第二章 植物病原菌分泌的降解酶及其分子生物学
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通过层析的方法纯化酶蛋白（详细见课本P25)。
第二节 角质酶提取与致病性测定
活性丝氨酸鉴定
纯化的角质酶溶于含有60%异丙醇的磷酸缓冲 液（10ml，pH7.5），用磷酸缓冲液稀释，然后 与102 nmol/L二异丙基氟磷酸中混合。在与角质 酶混合前，用非标记二异丙基氟磷酸稀释放射 性标记二异丙基氟磷酸51倍。混合样23°C下 处理2h后，加入到经过20%异丙醇磷酸缓冲液 平衡处理的Sephades G-10（0.5cm*8cm）柱 上，用同样的缓冲液洗脱，将放射性标记的角 质酶于游离的二异丙氟磷酸分离。
2.1 侵入位点有角质酶
•角质酶是否存在于侵入位点是证实它是否有致病作用的先决条件。 对于角质酶的定位，目前主要是应用免疫技术和电镜技术。 •首先接种病菌孢子悬浮液。病菌侵入后用兔子角质酶抗血清处理侵 入部位，然后用电镜观察。如在侵入部位有电子密集颗粒，就说明 有抗原-抗体复合物存在，即角质酶（抗原）于其抗血清发生了结合， 也就证明了角质酶的存在。目前已经用此技术在茄腐皮镰孢豌豆专 化型侵染豌豆和胶孢炭疽菌侵染番木瓜果实的位点证实了角质酶的 存在。
一般角质物质是从含量较高的果实表皮中获得（如 苹果核葡萄表皮），利用硼氢化钠和二异丙基氟磷 酸提取。
例：将苹果黑星病菌菌株在PDA培养基扩繁后，经研磨 后，取上清液，加入到苹果角质粉做唯一碳源的 Czapek培养基（含0.1%碳酸钙），20°C下培养8周， 通过Whatman定性滤纸（4号或1号）过滤两次。
生理植物病理学
第二章 植物病原菌分泌的降解酶 及其分子生物学
2011级 植物病理学专业 2012.3.30
仲恺农业工程学院农学院
寄主植物的两道屏障：角质层和细胞壁多糖
植物病原菌主要通过产生一系列的降解 酶分解寄主植物的组织屏障，完成侵入 过程。
多数病原菌通过产生角质酶分解寄主植 物角质层，产生多种细胞壁降解酶分解 寄主植物细胞壁多糖（果胶、纤维素、 半纤维素等）。
CONTENTS
1 角质酶及其在病程中的作用 2 角质酶提取与致病性测定 3 植物病原菌产生的细胞壁降解酶的
致病作用分析 4 细胞壁降解酶编码基因的表达与调控
第一节角质酶及其在病程中的作用
植物病原菌尤其是植物病原真菌要侵染寄主植 物，需要突破的第一道组织屏障便是植物的角 质层。
植物的角质层是由大分子烷酸通过酯键、醚键、 过氧化物键组成的网状结构，这一网状结构的 打破必须通过病菌产生角质酶的降解作用才能 实现。
第一节角质酶及其在病程中的作用
一、角质酶的特性
角质没主要从病原菌中分离得到，已经证实至少有22种 植物病原菌能够产生角质酶（课本表2-1）。
角质酶能催化角质多聚物水解，产生寡聚体，最后产生 单体。 角质酶均为酯酶，相对分子质量为（22—26）×103，单 链，有一个二硫桥（课本图2-1） 该酶有同工酶，不同的病菌角质酶氨基酸组成基本相同。
比色分析：反应混合液含有底物丁酸对硝基苯 酯、缓冲液、角质酶和Triton X-100。在 400nm或405nm下测定分光光度值，以摩尔消 光系数计算酶活。
放射性分析法：用放射性标记，角质酶活性为 每分钟从同位素标记的角质释放的kBq（角质 酶活性单位）（Koller et al.，1982）。
第二节 角质酶提取与致病性测定
提取纯化
用高浓度的Tris缓冲液调节酶粗提液pH为8.5， 然后进一步通过AE-disk过滤。滤液经冷冻干 燥成酶蛋白粉。酶蛋白粉在含有10mmol/L 抗坏血酸的10mmol Tris-HCI（Ph8.5）溶液 中溶解，并在同样的缓冲液中透析过夜。用 丙酮沉淀蛋白，然后再宁mens缓冲液中悬浮、 离心、上清液透析过夜。
第二节 角质酶提取与致病性测定
2.2 钝化角质酶可阻止病菌侵入
•如果病菌只有产生角质酶才能侵入寄主，那么对角质酶活性中心的专一 性抑制，应该能阻止病菌侵入。利用角质酶抗血清和酶抑制因子与病菌孢 子悬液混合，然后接种寄主植物，如果不能引起寄主发病，说明角质酶活 性被钝化，也就说明病菌产生的角质酶是一种致病因子。目前利用这种方 法证实了茄腐皮镰孢豌豆专化型和胶孢炭疽菌分别在侵染豌豆番木瓜的过 程中产生角质酶。 •有几种有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯类杀菌剂能够钝化或抑制角质酶的活 性，却对病菌生长影响不大。众所周知，有机磷杀虫剂能够作用于昆虫胆 碱酯酶，而胆碱酯酶和角质酶同样是丝氨酸水解酶，因此有机磷杀虫剂抑 制机制，可能控制了酶活性中心的丝氨酸三分体结构。 •还有一些杀菌剂如克瘟散和笨莱特也是常用的抑制因子，这两 种杀菌剂除直接抑菌外，还能作为抗侵入剂。
第二节 角质酶提取与致病性测定
利用SDS凝胶电泳也可以用于确定角质酶提取 液的均一性和相对分子质量。蛋白也可以用考 马斯亮蓝R-250染色。还可以凝胶渗透层析技术 确定角质酶相对分子质量。氨基酸分析一般采 用反相HPLC方法，需要苯异氰酸的预柱衍生化 作用。
第二节 角质酶提取与致病性测定
酶活性测定
这些单体物质 可以诱导角质 酶编码基因表 达，合成更多 的角质酶，加 速降解寄主的 表皮角质层。
第二节 角质酶提取与致病性测定
一、角质
酶的获得 与活性测
定
诱导产生酶 提取与纯化 活性丝氨酸鉴定
酶活测定
第二节 角质酶提取与致病性测定
诱导产生酶
由于角质酶是诱导酶，因此需要角质物质作为培养 病菌的唯一碳源，才能在离体条件下诱导产生角质 酶。
角质酶属于诱导酶，主要成分为糖蛋白，其中3%-16%碳 水化合物，一般是以O-糖苷键与碳水化合物结合。
第一节角质酶及其在病程中的作用
二、角质酶在病程中的作用
角质酶是病 菌产生的突 破角质层的 主要工具酶， 能催化角质 多聚物水解。
病菌在侵入前 可在底物上产 生少量的角质 酶分解寄主表 皮的角质层， 释放少量的单 体。
相对分子质量与结构分析：采用SDS-PAGE确 定酶的均一性和相对分子质量。
第二节 角质酶提取与致病性测定
二、角质酶在病程中作用的证据
1.侵入位点有角质酶
4.向角质 酶缺失突 变株加入 角质酶恢 复了致病
力
证据
ห้องสมุดไป่ตู้
2.钝化 角质酶 可阻止 病菌侵
入
3.角质酶缺失突变株的致病力减 弱或无致病力
第二节 角质酶提取与致病性测定
第二节 角质酶提取与致病性测定
活性丝氨酸鉴定
纯化的角质酶溶于含有60%异丙醇的磷酸缓冲 液（10ml，pH7.5），用磷酸缓冲液稀释，然后 与102 nmol/L二异丙基氟磷酸中混合。在与角质 酶混合前，用非标记二异丙基氟磷酸稀释放射 性标记二异丙基氟磷酸51倍。混合样23°C下 处理2h后，加入到经过20%异丙醇磷酸缓冲液 平衡处理的Sephades G-10（0.5cm*8cm）柱 上，用同样的缓冲液洗脱，将放射性标记的角 质酶于游离的二异丙氟磷酸分离。
2.1 侵入位点有角质酶
•角质酶是否存在于侵入位点是证实它是否有致病作用的先决条件。 对于角质酶的定位，目前主要是应用免疫技术和电镜技术。 •首先接种病菌孢子悬浮液。病菌侵入后用兔子角质酶抗血清处理侵 入部位，然后用电镜观察。如在侵入部位有电子密集颗粒，就说明 有抗原-抗体复合物存在，即角质酶（抗原）于其抗血清发生了结合， 也就证明了角质酶的存在。目前已经用此技术在茄腐皮镰孢豌豆专 化型侵染豌豆和胶孢炭疽菌侵染番木瓜果实的位点证实了角质酶的 存在。
一般角质物质是从含量较高的果实表皮中获得（如 苹果核葡萄表皮），利用硼氢化钠和二异丙基氟磷 酸提取。
例：将苹果黑星病菌菌株在PDA培养基扩繁后，经研磨 后，取上清液，加入到苹果角质粉做唯一碳源的 Czapek培养基（含0.1%碳酸钙），20°C下培养8周， 通过Whatman定性滤纸（4号或1号）过滤两次。
生理植物病理学
第二章 植物病原菌分泌的降解酶 及其分子生物学
2011级 植物病理学专业 2012.3.30
仲恺农业工程学院农学院
寄主植物的两道屏障：角质层和细胞壁多糖
植物病原菌主要通过产生一系列的降解 酶分解寄主植物的组织屏障，完成侵入 过程。
多数病原菌通过产生角质酶分解寄主植 物角质层，产生多种细胞壁降解酶分解 寄主植物细胞壁多糖（果胶、纤维素、 半纤维素等）。
CONTENTS
1 角质酶及其在病程中的作用 2 角质酶提取与致病性测定 3 植物病原菌产生的细胞壁降解酶的
致病作用分析 4 细胞壁降解酶编码基因的表达与调控
第一节角质酶及其在病程中的作用
植物病原菌尤其是植物病原真菌要侵染寄主植 物，需要突破的第一道组织屏障便是植物的角 质层。
植物的角质层是由大分子烷酸通过酯键、醚键、 过氧化物键组成的网状结构，这一网状结构的 打破必须通过病菌产生角质酶的降解作用才能 实现。
第一节角质酶及其在病程中的作用
一、角质酶的特性
角质没主要从病原菌中分离得到，已经证实至少有22种 植物病原菌能够产生角质酶（课本表2-1）。
角质酶能催化角质多聚物水解，产生寡聚体，最后产生 单体。 角质酶均为酯酶，相对分子质量为（22—26）×103，单 链，有一个二硫桥（课本图2-1） 该酶有同工酶，不同的病菌角质酶氨基酸组成基本相同。
比色分析：反应混合液含有底物丁酸对硝基苯 酯、缓冲液、角质酶和Triton X-100。在 400nm或405nm下测定分光光度值，以摩尔消 光系数计算酶活。
放射性分析法：用放射性标记，角质酶活性为 每分钟从同位素标记的角质释放的kBq（角质 酶活性单位）（Koller et al.，1982）。
第二节 角质酶提取与致病性测定
提取纯化
用高浓度的Tris缓冲液调节酶粗提液pH为8.5， 然后进一步通过AE-disk过滤。滤液经冷冻干 燥成酶蛋白粉。酶蛋白粉在含有10mmol/L 抗坏血酸的10mmol Tris-HCI（Ph8.5）溶液 中溶解，并在同样的缓冲液中透析过夜。用 丙酮沉淀蛋白，然后再宁mens缓冲液中悬浮、 离心、上清液透析过夜。
第二节 角质酶提取与致病性测定
2.2 钝化角质酶可阻止病菌侵入
•如果病菌只有产生角质酶才能侵入寄主，那么对角质酶活性中心的专一 性抑制，应该能阻止病菌侵入。利用角质酶抗血清和酶抑制因子与病菌孢 子悬液混合，然后接种寄主植物，如果不能引起寄主发病，说明角质酶活 性被钝化，也就说明病菌产生的角质酶是一种致病因子。目前利用这种方 法证实了茄腐皮镰孢豌豆专化型和胶孢炭疽菌分别在侵染豌豆番木瓜的过 程中产生角质酶。 •有几种有机磷杀虫剂、氨基甲酸酯类杀菌剂能够钝化或抑制角质酶的活 性，却对病菌生长影响不大。众所周知，有机磷杀虫剂能够作用于昆虫胆 碱酯酶，而胆碱酯酶和角质酶同样是丝氨酸水解酶，因此有机磷杀虫剂抑 制机制，可能控制了酶活性中心的丝氨酸三分体结构。 •还有一些杀菌剂如克瘟散和笨莱特也是常用的抑制因子，这两 种杀菌剂除直接抑菌外，还能作为抗侵入剂。
第二节 角质酶提取与致病性测定
利用SDS凝胶电泳也可以用于确定角质酶提取 液的均一性和相对分子质量。蛋白也可以用考 马斯亮蓝R-250染色。还可以凝胶渗透层析技术 确定角质酶相对分子质量。氨基酸分析一般采 用反相HPLC方法，需要苯异氰酸的预柱衍生化 作用。
第二节 角质酶提取与致病性测定
酶活性测定
这些单体物质 可以诱导角质 酶编码基因表 达，合成更多 的角质酶，加 速降解寄主的 表皮角质层。
第二节 角质酶提取与致病性测定
一、角质
酶的获得 与活性测
定
诱导产生酶 提取与纯化 活性丝氨酸鉴定
酶活测定
第二节 角质酶提取与致病性测定
诱导产生酶
由于角质酶是诱导酶，因此需要角质物质作为培养 病菌的唯一碳源，才能在离体条件下诱导产生角质 酶。
角质酶属于诱导酶，主要成分为糖蛋白，其中3%-16%碳 水化合物，一般是以O-糖苷键与碳水化合物结合。
第一节角质酶及其在病程中的作用
二、角质酶在病程中的作用
角质酶是病 菌产生的突 破角质层的 主要工具酶， 能催化角质 多聚物水解。
病菌在侵入前 可在底物上产 生少量的角质 酶分解寄主表 皮的角质层， 释放少量的单 体。
相对分子质量与结构分析：采用SDS-PAGE确 定酶的均一性和相对分子质量。
第二节 角质酶提取与致病性测定
二、角质酶在病程中作用的证据
1.侵入位点有角质酶
4.向角质 酶缺失突 变株加入 角质酶恢 复了致病
力
证据
ห้องสมุดไป่ตู้
2.钝化 角质酶 可阻止 病菌侵
入
3.角质酶缺失突变株的致病力减 弱或无致病力
第二节 角质酶提取与致病性测定