实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定课件

1、酚含量从酚标准曲线上查得 2、V0 反应初速率（μmol/min）为酚含量除以酶反应时间（15分钟）。 3、双倒数作图法计算Vmax和Km
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
19
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
20
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
13
0.4mM phenol standard solution H2O 1M Na2CO3
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
• 科代表 李博恒
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
8
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的HAC缓冲液2ml 研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm， 离心20min，取上清。
上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
酶液
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 -
精 确 反 应 15 分 钟 35度
碳酸钠溶液
2 2 2 2 222
Folin－酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
酶液
－ － － － － － 0.5
35℃保温10分钟
测680nm处吸光度
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
6
blank
buffer substrate
Certain Time
Stop the reaction
enzyme
Color
developed
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
7
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释３０倍，用大试管装
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
folin-酚测定酚的浓度
计算出反应速度（用产物生成量/min来表示）
根据双倒数法计算出Km及Vmax
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
3
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
4
Vmax [S] V=
Km + [S]
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
5
三、实验步骤：
• 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 • 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • 3、制作酚标准曲线 • 4、[S]与V0关系实验 • 5、双倒数作图法计算Vmax和Km
碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2
酶液
－ － － － － － 0.5
Fo3li5n℃－保酚温溶1液0分0钟.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Folin－酚溶液已稀释好！
注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
11
结果：
反应时间 吸光度
01 2 3 4 5 6 0 3 5 10 15 20 25
以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反 应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初
速率的时间范围。
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
12
• 3、制作酚标准曲线
• （目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相当的酚含量,并计算 出反应速度（用每分钟产物生成量来表示）
பைடு நூலகம்
35℃保温10分钟
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
14
以0号管作空白，在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度 （A680nm）。
结果：
酚含量/μmol 吸光度
01 2 3 4 5 6 7 8
0
0.0 0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.3 4 8 2 6 04 8 2
17
实验中需注意事项： 酶反应作用时间精确控制
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
18
实验结果
Tube number
1
2
3
4
5
6
[S] (mM)
0.5
0.75
1
1.25
1.5
2.5
1/[S]
A680
phenol content（酚含量）
V0 (μmole phenol per min)
1/ V0
以酚含量（μmol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线。
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
15
• 4、[S]与V0关系实验
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
16
实验加液程序表
管号
1234560
磷酸苯二钠 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50
醋酸缓冲液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 - -
9
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
10
加液程序表
管号
1234560
磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
酶液
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
精确反应时间 3 5 10 15 20 25
酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 清洗试管24支
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
1
一、概述
酸性磷酸酶： 催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指标。
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
2
二、实验原理
磷酸苯二钠