柱层析方法经验归纳汇总

1、选柱子：有玻璃柱和不锈钢柱两种，实验室常用玻璃柱。

径高比一般在1:5-10。

根据吸附剂用量（体积)确定柱子大小，一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4～1/5。

柱子可以分为：加压，常压，减压。

压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。

其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。

减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结)，以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长)。

加压柱是种比较好的方法，与常压柱类似，只是外加压力使淋洗剂走的快些。

压力的提供可以是压缩空气，双连球或小气泵。

特别在容易分解的样品的分离中适用。

压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。

加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。

柱子的尺寸为粗长的最好。

柱子越长，相应的塔板数就越高。

柱子越，上样后样品的原点就越小（反映在柱子上就是样品层比较薄)，这样相对的减小了分离的难度。

无水无氧柱适用于对氧、水敏感，易分解的产品。

可以湿柱，也可以干柱。

不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的物质，小心不为过。

因为分离的物质比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。

至于是加压、常压、减压，随需而定。

因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。

如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。

无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。

因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。

而氧化铝有碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但比硅胶要贵些。

听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。

2、选择吸附剂：200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶。

干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40 g硅胶，用烧杯量100 ml也可以。

书中写硅胶量是样品量的30-40倍，具体的选择要具体分析。

如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在0.2-0.4，杂质相差0.1以上)，就可以少用硅胶。

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。

所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。

这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。

这时可以采用氧化铝作固定相。

常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。

几种常见吸附剂的特性（1)氧化铝：市售层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三类，粒度规格大多为100-150目。

碱性氧化铝（pH9—10)：适用于碱性物质（如胺、生物碱)和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等)，也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。

但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。

酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。

所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。

酸性氧化铝（pH3.5—4.5)：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。

中性氧化铝（pH7—7.5)：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。

（2)硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。

柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。

适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，及一系列合成产品如有机金属化合物等。

（3)聚酰胺：色谱用聚酰胺主要又锦纶6（聚己内酰胺)和锦纶66（聚己二酰己二胺)两种，分子量一般在16000～20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。

可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；对碱稳定，对强酸可水解。

聚酰胺色谱的原理：兼具吸附色谱和分配色谱的功能。

采用强极性洗脱剂时主要为吸附色谱——正相色谱；采用弱极性洗脱剂时主要为分配色谱——反相色谱。

分离对象：能与聚酰胺形成氢键的化合物，如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。

聚酰胺在水中吸附能力的规律：形成氢键的基团(如酚经基、按基、酪基、硝基等)越多，吸附力越强。

如丁二酸＞丁酸形成氢键的位置与吸附力有很大关系。

对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附力减小。

芳香核、共轭双键多者吸附力大，少者吸附力小。

若形成分子内氢键，则使化合物的吸附力减小。

（4)硅酸镁：中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。

为了得到中性硅酸镁，用前先用稀盐酸，然后用醋酸洗涤，最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。

3、选洗脱剂：一般淋洗剂是采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂。

要使所需点在Rf值在0.2-0.3左右的比较好。

极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统。

常用溶剂的极性顺序：石油醚<环己烷/己烷<苯乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水。

单一溶剂的极性大小顺序为：石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<乙酸甲酯<丙酮<正丙醇<甲醇<吡啶<乙酸二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。

甲醇据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。

一般把两种溶剂混合时，采用高极性/低极性的体积比为1/3的混合溶剂。

拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。

乙酸乙酯/石油醚=4:1可用TLC分开。

乙酸乙酯和石油醚(60-90)。

混合溶剂的极性顺序：苯∶氯仿(1+1)、环己烷∶乙酸乙酯(8+2)、氯仿∶丙酮(95+5)、苯∶丙酮(9+1)、苯∶乙酸乙酯(8+2)、氯仿∶乙醚(9+1)、苯∶甲醇(95+5)、苯∶乙醚(6+4)、环己烷∶乙酸乙酯(1+1)、氯仿∶乙醚(8+2)、氯仿∶甲醇(99+1)、苯∶甲醇(9+1)、氯仿∶丙酮(85+15)、苯∶乙醚(4+6)、苯∶乙酸乙酯(1+1)、氯仿∶甲醇(95+5)、氯仿∶丙酮(7+3)、苯∶乙酸乙酯(3+7)、苯∶乙醚(1+9)、乙醚∶甲醇(99+1)、乙酸乙酯∶甲醇(99+1)、苯∶丙酮(1+1)、氯仿∶甲醇(9+1)4、装柱：4.1、湿装法：方法一：准确加入一定体积的溶剂，然后缓慢加入吸附剂，必要时可轻敲柱壁，排除多余溶剂，计算主留体积方法二：1) 搅成匀浆：先把硅胶泡在烧杯中，用干硅胶体积一倍的溶剂泡，用超声波超半个小时，中间看到气泡时用玻璃棒搅一下。

如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。

如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。

氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。

如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。

2) 装柱：用溶剂把柱子饱和一次。

因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量可能使产品分解。

将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚(氯仿)，装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。

随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。

4.2、干装法：在下端减压抽气的同时，将吸附剂通过长径漏斗缓缓到入柱内。

装柱时一定要保证无气泡，同时敲打柱体使柱体更均匀紧凑，装毕，用洗脱液冲三次。

柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。

装完的柱子应该要适度的紧密(太密了淋洗剂走的太慢)，一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。

柱子更忌讳的是开裂，无论竖的还是横的都会影响分离效果，甚至作废！5、压实：沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。

柱床约被压缩至9/10体积。

无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。

6、上样：干法湿法都可以。

海沙是没必要的。

1) 在硅胶上层加少量无水硫酸钠(以免样品被洗脱剂冲散)。

将样品溶于合适的溶剂后，在搅拌下加入样品量3～5倍的吸附剂，晾干至粉末状。

然后在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。

上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。

然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。

2) 将样品溶于合适的溶剂，在不扰动吸附剂层面的情况下，加到柱体上面。

最后再用少量清洁溶剂对主壁洗涤2～3次，加完后将下面的活塞打开。

待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。

加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(2～4cm)，再加压，这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。

7、过柱和收集：必须注意在洗脱的过程中，尤其是开始阶段，不能扰动层面。

洗脱速度一般为每分钟流出1/200柱留体积左右。

柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。

太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。

梯度洗脱需注意标记不同溶剂的分界管号。

分部收集：一般每管收集1/20～1/10柱留体积。

收集的例子：10 mg上样量，1 g硅胶，0.5 ml收一馏分；1-2 g上样量，50 g硅胶(200-300目)，20-50 ml收一馏分。

8、检测：要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。

9、送谱：收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。

如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。

可除去氢谱1.5 ppm左右所谓的“硅胶”峰。