氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
生物量碳氮测定方法(熏蒸提取法)
一、土壤微生物生物量碳测定方法（熏蒸提取－碳自动仪器法）1、试剂配制去乙醇氯仿制备：普通氯仿试剂一般含有少量乙醇作为稳定剂，使用前需除去。
将氯仿试剂按1 : 2（v : v）的比例与去离子水或蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存（Williamss等，1995）。
注意氯仿具有致癌作用，必须在通风橱中进行操作。
硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：87.12分析纯硫酸钾，溶于1L去离子水。
六偏磷酸钠溶液[ρ( NaPO3)6 = 5g 100ml-1，pH2.0]：50.0g分析纯六偏磷酸钠缓慢加入盛有800ml 去离子水的烧杯中（注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢，且易粘于烧杯底部结块，加热易使烧杯破裂），缓慢加热（或置于超声波水浴器中）至完全溶化，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，冷却后定容至1L。
过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2g 100ml-1]：20.0g分析纯过硫酸钾溶于去离子水，定容至1L，避光存放，使用期最多为7d。
磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100ml-1]：37ml 85%分析纯浓磷酸（H3PO4，ρ= 1.70g ml-1）与188ml 去离子水混合。
邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前105℃烘2～3h），溶于去离子水，定容至1L。
2、仪器设备土壤筛（孔经2mm）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、容量瓶（100ml）、样品瓶（40ml）。
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
氯仿熏蒸浸提法测定土壤微生物碳氮
采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。
土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml 小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
微生物量碳氮测定方法
微生物量碳氮测定（赵宁宁版）氯仿熏蒸提取法CFE（Chloroform fumigations extractions-Method）Literature:Brookes PC, Landman A, Pruden G, Jenkinson DS (1985). Chloroform fumigation and the release of soil nitrogen: Arapid direct extraction method to measure microbial biomass nitrogen in soil. Soil Biology & Biochemistry 17: 837-842.试剂处理：1.氯仿必须是除去乙醇的，乙醇除去方法是先加入约200l的氯仿至1L的分液漏斗中，然后用5% v/v H2SO4溶液20ml洗涤两次，每次手摇动2-3min左右。
之后在用蒸馏水洗涤2-3次，然后加入5g左右的无水硫酸镁或者无水氯化钙干燥，最后使用旋转蒸发仪蒸馏。
2.沸石处理：玻璃珠事先用丙酮洗净，然后在105度下烘干。
使用清洗烘干后的玻璃珠，否则氯仿有可能不会沸腾。
上述处理均在通风橱里操作。
3.检查真空干燥器的气密性，事先使用真空泵抽取真空，待一天后轻微打开干燥器的开关，听到是否有呲呲的声音。
若是气密性不好，使用少些凡士林密封。
步骤：1.鲜土样过2mm筛子后，在40C冷藏室贮藏。
2.在熏蒸提取之前，测定土壤重量含水量，之后用蒸馏水调节土壤水分含量至统一（一般是调节到土壤的最大持水量或者调节至土壤样品中含水量最高值），这是为了保证熏蒸效果一致。
3.称取15g新鲜土样到50ml的小烧杯中（标签要用铅笔记录）。
4.将氯仿，真空干燥器事先放入通风橱中（氯仿有毒），在真空干燥器底部放入平底100ml或者200ml烧杯，烧杯中加入用丙酮洗净烘干的玻璃珠至小半杯即可，然后加入处理完毕的氯仿至2/3左右。
土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸
土壤微生物生物量的濃定方法1 土壤撤生物碳的需定方法（H蒸提取一一仪器分林法）1.1基本原理新節土样经氯仿熏蒸后（24h）, 土壤撤生物死亡细胞发生裂解，释赦岀攒生物生物量碳，用一定体枳的0.5mol/LK2S04溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定攒生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸士壤测定有机碳的差值员转换系数（屉），从而廿算士壤做生物生物量碳。
1.2实验妆器自动总有机碳（TOC ）分tfi 仪（Shimadzu Model TOC—500,JAN PAN ）、真空干煤器、烧杯、三角眦、聚乙烯熟料管、离心管、滤红、漏斗等。
1.3实验试剂1 ）无乙諄氯仿（CHCLs）;2 ）0.5mol/L麻酸钾溶液:称取87g K2S04濬于1L蒸耀水中3 ）工作曲线的配制:用0.5mol/L硝酸钾落裁配制10ugC/L、30ugC/L. 50ugC/L.70ugC/L. 100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节m）1.4.2熏蒸称収新卸（相肖于干土10.0°,这个可以根摇自己土样的悄猊而定）3价分别朋人25ml小烧杯中。
将烧杯朋人真空干煤器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3） m15ml 杯2或3只，烧杯故入少量lifi暴彿玻同时笊人一盛有N aOH S 液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的co2,干煤器婕部加人少量水以保持容器湿度。
盖上真空干煤器盖子，用真空泵抽真空，使氮仿沸嘴5分抑。
关冈真空干煤器W0,于25T黑喑条件下培养24小时。
1.4.2抽真空处理熏蒸结東后，打开真空干燥器Iffl门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做）,取岀盛有氯仿（可重复利用）和榆NaOH溶液的小烧杯，清常干煤器，反夏抽真空（5或6次，每«3min,毎次抽真空后最好完全扌T开干煤器盖子）, 直到土攘无氯仿味道为止。
MBC+MBN测定-2014.03.27
MBC+MBN 测定（氯仿熏蒸-K 2SO 4浸提法）原理：通过氯仿熏蒸杀死土样中微生物，尸体分解并释放出TOC 。
熏蒸土样测得值减去不熏蒸土样测得值即为MBC/MBN （微生物生物量C ）。
样品熏蒸准备：1. 同一个鲜土样，称取两个（各10 g ），一个做熏蒸，放到50 ml 小烧杯中；一个做不熏蒸，放到离心管中。
2. 熏蒸过程：干燥器底部放置3张普通滤纸，铺开，加去离子水湿润，将烧杯放置于干燥器中。
取烧杯一只，用玻璃珠铺满底部，加入25 ml 左右氯仿，放入干燥器中。
取凡士林均匀涂抹于干燥器与盖子接触的边缘及盖子的塞子，稍微转动盖子使密封性更好。
盖上塞子，使干燥器内外相通，将干燥器与真空泵连接。
打开真空泵抽气至氯仿沸腾并保持2 min ，旋动塞子以密封干燥器，关闭真空泵，将干燥器套上黑色塑料袋两只以隔绝光照，培养24 h 。
将用离心管承装的土样置于另一干燥器中，盖上盖子，同样套上两层黑色塑料袋，培养24 h 。
（注意：氯仿见光会生成毒性气体，其操作应在通风橱中进行）3. 每批熏蒸应至少做两个空白。
4. 浸提：配制0.5 mol/L K 2SO 4溶液（87.1 g K 2SO 4定容至1 L ）熏蒸结束后，将烧杯中的熏蒸土样取出，每个烧杯的土样用40 ml K 2SO 4洗至干净离心管中，用离心管培养的土样则取出直接加40 ml K 2SO 4。
震荡（250频率30分钟）离心（4000转10分钟），过滤，然后用0.45 μm 的滤膜抽滤。
5. 测定：由于MBC 、MBN 浓度较大，所以测定时需要稀释10倍后再进行测定。
MBN 用连续流动分析仪测定，计算用TN-NH4+NO3 即可得出有机氮含量。
土壤微生物生物量碳计算公式为：()EC NF F K C C MBC /-=其中，MBC 为土壤微生物生物量碳含量（mg•kg -1）， CF 为熏蒸样品的有机碳含量，CNF 为不熏蒸样品的有机碳含量，单位均为mg•kg -1；KEC 为微生物碳的浸提系数，为0.38（Joergensen, 1996）。
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳一、实验原理：用氯仿杀死土壤中的微生物，并接种新的土壤，培养微生物使之释放二氧化碳。
测量一定时间内熏蒸土壤与为熏蒸土壤中微生物释放的二氧化碳量来估算土壤中微生物的生物量碳。
二、实验步骤：1.氯仿去乙醇。
用锡箔纸包裹分液漏斗（纵向留出一条细缝，以便观察分层情况）。
向分液漏斗中加入氯仿和氯仿一半体积的蒸馏水，盖上分液漏斗的盖子，上下摇晃数次。
静置片刻，放出分液漏斗下层的氯仿。
2.抽气。
用细筛筛选250g土壤于500mL烧杯中，并将烧杯至于干燥器中。
干燥器内放入盛有少量蒸馏水的小烧杯。
另取100mL干燥的烧杯一个，向其中加入50mL去乙醇氯仿和干燥的玻璃珠（防止氯仿爆沸，且要铺满整个烧杯底部）后，将之放入干燥器中。
在盖子内侧贴上一条蒸馏水润湿的滤纸条。
盖好干燥器的盖子，用真空泵抽气至氯仿沸腾，关闭干燥器的活塞。
把干燥器放入遮光恒温（25℃）的条件下培养24小时。
3.排出氯仿。
取出干燥器内的氯仿和湿润的滤纸条，在次抽气三分钟后打开盖子散发土壤中的氯仿，如此连续反复三次，就能排出土壤中的氯仿。
4.另筛取250g土壤，不熏蒸。
分别在熏蒸土壤和未熏蒸土壤中加入1g新鲜土壤且充分混匀。
调节土壤水分至罪大含水量的55％。
将两份土壤各放入一个未放干燥剂的干燥器中。
在干燥器中放入盛有20mL蒸馏水的烧杯盛有100mL 1mol/L NaOH溶液，盖好盖子，培养十天。
5.滴定。
取出NaOH溶液，取25mL于250mL容量瓶中，定溶。
从容量瓶中取出20mL于150mL三角瓶中，用1mol/L的HCl溶液调节Ph至10。
再用0.05mol/L的HCl溶液滴定至Ph为8.3，继续滴定至Ph为3.7，记录Ph从8.3到3.7所消耗HCl溶液的体积。
.三、计算K YX B -=土壤微生物生物量碳其中，X为熏蒸土壤释放的CO2量，Y为未熏蒸土壤释放的CO2量，由滴定所消耗的HCl溶液的体积计算得出。
土壤微生物量测定方法
土壤微生物量测定方法一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取-碳分析仪器法）1、试剂（1）去乙醇氯仿制备：在通风橱中，将分析纯氯仿与蒸馏水按1 2（v : v）加入分液漏斗中，充分摇动1 min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1 mol L-1]：通常分析纯固体氢氧化钠中含有碳酸钠，与酸作用时生成二氧化碳，从而影响滴定终点判断和测定的准确度。
配制时应先除去碳酸钠，根据碳酸钠不溶于浓碱，可先将氢氧化钠配成50%（w : v）的浓氧溶液，密闭放置3～4 d。
待碳酸钠沉降后，取56 ml 50%氢氧化钠上清液（约19 mol L-1），用新煮沸冷却的除去二氧化碳的蒸馏水释稀到1 L，即为浓度1 mol L-1 NaOH溶液，用橡皮塞密闭保存。
（3）硫酸钾提取剂[c（K2SO4）= 0.5 mol L-1]：取1742.5 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末状，倒于25 L塑料桶中，加蒸馏水至20 L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1）上溶解24 h即可。
（4）六偏磷酸钠溶液[ρ（Na）= 5 g 100 ml-1，pH 2.0]：称取50.0 g分析纯六偏磷酸钠溶于800 ml高纯度去离子水中，用分析纯浓磷酸调节至pH 2.0，用高纯度去离子水定容至1 L。
要注意的是六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制；由于其易粘于烧杯底部，若加热常因受热不均使烧杯破裂。
（5）过硫酸钾溶液[ρ（K2S2O8）= 2 g 100 ml-1]：称取20.0 g分析纯过硫酸钾，溶于高纯度去离子水中，定容至1 L。
值得注意过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放且最多使用7 d。
（6）磷酸溶液[ρ（H3PO4）= 21 g 100 ml-1]：量取37 ml 分析纯浓磷酸（85%），慢慢加入到188 ml高纯度去离子水中即可。
微生物量碳氮
微生物量碳方法一 每个土样称取相当于 20g 烘干土重的 6 份新鲜湿土于100ml 烧杯中，其中三份作为对照，直接用 100ml 0.5 mol·L -1 K 2SO 4（87.13g 定容到1L ）浸提。
另三份放入干燥器中熏蒸，干燥器底部放适量水（保湿）和三个 50ml 小烧杯，一个烧杯盛 25ml 1% NaOH 溶液（1g NaOH 加入99ml 水），另两个各盛 25ml 无醇氯仿（投入少量沸石）。
盖严干燥器盖，将干燥器置于通风橱内，抽真空，直至氯仿沸腾约 2min ，而后置于25℃暗室中 24h ，取出盛氯仿的小烧杯，盖严干燥器盖，反复抽真空以除去残余的氯仿。
采用灭菌－提取法，从干燥器中取出土样，同对照一样放入150ml 三角瓶中，分别加入100ml 0.5 mol·L -1 K 2SO 4溶液，25℃下在往复式震荡机上振荡30min ，过滤。
滤液用德国产TOC 仪测定土壤提取液全碳含量，以熏蒸和未熏蒸土壤提取液全碳含量的差值Fc 乘以系数2.64得到土壤微生物碳的含量，计算公式为：mic C F K F 2.64=⨯=⨯C CF K F 2.64=⨯=⨯方法二 一、基本原理熏蒸提取法测定微生物碳的基本原理是：氯仿熏蒸土壤时由于微生物的细胞膜被氯仿破坏而杀死，微生物中部分组分成分特别是细胞质在酶的作用下自溶和转化为K 2SO 4溶液可提取成分（Joergensen,1996）。
采用重铬酸钾氧化法或碳-自动分析仪器法测定提取液中的碳含量，以熏蒸与不熏蒸土壤中提取碳增量除以转换系数KEC 来估计土壤微生物碳。
二、试剂配制（1）硫酸钾提取剂（0.5 mol•L -1）：取871.25 g 分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至10 L 。
（2）0.2 mol•L -1（1/6 K 2Cr 2O 7）标准溶液：称取130℃烘2-3小时的K 2Cr 2O 7（分析纯）9.806 g 于1 L 大烧杯中，加去离子水使其溶解，定溶至1 L 。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法
微生物碳氮的测定方法——熏蒸提取法work Information Technology Company.2020YEAR二、土壤微生物量碳、氮的测定方法—熏蒸提取法1．主题内容与适用范围本方法采用氯仿熏蒸—提取测定土壤微生物量碳、氮，适用范围广，既适用于中性和微碱性土壤，也适用于强酸性土壤，并且适用于滞水土壤（如水稻土）和新施有机肥土壤。
2．方法提要土样经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K2SO4溶液浸提，提取液一部分用K2CrO7（重络酸钾）氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。
3．提取液的制备3.1仪器、设备：抽气皿（真空干燥器）、无醇氯仿、抽气机、大铝盒、分析天平（感量：0.01g）、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、大三角瓶（150ml）、40C的冰箱、定量滤纸（15cm）、漏斗、保鲜膜3.2试剂的制备：0.5 M K2SO4溶液（化学纯）、无醇氯仿（提纯方法：用1N H2SO4溶液与氯仿(CHCl3三氯甲烷)按体积比2:1于分液漏斗中振荡混匀，净置分离，共做3次；再用水代替硫酸与氯仿2:1混匀，振荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入到棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存）3.3分析步骤：3.3.1 称取12.50g鲜土(取土要准确、均匀，不要夹入有机残体)于大铝盒中。
在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，小烧杯中放几张小纸片以便于观察沸腾。
放入装土的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。
包上黑布，置于阴暗处（250C）熏蒸24小时。
到时间后，取出小烧杯后反复抽真空2~3次（每次5分钟），排除氯仿。
另称取一批同等重量的土放入大塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，置于阴暗处24小时。
3.3.2 将步骤(3.1.1)中的两批土样转移到离心管中（红壤适宜离心管）。
用注射器注入每瓶50ml 0.5M K2SO4溶液，盖紧瓶塞，振荡30分钟，离心5分钟后取出，用15ml定量滤纸过滤到150ml大三角瓶中，应立即测定。
土壤微生物量碳氮测定方法
1.23.1 土壤微生物碳的测定——TOC-V CPH有机碳分析仪一、方法原理土壤有机碳的测量方法主要有两种，即氯仿熏蒸培养法和氯仿熏蒸—直接浸提法。
1．氯仿熏蒸培养法[1]：土壤经氯仿熏蒸后再进行培养，测定培养时间内熏蒸与未熏蒸处理所释放CO2之差来计算土壤生物量碳。
2．氯仿熏蒸直接浸提法[2]：土壤经氯仿熏蒸后直接浸提进行，测定浸提液中的碳含量，以熏蒸和不熏蒸土壤中总碳的差值为基础计算土壤微生物含碳量。
直接提取法与氯仿熏蒸培养法相比，直接提取法具有简单、快速、测定结果的重复性较好等优点。
直接提取法测定土壤微生物量的碳的方法日趋成熟。
现在氯仿熏蒸—K2SO4提取法已成为国内外最常用的测定土壤微生物碳的方法。
本实验以氯仿熏蒸直接浸提法为例介绍土壤微生物量碳氮的浸提与测定。
二、主要仪器振荡机、真空干燥器、真空泵、TOC-V CPH有机碳分析仪。
二、试剂1．氯仿（去乙醇）：普通氯仿一般含有乙醇作为稳定剂，使用前要去除乙醇。
将氯仿按照1︰2（v/v）的比例与蒸馏水一起放入分液漏斗中，充分振动，慢慢放出底部氯仿，重复3次。
得到的无乙醇氯仿加入无水CaCl2，以除去氯仿中的水分。
2．0.5 mol·L-1 K2SO4浸提液：43.57 g分析纯K2SO4 定溶至1 L。
四、操作步骤称取过2 mm筛的新鲜土样12.5 g六份，置于小烧杯中。
将其中三份小烧杯放入真空干燥器中，干燥器底部放3个烧杯，其中一个放氯仿，烧杯内放少许玻璃珠（防爆），另一个放水（保持湿度），再放一杯稀NaOH。
抽真空时，使氯仿剧烈沸腾3-5 min，关掉真空干燥器阀门，在暗室放置24 h。
熏蒸结束后，打开干燥器阀门，取出氯仿，在通风厨中使氯仿全部散尽。
另三份土壤放入另一干燥器中，但不放氯仿。
将熏蒸的土样全部转移至150 mL三角瓶中，加入50 mL 0.5 mol·L-1 K2SO4 (土水比为1:4)，振荡30 min，过滤。
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳
熏蒸培养法测量土壤微生物生物量碳一、实验原理：用氯仿杀死土壤中的微生物，并接种新的土壤，培养微生物使之释放二氧化碳。
测量一定时间内熏蒸土壤与为熏蒸土壤中微生物释放的二氧化碳量来估算土壤中微生物的生物量碳。
二、实验步骤：1.氯仿去乙醇。
用锡箔纸包裹分液漏斗（纵向留出一条细缝，以便观察分层情况）。
向分液漏斗中加入氯仿和氯仿一半体积的蒸馏水，盖上分液漏斗的盖子，上下摇晃数次。
静置片刻，放出分液漏斗下层的氯仿。
2.抽气。
用细筛筛选250g土壤于500mL烧杯中，并将烧杯至于干燥器中。
干燥器内放入盛有少量蒸馏水的小烧杯。
另取100mL干燥的烧杯一个，向其中加入50mL去乙醇氯仿和干燥的玻璃珠（防止氯仿爆沸，且要铺满整个烧杯底部）后，将之放入干燥器中。
在盖子内侧贴上一条蒸馏水润湿的滤纸条。
盖好干燥器的盖子，用真空泵抽气至氯仿沸腾，关闭干燥器的活塞。
把干燥器放入遮光恒温（25℃）的条件下培养24小时。
3.排出氯仿。
取出干燥器内的氯仿和湿润的滤纸条，在次抽气三分钟后打开盖子散发土壤中的氯仿，如此连续反复三次，就能排出土壤中的氯仿。
4.另筛取250g土壤，不熏蒸。
分别在熏蒸土壤和未熏蒸土壤中加入1g新鲜土壤且充分混匀。
调节土壤水分至罪大含水量的55％。
将两份土壤各放入一个未放干燥剂的干燥器中。
在干燥器中放入盛有20mL蒸馏水的烧杯盛有100mL 1mol/L NaOH溶液，盖好盖子，培养十天。
5.滴定。
取出NaOH溶液，取25mL于250mL容量瓶中，定溶。
从容量瓶中取出20mL于150mL三角瓶中，用1mol/L的HCl溶液调节Ph至10。
再用0.05mol/L的HCl溶液滴定至Ph为8.3，继续滴定至Ph为3.7，记录Ph从8.3到3.7所消耗HCl溶液的体积。
.三、计算K YX B -=土壤微生物生物量碳其中，X为熏蒸土壤释放的CO2量，Y为未熏蒸土壤释放的CO2量，由滴定所消耗的HCl溶液的体积计算得出。
微生物量碳的测定方法
氯仿薰蒸浸提法测定土壤微生物生物量碳一、采样与样品预处理土壤样品的采集方法和要求与测定其它土壤性质时没有本质区别。
采集到的新鲜土壤样品立即去除植物残体、根系和可见的土壤动物(如蚯蚓)等,然后迅速过筛(2～3 mm)，或放在低温下(2～4℃)保存。
如果土壤太湿无法过筛，进行晾干时，必须经常翻动土壤，避免局部风干导致微生物死亡。
过筛的土壤样品调节到田间持水量的50%左右，在室温下于密闭装置中预培养1周，密闭容器中要放入两个50mL的烧杯，分别加入水和稀NaOH，以保持其湿度和吸收释放的CO2。
预培养后的土壤最好立即分析，若需要放置一段时间，在低温下(2～4℃)最好不要超过10d。
土壤田间持水量采用改进的Shaw（1958）方法测定。
在漏斗下端连接一带夹子的橡胶管，漏斗用玻璃纤维堵塞。
取50.00 g土壤于漏斗中，夹紧橡胶管，加入50 ml水，保持30 min，再打开夹子使多余的水流入量筒，30 min后测定流出的水量，同时测定土壤湿度，计算土壤田间持水量，用烘干土壤质量表示。
二、方法—氯仿薰蒸浸提法（FE）1、方法原理土壤经氯仿薰蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取的碳大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物量碳。
浸提液中碳可用重铬酸钾容量法测定，也可用微量碳分析仪测定。
此处介绍比较简单的重铬酸钾容量方法。
2、仪器及设备培养箱；真空干燥器；真空泵；往复式振荡机(速率200rev/min)；冰柜；磷酸浴。
3、试剂1.无乙醇氯仿：量取500 mL 氯仿于1000 mL的分液漏斗中，加入50mL硫酸溶液[ϕ(H2SO4)=5%]，充分摇匀，弃除上层硫酸溶液，如此进行3次。
再加入50 mL去离子水，同上摇匀，弃去上部的水分，如此进行5次。
得到纯氯仿存放在棕色瓶中，并加入约20g无水K2CO3，在冰箱的冷藏室中保存备用。
（试剂浓硫酸ϕ(H2SO4)=95~98% ，稀释19倍）2.硫酸钾溶液[c(K2SO4)= 0.5 mol·L-1]: 称取硫酸钾（K2SO4,化学纯）87.10g，加热溶于去离子水中，稀释至1L。
土壤微生物生物量的测定方法(氯仿熏蒸)汇总
土壤微生物生物量的测定方法1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）1.1 基本原理新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。
根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（K EC），从而计算土壤微生物生物量碳。
1.2 实验仪器自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。
1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL3）；2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。
（其实一般情况下，仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）1.4 操作步骤1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）1.4.2 熏蒸称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。
将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO2，干燥器底部加入少量水以保持容器湿度。
盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分钟。
关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。
1.4.2 抽真空处理熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。
同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不熏蒸对照处理。
土壤微生物量氮的测定方法
土壤微生物量氮的测定方法土壤微生物量氮（Microbial biomass nitrogen，MBN）是土壤中微生物形成的氮的总量，是土壤中活性微生物数量和活力的指标之一、测定土壤微生物量氮的方法有多种，下面介绍其中几种常用的方法。
1.氯仿熏蒸法氯仿熏蒸法是一种常用的测定土壤微生物量氮的方法。
具体操作步骤如下：（1）选取代表性的土壤样品，将土壤样品过筛，并按照一定比例称取一定质量的土壤样品。
（2）将称取的土壤样品放入密封容器中，向容器中加入一定量的氯仿（或氯仿和甲醇混合物），使土壤样品充分与氯仿接触。
（3）密封容器，摇动混匀，使氯仿充分揉搓土壤样品，并让土壤样品中的微生物氮释放。
（4）打开容器，将装有氯仿的倒头管放入容器中吸取氯仿，并尽量不吸取液体底部的土壤悬浮液。
（5）将吸取的氯仿放入创口板上，用水浴加热挥发氯仿，使样品中的微生物氮固定为氨态氮。
（6）再将固定后的氨态氮用氯化亚铜溶液测量，即可得到土壤中的微生物量氮。
2.氯仿氯化亚铜法氯仿氯化亚铜法是一种精确测定土壤微生物量氮的方法。
具体操作步骤如下：（1）取一定质量的土壤样品，经过干燥和过筛处理后，称取一定质量的土壤样品。
（2）将称取的土壤样品与一定体积的氯仿混合，并进行摇动搅拌，使土壤样品充分与氯仿接触。
（3）将搅拌后的土壤样品与一定质量的氯化亚铜溶液混合，使土壤样品中的微生物氮转化为氨态氮。
（4）经过一定时间的反应后，向反应体系中加入一定量的盐酸，破坏悬浮液中未转化的氯化亚铜。
（5）用氯化亚铜溶液测量反应体系中残留的氯化亚铜，即可计算出土壤中的微生物量氮。
3.直接抑制法直接抑制法是一种快速测定土壤微生物量氮的方法，其原理是通过添加抑制剂抑制土壤中的微生物活动，从而间接测定微生物量氮的含量。
目前常用的抑制剂包括三氟乙酸（TFPA）和亚硝酸盐等。
具体操作步骤如下：（1）取一定质量的土壤样品，分为两组。
（2）一组不加抑制剂，作为对照组。
另一组加入一定量的抑制剂，抑制土壤中的微生物活动。
微生物量N的测量
土壤微生物量N的测定一、实验原理氯仿熏蒸浸提法的原理是：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中的可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加。
通过测定浸提液中全碳的含量可以计算土壤微生物生物量氮二、试剂与仪器1. 试剂无乙醇氯仿、蒸馏水、0.15mol/L K2SO42.仪器可抽气干燥器、紫外可见分光光度计三、实验步骤1.取样在一片区域内，找五株植株分别取样，每株取三份土样，以20cm深为一个单位，分三次取样，取样深度为60cm，作为一份土样。
以此，取样45份。
2. 预培养常温下，保持水分通气培养10d。
预培养的目的是为了减少熏蒸后培养期间有机氮矿化的干扰,减少采样时土壤水分和温度的差异,使各土壤测定结果有可比性。
3. 土壤样品熏蒸每个土样各称取6.000g，12份分别置入25mL小瓶中,6份熏蒸,6份不熏蒸。
将欲熏蒸土样置于内径29cm可抽气的干燥器内隔板上,干燥器底部放置装有30mL无乙醇氯仿的100mL烧杯,并另外放置1个装有蒸馏水的小烧杯,使熏蒸时土壤含水量不变。
随之抽气,直到氯仿出现气泡沸腾后持续5min,停止抽气,紧接着密闭干燥器,并将其置于室温(与黑暗处。
24h后取出土样,在通气良好的地方放置2~3h,使残留土壤中的氯仿尽可能挥发。
不熏蒸的土样置于另一干燥器中,用蒸馏水代替氯仿,与用氯仿熏蒸一样处理,作为不熏蒸对照。
3. 熏蒸-280nm紫外比色法另取3份熏蒸和3份未熏蒸的土样,转入100mL三角瓶中,加50mL0.15mol/LK2SO4,振荡30 min后,过滤,立即在280nm 紫外光下测定吸光度。
熏蒸和未熏蒸作相同处理。
用单位土中的吸光度增量表示,即:v/g,烘干土=(abs熏/G熏)-(abs未/G未),其中:abs代表280nm紫外光下的吸光度,G代表称的土重相当的烘干土重。
土壤微生物量碳氮的测定
土壤微生物量的测定一、土壤微生物生物量碳（氯仿熏蒸－K2SO4提取－碳自动分析法）1、试剂配制（1）去乙醇氯仿制备：市售氯仿一般含有少量乙醇作为稳定剂，所以，使用前必须将其中的乙醇去掉。
方法是量取适量的分析纯氯仿，按1 2（v : v）的比例与蒸馏水或去离子水一起放入分液漏斗中，充分摇动1min，慢慢放出底层氯仿于烧杯中，如此洗涤3次。
得到的无乙醇氯仿中加入无水氯化钙，以除去氯仿中的水分。
纯化后的氯仿置于暗色试剂瓶中，在低温（4℃）、黑暗状态下保存。
注意：氯仿具有致癌作用，所有操作必须在通风橱中进行。
（2）氢氧化钠溶液[c（NaOH）= 1mol L-1]（3）硫酸钾浸提剂[c（K2SO4）= 0.5mol L-1]：取1742.6 g分析纯硫酸钾，用研钵磨成粉末装，倒于25L塑料桶中，加蒸馏水至20L，盖紧螺旋盖置于摇床（150 r min-1），溶解24 h。
（4）六偏磷酸钠溶液（5%，pH2.0）：50.0g分析纯六偏磷酸钠溶于800ml双蒸水，用分析纯浓磷酸调节至pH2.0，再用双蒸水定容至1L。
注意：六偏磷酸钠溶解速度很慢应提前配制，且由于其易粘于烧杯底部，加热时常因受热不均使烧杯破裂。
（5）过硫酸钾溶液（2%）：20.0g分析纯过硫酸钾溶于双蒸水，定容至1L。
注意：过硫酸钾溶液易被氧化，应避光存放，使用期最多为7d。
（6）磷酸溶液（21%）：37ml 85%分析纯浓磷酸与188ml双蒸水混合。
（7）邻苯二甲酸氢钾标准溶液[ρ（C6H4CO2HCO2K）= 1000mg C L-1]：2.1254g分析纯邻苯二甲酸氢钾（称量前先经105℃烘2～3h），溶于双蒸水，定容至1L。
2、仪器设备碳–自动分析仪（Phoenix 8000）、真空干燥器（直径22cm）、水泵抽真空装置（图6–1）或无油真空泵、pH–自动滴定仪、塑料桶（带螺旋盖可密封，体积50L）、可密封螺纹广口塑料瓶（容积1.1L）、高温真空绝缘酯（MIST–3）、烧杯（25、50、80ml）。
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采用氯仿熏蒸0.5 mol/L K2SO4浸提法测定土壤微生物量碳、氮。
首先将土样在25℃下密封培养7d 左右，然后称取预处理土样 6 份放入烧杯中，将 3 份其置于底部有少量Na OH、200 m L 水和去乙醇氯仿的真空干燥器中，抽真空后保持氯仿沸腾3～5 min，然后，将干燥器移置在黑暗条件下25℃熏蒸土壤24 h，再次抽真空完全去除土壤中的氯仿。
将熏蒸好的土壤转移到200 m L 提取瓶中，加入0.5 mol/L K2SO4浸提液（水∶土质量比为4∶1）。
另外3 份做未熏蒸空白试验，每份重复3 次，分别测定浸提液中的有机碳和全氮含量。
其中浸提液中的可溶性有机碳采用总有机碳分析仪（Phoenix 8000，美国）测定，由熏蒸与未熏蒸土样有机碳的差值除以转换系数，计算得到微生物量碳。
浸提液中土壤可溶性全氮采用碱性过硫酸钾氧化法测定，浸提液中无机氮采用流动分析仪测定，土壤可溶性有机氮是可溶性全氮和无机氮的差值。
熏蒸与未熏蒸土样的全氮的差值除以转换系数，计算得到微生物量氮。
微生物量碳、氮的转换系数为0.45。
土壤的有机质、全氮、全磷、有效磷、速效钾、NO3--N、NH4+-N、pH 值采用常规的土壤农化分析方法测定。