凯氏定氮法
凯氏定氮法课件
2NH4Cl + 4H3BO3
(注: NCOC, Nitrogen containing organic compounds )
整个过程分三步：消化、蒸馏与吸收、滴定
1. 消化
要预防暴沸
<1>加硫酸钾 作为增温剂，提升溶液沸点， 纯硫酸沸点 340℃，加入硫酸钾之后能够提升 至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提 高沸点，但效果不如硫酸钾。
凯氏定氮法
测定蛋白质含量旳措施 凯氏定氮法
双缩脲法
Folin－酚试剂法
紫外吸收法
• 其中： • 凯氏定氮法——最常用旳，国内外应用普遍。
凯氏定氮法
• 凯氏定氮法可分为全量法、微量法及经改 善后旳改良凯氏定氮法。
微量法：取消化液旳10%加碱蒸馏
常量法：取消化液旳全部加减蒸馏。
（一）常量凯氏定氮法
(NH4)2SO4 检验
⑩蒸馏前加NaOH要足量，溶液应变为深蓝色或 黑褐色↓（Cu（OH）2、CuO、铜氨离子），如 颜色不变可能碱不够 。
⑾蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗 管口，再蒸1分钟后关掉热源．不然可能造成吸 收液倒吸。
⑿H3BO3吸收液旳温度不应超出40℃，不然对 NH3旳吸收作用减弱而造成损失。
原理
样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分 解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中 旳有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏， 使氨蒸出。
① 用H3BO3吸收后再以原则HCl滴定或H2SO4溶液滴定。 根据原则酸消耗量能够计算出蛋白质旳含量。
② 也能够用过量旳原则H2SO4或原则HCl溶液吸收后再ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ以原则NaOH滴定过量旳酸。
马铃薯含非蛋白氮多。
凯氏定氮法
1、消化取两个凯氏烧瓶标号，一只加1.0ml蒸馏水作为空白对照，另一只加1.0ml样液。
各加硫酸钾和硫酸铜混合物约20mg、浓硫酸2ml。
烧瓶口插一漏斗（冷凝用），烧瓶置于电炉上加热。
开始时应注意火力，以免使瓶内液体冲至瓶颈。
待瓶内水气蒸完，硫酸开始分解生成SO2白烟时，适当加强火力，直至消化液透明并呈但旅色为止（约2~3h），用木夹取出，冷却，准备蒸馏。
2、蒸馏取50~100ml锥形瓶3只，先按一般方法洗净，再用蒸汽洗涤数分钟，冷却。
用移液管各加入2%硼酸溶液5.0ml和指示剂4滴。
如瓶内液体呈葡萄紫色，可再加硼酸液5ml，盖好备用。
如锥形瓶内液体呈绿色，需用蒸汽重新洗涤。
1.安全管2.导管3.汽水分离管4.样品入口5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发生瓶微量凯氏蒸Array馏装置如图所示，蒸汽发生器内盛放有滴加数滴H2SO4的蒸馏水和数粒沸石。
加热后，产生的蒸汽经储液管、反应室至冷凝管，冷凝后的液体流入接受瓶。
每次使用前，需用蒸汽洗涤10min左右（此时可用一小烧杯盛接冷凝的水）。
然后将一只盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶放置在冷凝管的下端，并使冷凝管之管口插入酸液面下，继续蒸馏1~2min，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净，否则需再洗。
移去酸液，蒸馏1min，用水冲洗冷凝管口吸去反应室残夜。
将消化好的消化液，由小漏斗加入反应室，用蒸馏水洗涤凯氏烧瓶2次（每次约2ml），洗涤液均经小漏斗加入反应室，再在冷凝管下置一盛有硼酸液和指示剂的锥形瓶，并使冷凝管口插入酸液面下0.5cm处（10mL酸液置于50~100mL锥形瓶内，液体深度不大，可将锥形瓶斜放。
冷凝管口必须插在液面下，但也不宜太深，这样，万一发生倒吸现象时，硼酸液也不致被吸入反应室内）。
用小量筒取10~15mL30%的NaOH溶液，倒入小漏斗，放松弹簧夹，让NaOH溶液缓缓流入反应室，当小漏斗内剩下少量NaOH溶液时，夹紧夹子，再加入约3mL蒸馏水于小漏斗内，同样缓慢放入反应室，并留少量水在漏斗内做水封，即可蒸馏。
总结凯氏定氮法
注意事项： 在蛋白质测定过程中应注意与采用氨试剂的检测项目 时间错开，确保环境空气中无氨气的存在，否则将影响蛋白质的测定 结果，使最终结果偏高。 三、结果计算：
X4（干基）= (V1 - V0)×0.014×C×6.25 W（1-水分%）×0.1 ×100……… (4)
式中： X4 W V1 V0 C 0.014 6.25 试样的干基蛋白质含量， （%） ； 试样质量， （g） ； 滴定样品所消耗盐标准溶液体积， （mL） ； 滴定空白所消耗盐酸标准溶液体积， （mL） ； 盐酸标准溶液的浓度， （mol/L） ； 1mL1mol/L 盐酸溶液相当于氮的质量， （g） ； 氮换算为蛋白质的系数。
c·2%的硼酸溶液：2g 硼酸加蒸馏水定容至 100mL； d·浓硫酸： e· 复合催化剂： 硫酸钾或硫酸钠 97g 和无水硫酸铜 3g 的混合物； f·混合指示液：0.1%的甲基红乙醇溶液 20mL 与 0.2%溴甲酚绿 乙醇溶液 30mL 混合摇匀。 二、 分析步骤 a·消化：称取混匀的样品 3g（精确至 0.001g） ，放入干燥的凯 氏烧瓶中（避免样品粘在瓶颈内壁上） ，加入混合催化剂 10g，硫酸 25mL，轻轻摇动烧瓶，使样品完全湿润。然后将烧瓶以 45 角斜放在 支架上，用电炉缓慢加热，当瓶内泡沫消失后强热至沸。待瓶壁不附 有炭化物时，且瓶内液体为澄清浅绿色后，继续加热 30min 使其完全 分解（以上操作应在通风橱内进行） 。 b·蒸馏：将消化好并冷却至室温的样品溶液全部转移到 100mL 容量瓶中， 用蒸馏水定容到刻度摇匀。 向 100mL 接受瓶中加入 20mL2% 硼酸溶液和 2～3 滴混合指示液，将接收瓶置于冷凝管下口，使下口 浸入到硼酸接收液中。再吸取 10mL 定容后的样品液，沿小玻璃杯移 入反应室，并用少量的蒸馏水冲洗小玻璃杯，塞紧棒状杯塞。向小玻 璃杯中加入 20～30mL40%的氢氧化钠溶液（过量） ，慢慢提起棒状杯 塞，使氢氧化钠缓慢流入反应室（防止反应室气体从杯塞处外泄） ， 立即塞紧棒状杯塞，并在小玻璃杯中加入蒸馏水使之密封。通入蒸汽 5min，降低接收瓶位置使冷凝管末端离开液面后再继续蒸馏 1min， 用少量蒸馏水冲洗冷凝管末端，洗液并入接收瓶，取下接收瓶。 c·滴定：用 0.01mol/L 的盐酸或硫酸标准溶液滴定接收瓶瓶中 的液体，使之刚刚出现灰紫色即为终点，记录所消耗 0.01mol/L 的盐 酸或硫酸标准溶液的体积（mL） 。
凯氏定氮法
凯氏定氮法中文名称：凯氏定氮法英文名称：Kjeldahl determination定义：测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准碱滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
原理蛋白质是含氮的有机化合物。
食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4（其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3 (NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法（英语：Kjeldahl method，全称凯耶达尔定氮法，简称凯氮法）是分析化学中一种常用的确定有机化合物中氮含量的检测方法。
这种方法是由凯耶达尔于在1883年发明。
凯氏定氮法是分析有机化合物含氮量的常用方法。
要测定有机物含氮量，通常是设法使其转变成无机氮，再进行测定。
一、原理：凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。
硫酸铜起催化剂的作用。
凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。
使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以蛋白质为例，反应式如下：消化：蛋白质+ H2SO4→（NH4）2SO4+ SO2↑+ CO2 ↑+ H2O蒸馏：（NH4）2SO4 + 2NaOH→ Na2SO4+ 2 H2O + 2NH3 ↑2NH3 + 4H3BO3→（NH4）2B4O7+ 5H2O滴定：（NH4）2B4O7+ 2HCl + 5H2O→2NH4Cl + 4 H3BO3蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量[约在14％~18％，平均为16％（质量分数）]。
凯氏定氮法
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH4OH
NH3+H3BO3=NH4H2BO3
3. 再用已知浓度的HCI标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含 量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。
(NH4)2SO4 + 2NaOH = Na2SO4 + 2NH3 +2H2O
3. 吸收与滴定 硼酸H3BO3： 半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收氨 的作用。硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影 响指示剂变色反应。
NH3+H3BO3=NH4H2BO3
标准溶液： 盐酸： HCl 硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定， 根据消耗体积得出氮的含量。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
5. 不要将样品粘在瓶颈上，炭化粘在壁上消 化不彻底．消化过程中要逐渐升温，当低温 加温至出现带有硫酸的白色气体后，才可升 温使溶液沸腾，但避免剧烈沸腾。 6.当氢氧化钠足量时有黑色氧化铜生成而使 溶液呈淡黑色；当氢氧化钠量不足时就无黑 色氧化铜产生而使溶液呈淡蓝色，加入的氢 氧化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防 止氨的流失。
NH4H2BO3 + HCl =H3BO3 + NH4Cl
（二）各种试剂的作用 1. 消化：
硫酸： 1. 脱水。使有机物炭化，生成C， 2. 氧化。 H2SO4将C、 H氧化为CO2和H2O蒸汽逸 出，本身还原为SO2，而pro则分解成氮，则与硫 酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中
NH2 CHCOOH+2 H2SO4= SO2 + H2O + 2CO2 + NH3 2NH3+H2SO4= (NH4)2SO4
凯氏定氮法步骤及原理
凯氏定氮法步骤及原理
凯氏定氮法是美国化学家亨利·凯氏在1880年发明的一种测定微量氮的方法。
此法是利用水中的含氮化合物在酸性溶液中与氢氧化钠反应，生成氨和氢氧化钠，用酚酞作指示剂，以硫代硫酸钠（或亚硫酸钠）溶液为指示剂，用盐酸标准溶液滴定，根据硫酸银或硫化银的颜色变化来确定滴定终点。
该法操作简便，但准确度低。
凯氏定氮法由五个基本步骤组成：
第一步：在碱性介质中，以硫代硫酸钠和硫酸作为指示剂，用盐酸标准溶液滴定。
第二步：当用氢氧化钠处理样品时，以硫代硫酸钠滴定。
根据硫酸银或硫化银的颜色变化来确定滴定终点。
凯氏定氮法的原理是以硫代硫酸钠滴定氨的过程中生成的硫酸银和硫化银与盐酸反应生成硫酸银和硫化银沉淀来测定氨的含量。
—— 1 —1 —。
凯氏定氮法测定蛋白质原理及操作
一、概述蛋白质是生命活动中不可或缺的重要物质，其含量的测定在生物化学研究和食品加工领域具有重要意义。
针对蛋白质含量的测定方法有许多种，其中凯氏定氮法是一种经典且常用的测定方法，本文将就凯氏定氮法测定蛋白质的原理及操作进行详细介绍。
二、凯氏定氮法原理1. 基本原理凯氏定氮法是通过测定样品中氨基氮的含量来间接测定蛋白质含量的方法。
蛋白质是由氨基酸构成的，而氨基酸中含有氮元素，故可以通过测定样品中氮元素的含量来推算出样品中蛋白质的含量。
2. 操作步骤（1）样品的预处理：将待测样品进行适当的预处理，通常是将样品中的有机物燃烧成气体，从而将其中的氮元素转化为氮气。
（2）氮气的收集：收集样品燃烧产生的氮气，通常是通过化学吸收剂的吸收来将氮气纯化。
（3）氮气的测定：将纯化后的氮气进行定量测定，得出氮气的含量。
（4）蛋白质含量的计算：根据氮气的含量，通过一定的计算公式来推算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法操作注意事项1. 样品的选择选择代表性好的样品进行测定，避免样品中含有其他干扰物质，影响测定结果的准确性。
2. 仪器的使用严格按照仪器的操作说明进行操作，保证测定过程的准确性和精确度。
3. 数据的处理对测定得到的数据进行严格的处理，计算过程中不应出现错误，以确保蛋白质含量的测定结果准确可靠。
四、凯氏定氮法测定蛋白质的优缺点1. 优点（1）测定范围广：凯氏定氮法可以适用于各种类型的样品，包括食品、饲料、生物组织等。
（2）测定结果可靠：经过严格的样品预处理和操作步骤，测定结果具有较高的准确性和精确度。
2. 缺点（1）操作繁琐：凯氏定氮法的操作步骤相对繁琐，需要较长的操作时间。
（2）不适用于含氮杂质的样品：如果样品中含有其他氮元素化合物的干扰物质，则可能影响凯氏定氮法的测定结果。
五、结语凯氏定氮法作为一种经典且常用的蛋白质测定方法，其原理和操作步骤相对简单明了，但需要严格遵守操作规范，以确保测定结果的准确性和可靠性。
凯氏定氮法
凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气馏出并为过量的酸液吸收，再以标准酸滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
原理蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4 反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
2.6 30%氢氧化钠溶液。
2.7 0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。
仪器安全管导管汽水分离管样品入口塞子冷凝管吸收瓶隔热液套反应管蒸汽发生瓶操作1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。
凯氏定氮法的原理及缺陷
凯氏定氮法的原理及缺陷
凯氏定氮法，也被称为凯氏法，是一种用于测定有机物和无机物中氨（NH3）含量的定量分析方法。
原理：
凯氏定氮法基于碱性溶液中氨的定量分析原理。
样品被加热，然后在碱性溶液中与亚硝酸盐（常用硫酸亚铁）反应生成具有蓝色或紫色的染料（常用碘化物）。
该氨盐染料可以通过光度计测定其吸光度，与氨的浓度成正比。
缺陷：
1. 需要高温：凯氏定氮法需要将样品加热至高温，这可能会导致某些有机物的降解和氨的损失。
2. 氨衍生化反应：为了使氨与亚硝酸盐反应生成染料，样品必须首先经过氨衍生化反应。
这个步骤需要耗费时间和试剂，并且可能会有其他干扰物产生与染料相似的颜色。
3. 干扰物：某些物质和离子可能会干扰凯氏定氮法的准确性，例如硫酸盐、硝酸盐和氯化物等。
4. 有机物的测定：凯氏定氮法对于有机物样品的应用局限性较大，特别是对于含有其他可氧化物质的样品。
此外，样品中还可能存在其他氮化合物（如硝酸盐），
这些也会对凯氏定氮法的准确性产生干扰。
5. 仅测定氨：凯氏定氮法仅能测定氨的含量，对其他氮化合物如亚硝酸盐和硝酸盐的测定都无法实现。
尽管凯氏定氮法有一些缺陷，但在某些特定的情况下仍然是一种常用的方法，尤其是在水样分析和土壤肥料中氨含量的测定中应用广泛。
凯氏定氮法
一、凯氏（kjeldahl）定氮法优点：用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少优点①可用于所有食品的蛋白质分析中;②操作相对比较简单;③实验费用较低;④结果准确,是一种测定蛋白质的经典方法;⑤用改进方法(微量凯氏定氮法)可测定样品中微量的蛋白质缺点①最终测定的是总有机氮,而不只是蛋白质氮;②实验时间太长(至少需要2h才能完成);③精度差,精度低于双缩脲法;④所用试剂有腐蚀性.灵敏度低适用于0.2-1.0mg氮干扰物质：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）；费时太长二Folin-酚试剂法优点：操作简便，灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。
缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。
通常测定范围是20~250mg。
三、Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
凯氏定氮法结果计算
凯氏定氮法结果计算
凯氏定氮法是常用的测定有机物中氮含量的方法，广泛应用于农业、
食品科学、环境科学等领域。
它的原理是将待测物样品与硫酸和碱性碘化
钾（KIO3）溶液反应，氮在硫酸的氧化作用下转化为硝酸根离子（NO3-），然后通过碘化反应将硝酸根还原为氮气（N2），生成的氮气通过比色法或
自动滴定法测定，从而计算样品中的氮含量。
1.计算氮气的体积（V）：
在凯氏定氮法中，生成的氮气通过滴定或漂白的方式进行测定。
常见
的方法是使用漂白剂滴定法。
步骤：
（1）首先将待测物样品与硫酸和KIO3溶液反应，并加热使反应进行；
（2）反应完全后，停止加热，用水洗涤反应容器内的尘埃；
（3）将含有氮气的容器适当冷却，以便于实验室气体计测量；
（4）用与温度相适应的滴定管收集容器内的氮气；
（5）使用滴定管向滴定瓶中滴加氯化钾（KCl）溶液，使溶液由颜色
深变为无色。
计算公式：
V=V1-V0
其中，V1为滴定前氯化钾溶液的体积，V0为滴定后氯化钾溶液的体积。
2.计算样品中的氮含量（N）：
根据采集的氮气体积和样品的质量，可以计算出样品中的氮含量。
计算公式：
N=(V*28)/(m*22.4)
其中，V为氮气体积（单位：mL），m为样品的质量（单位：g）。
需要注意的是，在计算氮含量时，需要进行一些修正，如校正反应条
件下氮气产生的副反应。
此外，对于固态和液态样品，还需要将样品转化
为气态才能进行测定。
总之，凯氏定氮法是一种可靠且常用的测定有机物中氮含量的方法。
通过计算生成氮气的体积，并结合样品的质量，可以得到样品中的氮含量。
凯氏定氮法
谢谢大家 Thank you very much
.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成
NH4HSO4反应式为： C12H14N2O2 +2H2SO4 → 2NH4HSO4 （其中CuSO4做催化剂） 2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于 H3BO3 溶液中 反应式为: NH4HSO4+2NaOH=NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 3. 用已知浓度的H2SO4标准溶液滴定，根据H2SO4消耗的量计算 出氮的含量 反应式为： (NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3
凯氏定氮法
消解剂：常在硫酸中加入硫酸钾（或无水硫酸钠）提
高硫酸沸点，以提高消解温度，缩短消解时间，防止 铵盐分解
催化剂：加入催化剂加快溶解速度，以缩短消解时间。
常用的催化剂是低价、低毒、无挥发性的硫酸铜
辅助氧化剂：用以使某些难以分解的药物分解完全并
缩短消解时间。常用的辅助氧化剂有30%过氧化氢和 高氯酸。其中高氯酸为强氧剂，用量不宜过大，否则 可能生成高氯酸铵而分解或将氮元素氧化成氮气而损 失，而且高氯酸在高温加热时易发生爆炸
酸水解
水解法
不经有 机破坏
碱水解 还原法
药品分析的 前处理方法 湿法破坏
经有机 破坏
凯氏定氮法 高温炽灼发 单击添加文本
干法破坏Biblioteka 单击添加文本氧瓶燃烧法经有机破坏的处理方法
含金属及含卤素、氮、硫、磷等有机物结构中的待测
原子与碳原子结合牢固者，用水解或氧化还原的方法 难以定量将有机结合的待测原子转变为无机形式
凯氏定氮法
凯氏定氮法1. 简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种用于测定有机物中氮含量的常用方法。
它是以丹麦化学家尤利乌斯·凯尔达尔（Johan Gustav Kjeldahl）的名字命名的，凯尔达尔于1883年首次提出了这种方法。
该方法适用于几乎所有的有机物样品，例如农产品、食品、肥料、土壤和水等。
凯氏定氮法的优点包括简单、准确、可靠，并且适应性强。
2. 测试步骤步骤一：样品处理将待测样品称取一定量（通常1-2g），精确称量并记录质量。
步骤二：消解将样品转移到凯氏消解管中，加入适量的浓硫酸（H2SO4）。
为使反应顺利进行，可以加入一些催化剂，如汞硫化物（HgS）。
经过消解，样品中的有机氮转为无机氮盐，主要形式为硫酸铵（NH4HSO4）。
消解期间要保持适当的温度控制，一般在沸水浴中加热1-2小时，直至反应结束。
步骤三：蒸馏将消解液转移到凯氏蒸馏装置中，加入含有氢氧化钠（NaOH）和含有酚酞指示剂的接收瓶中。
蒸馏器中的氢氧化钠用于吸收硫酸铵产生的氨气，并将其转化为氨水（NH4OH）。
使用蒸馏水蒸馏样品溶液，将氨气从样品中分离出来。
通过连续蒸馏过程，将氨气捕集在接收瓶中。
蒸馏过程中，要注意控制好蒸馏速度，并确保溶液中氨气的完全转化。
步骤四：滴定将收集到的氨水与盐酸（HCl）标准溶液进行滴定，用来确定氨气的数量。
滴定过程中，使用酚酞指示剂作为指示剂，使溶液在转变至中性时由红色变为无色。
通过滴定得到的氨氮量与消解液中样品的氮量成正比。
3. 计算氮含量根据凯氏定氮法的原理，可以通过以下公式计算样品中氮的含量：氮含量（%） = 滴定液中的NH3-N浓度（mol/L） × 滴定体积（L） ÷ 样品质量（g）4. 注意事项•操作过程中要注意安全，避免与强酸和强碱接触，戴上实验手套和护目镜。
•操作前应将仪器设备清洗干净，以免产生误差。
•消解液中加入的催化剂必须少量使用，过多会导致滴定过程中的误差。
凯氏定氮方法
试剂：1、浓硫酸2、30%过氧化氢（H2O2）3、40%氢氧化钠（NaOH）：400g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。
4、2%硼酸：20g硼酸溶于1000mL蒸馏水中。
5、100mL 95%乙醇：95mL无水乙醇加5mL蒸馏水。
6、定氮混合指示剂：称取0.5g溴甲酚绿和0.1g甲基红溶于100mL 95%乙醇中。
7、0.02mol/L盐酸（HCl）：1.8mL盐酸加入1000mL蒸馏水中。
操作步骤：一、消化1、称取过0.5mm筛的风干试样0.5g，置于消化管底部，用移液管加入10mL浓硫酸和1.5mL30%过氧化氢，小心摇匀，放置在消化炉中消化2-3小时。
空白样不加任何东西，别的处理都一样。
消化温度420度。
（在消化2小时后观察消化管中样品是否澄清透明，若澄清透明可停止消化，否则接着消化，3小时后停止消化）。
2、消化结束后，在消化炉中冷却半小时后，打开毒气罩，取出消化管放在消化管架上冷却至室温。
3、将消化管中液体无损的转入100mL容量瓶，定容。
4、洗净消化管，从定容后的消化液中取出10mL加入消化管底部。
准备蒸馏。
二、蒸馏1、打开全自动定氮仪预热半小时。
2、取一根消化管加入一些水，加碱，加蒸汽，让仪器运行一遍。
接收液可不用硼酸，用水代替。
3、将加有样品的消化管放入定氮仪，接收液为50mL 2%的硼酸加5滴定氮混合指示剂。
加碱，加蒸汽。
（接收液变为蓝色）三、滴定将0.02mol/L 盐酸加入酸式滴定管中，滴定至蓝色刚变为淡红色为终点。
记录消耗盐酸的体积。
计算公式：。
凯氏定氮法
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凯氏定氮法
根据凯氏定氮原理测定需要三个步骤，即消解，蒸馏，滴定。Hanon K9860型凯氏定氮仪可完成全自动蒸馏，滴定过程。消解总反应 式： 2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4=NH42SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%） <1>加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340℃， 加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。也可加入硫酸钠，氯化 钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。 <2> 加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱 性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、 二氧化钛。 <3> 加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机、物氧化速度。 2. 蒸馏 消化液 + 40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。
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凯氏定氮法
含氮量：N(%)= 1.401×M (V-V0) W 粗蛋白含量：P(%)= N(%) × C
M=标准酸摩尔浓度； W=样品重量（克）； V0=空白样滴定标准酸量消耗量（毫升）； V=样品滴定标准酸消耗量（毫升）； C=粗蛋白转换系数
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凯氏定氮法
⑦ —般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难 以氨化的氮化合物的样品．如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸 或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液 呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。 ⑧ 蒸馏装置不能漏气。 ⑨ 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时 需再增加氢氧化钠用量。 氢氧化铜在70～90℃时发黑。 ⑩ 蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟 后关掉热源．否则可能造成吸收液倒吸。
凯氏定氮法
凯氏定氮法的仪器设备简单，测定过程也较简便，又能同时测定多种样品，多用于化工生产的常规分析，但此法不能直接用于硝基化合物、亚硝基化合物、偶氮化合物、肼等的测定。
二、【实验原理】凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程称为有机物的消化。
为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，硫酸铜起催化剂的作用。
使用时常加入少量过氧化氢作为氧化剂以加速有机物氧化。
消化完成后，将消化液转入凯氏定氮仪反应室，加入过量的浓氢氧化钠，将NH4+转变成NH3，通过蒸馏把NH3驱入过量的硼酸溶液接受瓶内，硼酸接受氨后，形成四硼酸铵，然后用标准盐酸滴定，直到硼酸溶液恢复原来的氢离子浓度。
滴定消耗的标准盐酸摩尔数即为NH3的摩尔数，通过计算即可得出总氮量。
在滴定过程中，滴定终点采用甲基红-次甲基蓝混合指示剂颜色变化来判定。
测定出的含氮量是样品的总氮量，其中包括有机氮和无机氮。
以甘氨酸为例，其反应式如下：NH2CH2COOH+3H2SO4 =2C02+3SO2+4H2O+NH3 （1） 2NH3 +H2SO4 = (NH4)2SO4 （2）(NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3 （3）反应（1），（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）凯氏蒸馏烧瓶中进行（图1）。
蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在14％~18％，平均为16％）。
凯氏定氮法测定出的含氮量，再乘以系数6.25，即为蛋白质含量。
三、【试验器材】 1. 卵清蛋白 2. 凯氏定氮仪 3. 电炉 4. 消化架5. 锥形瓶100ml（×5）6. 量筒10ml(×1)7. 滴定管（5ml，可读至0.02ml） 8. 凯氏烧瓶（×2） 9. 玻璃珠 10. 吸耳球11．移液管（2ml，5ml，10ml×1）四、【实验试剂】1. 卵清蛋白溶液：2g卵清蛋白溶于0.9％NaCl溶液并稀释至100ml。
凯氏定氮法
凯氏定氮法编辑锁定凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随水蒸气蒸馏出来并为过量的硼酸液吸收，再以标准盐酸滴定，就可计算出样品中的氮量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
中文名凯氏定氮法外文名kjeldahl method分类蛋白质类型生物化学与分子生物学目录1. 1原理2. 2试剂1. 3仪器2. 4操作1. 5计算2. 6注意凯氏定氮法原理编辑蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
含氮量*6.25=蛋白含量.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4 作用下，硝化生成（NH4）2SO4凯氏定氮法反应式为：2NH2+H2SO4+2H=(NH4)2SO4 （其中CuSO4做催化剂）2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3 ，收集于H3BO3 溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O3. 用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O=(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3凯氏定氮法试剂编辑所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。
2.1 硫酸铜。
2.2 硫酸钾。
2.3 硫酸。
2.4 2%硼酸溶液。
2.5 混合指示液：1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
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四．实验步骤
步骤一
步骤二
步骤三
消化
蒸馏、吸收
滴定
（一）消化
1、标记消化瓶
1.观察浓硫酸刚加入牛奶中的颜色变化及原因？ 2.玻璃珠、 K2SO4、CuSO4 的作用？
2、依次将下列物质加入消化瓶：
5-6颗玻璃珠、催化剂 （ K2SO4，CuSO4 ） 、 1ml牛奶、10ml浓硫酸
3、将消化瓶放入智能数控消化炉进行消化，至液体变 为无色
① 250℃ 1h左右
② 350℃ 40min左右
③ 450℃ 2.5h左右
（二）蒸馏、吸收
微量凯氏定氮蒸馏装置
传统装置
1：电炉 2：水蒸气发生器 3：螺旋夹 4：小玻杯及棒状玻塞 5：反应室 6：反应室外层 7：橡皮管及螺旋夹 8：冷凝管 9：蒸馏液接收瓶
半自动凯氏定氮仪
1、确保仪器运行正常、管道内 部干净、管道及其连接口密 封性好
0s
C2（试验结束后第一次清洗） E2（加水） 20s
C3（试验结束后第二次清洗） E3（加水） 10s
蒸馏 E0 E1 E2 E3
时间 4min 2min 0min 4min
（三）滴定：
至灰色或蓝紫色 终点
至灰色或蓝紫色
五、结果计算:
X (V1 V 2) C 0.014 F 100 m
二、实验原理：
1. 氮元素： ➢ 蛋白质区别于糖和脂肪的基本特征 ➢ 绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般
恒定在15～17%，平均值为16%左右。
只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以相 应的蛋白质换算系数（均值为6.25、乳制品为 6.38），就可以计算出样品中的蛋白质含量。
• 2. 含氮量的测定
六、注意事项:
1、注意标记。 2、样品加入消化管时防止挂壁且注意梯度升温。 3.往消化管内加样时注意加样顺序（玻璃珠---催化剂---牛奶---浓硫酸）。 4、硫酸钾用于提高反应温度，但不可过多，否则温度过高，会引起生成的
铵盐分解产生氨，影响结果。 5、硫酸铜起催化剂作用并可指示消化终点。 6、取消化瓶时防止烫伤。 7、严禁污染吸收液、所用去离子水及管道等。 8、吸收前确保管口插入液面以下，吸收结束后使冷凝管下端离开液面，并
用去离子水将管口冲洗干净并回收至接收瓶。 9、规范滴定操作，且终点判定要一致。
1.实验完成后记得清理台面。 2.实验报告：
• 实验题目 • 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果 （空白滴定的结果可以共享） • 实验讨论 （操作中现象的出现原因；结果的影响因素；与商标
上显示的结果对比等。）
蛋白质含量的测定
—微量凯氏定氮法
蛋白质的理论知识：
蛋白质组成：
必需AA，条件必需AA，非必需AA,限制AA,AA模式
蛋白质功能：
蛋白质来源：
蛋白质的评价：
食物蛋白质的营养评价：
一 蛋白质的含量 二蛋白质消化率 三蛋白质利用率
1.真消化率 2.表观消化率
1.生物价 2.蛋白质净利用率 3.蛋白质功效比值 4.氨基酸评分
2、准备好吸收液（200ml 2%硼 酸 + 2ml 混合指示剂）并做 好标记
3、将碱溶液及去离子水桶与仪 器连接好，放入盛装消化好 样品的消化瓶，放入盛装吸 收液的锥形瓶并保证管口插 入液面下。
4、设置并启动程序
程序设置：
步骤
加碱或加水 时间
C0（样品间清洗）
E1
• X：样品蛋白质含量 （g/100g 或g/100mL） • V1、V2：测定用样、试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积
（mL） • C：盐酸标准液的摩尔浓度 （mol/L） • 0.014：1mol/L盐酸标准液1mL相当于氮的克数 • m：样品质量（g）或体积（mL） • F：蛋白质换算系数6.25
蛋白质含量的测定方法:
1. 定氮法 2. 双缩尿法（Biuret法） 3. Folin－酚试剂法（Lowry法） 4. 紫外吸收法 5. 考马斯亮蓝法（Bradford法）
蛋白质测定方法的比较：
微量凯氏定氮法
一、实验目的：
1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理 和方法。
2、学会使用凯氏定氮仪。
先高温条件下强酸(浓H2SO4)把 样品中的蛋白质的有机氮全部
消化
消化为无机氮形式
再强碱高温水蒸气蒸馏出氨气 蒸馏
用硼酸吸收氨气
吸收
用标准盐酸进行滴定
滴定
反应方程式
三、试剂：
1、消化液：98%浓硫酸 2、催化剂：硫酸铜、硫酸钾 3、碱溶液：40%氢氧化钠 4、吸收液：2%硼酸 5、混合指示剂：
0.1%甲基红乙醇溶液：0.1%甲基蓝乙醇溶液=（1：1） 6、标准滴定液：0.2M HCL
结果每个小组可以相同，但是讨论不能相同！