，Ｎ，Ａ，Ａ等测定， 电化学检测器测定
三 乙胺作 为一种离子对试剂成功地 使某些洗 脱较快
的 色 氨彼 酸岽 ò 代 谢 晃 物 锉保 留 Ａ 时 奔 间 溲 延 长 而 有欣 于 利 分 离 耄 但 对 ǘ
留时间明显延长（ － 考虑各物质的最佳保留时 图１ ｃ。 间和分离效果， 一般情况下可选流动相ｐ ．、 Ｈ４０三 氯乙酸浓度 ５ ｍ ｏ／ ， ０ ｍ ｌ 在此条件下各物质的分离 Ｌ
氨酸 经 ５羟色胺和犬尿酸原两条主要代谢途径 的 ８ － 种代谢物 。使用三氯 乙酸作离子对试剂 以延长 ３羟犬尿酸 －
原的 保留时间， 分析了 流动相 ｐ Ｈ值和三氯乙酸浓度对各物质分离的 影响 及检测条件。 结果表明， ｐ Ｈ值及三氯 乙酸浓 度对各 物质保留 时间 有明显影响， 可作为控制分离的主要因素。 此外， 对生物样品中 各物质分离和检测
７ ｍｌ ５ｍ ｏ／ Ｌ三氯 乙酸 ， 后 用冰 乙酸调 ｐ 值 至所 然 Ｈ
需值。用前减压抽气５ ｎ流速１０ ／ ｉ。 ｍｉ， ． ｍＬｍｎ ２４ 标本处理方法 ．
脑 脊液 （ Ｓ ） ０２μ 的微滤器过 滤后取 ５ Ｃ Ｆ用 ． ｍ ０
Ｘ Ａ等 ８ 种物质的分离和测定方法。
＊ 家 自 国 然科学基金项目 ３３０４）广州市科委课题（７ － － ） （９００５， ９－ ０ Ｏ Ｋ ５１ 本文收稿 日 １９ ０ ２， 期：９８ ５ ５修回日 １９－ －５ －－ 期： ８ ９２ ９ ０
物 Ｔ Ｐ ５ Ｔ ，－ Ｔ，－ Ｉ Ａ，－ Ｋ Ｋ Ｋ Ｒ ，－ Ｐ ５Ｈ ５ Ａ ３ Ｎ， Ｎ， Ａ， Ｈ Ｈ Ｈ
标准品均为Ｓｇ 公司产品， ｉ ｍａ 甲醇为北京化工 厂产品， 其余为国产分析纯试剂。 标准品贮备液浓度 为１ ｍｌ ， ｍｎ ／ 工作液由流动相稀释。 ｏＬ ２３ 流动相 ． 流动相为含０１ ｍ ｌ Ｎ ２Ｄ Ａ的０１ ｏ／ ． ｍ ｏ／ ａＥ Ｔ Ｌ ．ｍ ｌ Ｌ乙酸钠溶液与甲醇按体积比９ ５ ５： 混合， ０ 或加 ～
Ａｃｓ ９ ０ １２ ２ ７２ １ ｔ ，１８ ，０ ： ４－ ５
９ ｉ ａ ｓ ．Ｊ ｒｍａ ｇ ， ９９１５２３２９ Ｒｃ ｒ Ｄ Ｃ ｏ ｔ ｒ １７ ，７ ：９－９ ｈｄ Ａ ｈ ｏ
３４ 生物样品 中各种 物质的测定 ．
１ Ｅｄｒｅ Ａ Ｔ ｕｃｔ Ｒ Ｗ ，Ｇ ｎ Ｔ ａ ０ ｅ ｉｄ Ｊ ｒｓｏｔ Ｊ ｌ ｆｌ ， ａ Ｉ Ｅ ｅ ｌ ｔ ．Ｊ Ｃ ｒｍ ｔｇ， ９９４５７－０ ｈｏ ａｏｒ １８ ，９ ：１８
生成 ５ － 胺（－ Ｔ）后者 主要代谢 为 ５羟引 哚 乙 羟色 ５Ｈ ， －
２ 实验部分
２１ 仪器 ．
梯度液相色谱 系统 （Ｅ Ｋ Ｎ Ｓ Ｒ Ｂ Ｃ ＭＡ Ｉ Ｔ Ｕ－ Ｎ
ＭＥ Ｔ Ｉ Ｃ ， Ｓ 由 Ａ ｔ １０ Ｎ Ｓ ． Ｕ Ａ） ｌ ｘ Ｂ型泵 、２Ａ 型 Ｎ ｅ １ ４１
酸（－ＩＡ） －Ｔ作为中枢神经递质可能与许多 ５ Ａ 。５Ｈ Ｈ 精神、 神经系统疾病发病机制有关。在脑外 Ｔ Ｐ主 Ｒ
的复杂性 和实 际应用 中要求 不同 ， 各种 方法 都有 相 对局限性 。我 们曾报道过 以乙酸缓冲 系统和 甲醇为 流 动相 、 电化学 （ Ｄ 和 紫外 （ Ｖ） Ｅ ） Ｕ 检测 器联 用 的反
２２ 试剂 ．
相液相色谱法分离和测定脑脊液［及血液［中的 ４ ］ ５ ］ Ｔ Ｐ经５ Ｔ代谢的主要代谢产物。 Ｒ － Ｈ 在此基础上， 我 们进一步研究了５ Ｔ和Ｋ － Ｈ Ｎ两条途径的主要代谢
代谢 物获得较好的分离 。
３ ． 三 氯 乙 酸 崤ǘ 员保 纫 宜 浓度 榷对 Ａ留 时 间的跋 奔 涞影 响
短外， 其它物质保留时间有不同程度的延长， ５ 对 －
Ｈ 和 Ｔ Ｐ的影 响尤为 明显 。 Ｔ Ｒ 三氯 乙酸浓度增至 ５ ０
ｍ ｏ／ ｍ ｌＬ时，－Ｋ ３ Ｎ保留时间达到最大， Ｈ 从而使生物
２１
７ ｓ ｕ Ｐ Ｆｅｄ ． Ｃ ｒｍ ｔｇ， ９９ １９３３ Ａ ｍ ｓ Ａ， ｒｅ Ｃ Ｊ ｏ ａｏｒ １７ ，６ ：０－ Ｒ ｈ
３１ １
８ ｅｒｅｔ Ｆ Ｓｈｍ ｆ ｓｌ Ｃｏａｒ Ｒ ｌ Ｃ ｉ Ｇ ｅ ｒ ， ｃｉ ｐｅ ｅ Ｌ， ｒｋｅｔ ｉ ｈ ａ ｓ ｓ ．Ｃ ｎ ｍ