如何检测RNA病毒

PCR的原理：
体外DNA复制
包括高温变性、 低温退火和中温 延伸过程。
一、PCR基本步骤
三个步骤：
1、变性(Denature)：双链DNA目的片段在94℃下解链。
2、退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃
左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对。
3、延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最
（2）氯仿可使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。其主 要作用是分相，实际上是加速有机相和水相的分 层。上层水相，pH 5.1左右，当溶液pH在酸性的 时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只 有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA 就会溶解在水相，（导致pH中性的原因可能是 trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前 提下使trizol过量）。同时，氯仿可以去除核酸溶 液中的痕量的酚。
1、全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换 （使用一次性手套）。 2、所用的玻璃器皿需置于干热灭菌箱中200℃烘 烤2h以上。 3、不能用高温烘烤的材料，如塑料容器、试剂 等可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理， 然后高压灭菌以消除残存的DEPC。
注意事项：
1、DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物。 2、DEPC能与氨基和巯基反应，因而含Tris和DTT （二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水 配制，并尽可能用未曾开封的试剂。
8、引物不与模板结合位点以外的序列互补。
引物浓度：
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体，过低
则降低产量。

4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：
dNTP原液一般配成2.5-10mmol/L分装，-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。 当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚 合酶的活性。 4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某 种dNTP的不足出现的错误掺入。
所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化
进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增
加，过少则使产量降低。
反应结束后，需要灭活Taq DNA聚合酶。
灭活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR产物经酚/
氯仿抽提，乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA
螯合Mg2+ 。 (3) 99-100℃加热10min。目前已有直
（3）异丙醇作用是沉淀RNA。异丙醇沉淀，优点是 容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和 mRNA，对5sRNA、tRNA不产生沉淀，所以RNA 电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必 是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。 （4）因为上述试剂会影响后续实验，所以用75%乙 醇洗1-2次。一是乙醇可以溶解一些沉淀中可能的 有机物杂质；二是洗掉异丙醇、氯仿，乙醇易挥 发，痕量的乙醇很容易挥发掉。
用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用
此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的
PCR扩增。
第二章 聚合酶链式反应 （PCR）
* PCR，即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）, 是一种对特定的DNA片段在体外进行快 速扩增的方法。 * 由1985年穆里斯（K. Mullis）发明，他也因此获得 了1993年的诺贝尔化学奖。

Mg2+：
Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响 酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度， 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。 通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的 PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验，选出最适的Mg2+浓度。
Yeast Total RNA
二、cDNA的合成

反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
种类：两种 1、禽类成髓细胞病毒（AMV）反转录酶 包括两个多肽亚基（最适温度42℃） 活性：依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的 DNA合成以及对DNA:RNA杂交体的RNA部分 进行内切降解(RNA酶H活性)。
总RNA提取方法（试剂盒）：
异硫氰酸胍－苯酚法（Trizol 法） 原理：（1）Trizol的主要成分是酚。主要作用是裂 解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释 放。酚是有效的蛋白变性剂，但不能完全抑制 RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、 异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源 RNase。 异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白 质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构 消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。
量更少。
模板过多可能增加非特异性产物。DNA中的杂质
也会影响PCR的效率。

Taq DNA聚合酶：
一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min， 95℃ 40min， 97℃ 5min。 Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃ 30min， 掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。 Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一 般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，在利用 PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。
4、引物3'-端最好与目的序列阅读框架中密码子第 一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆 动产生的不配对。 5、在引物内，尤其在3‘-端应不存在二级结构， 且3’-端尽量不用A，尤应避免连续2个或2个以 上A，因为A引发错配的几率高；最好选择T。
6、两引物之间尤其在3'-端不能互补，以防出现 引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在 4个连续碱基的同源性或互补性。 7、引物5'-端对扩增特异性影响不大，可在引物 设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起 始密码子、缺失或插入突变位点等，通常应在 5'-端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
适温度(72℃左右)下，以目的DNA为模板进行合成。
二、PCR反应中的主要成分

引物：好坏是PCR成败的关键。
设计原则： 1、引物长度约为16-30bp。 2、引物中G+C含量通常为40%-60%，粗略估计引物的 解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T)，且接近72℃最好。 3、四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C， 因这样会使引物在G+C富集序列区引发错误。
2、Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的引物
绝大多数真核细胞mRNA具有3’-端Poly(A)尾，此引
物（12-18核苷酸）与其配对，仅mRNA可被反转录。
由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成
的cDNA比随机引物得到的cDNA在数量和复杂性方
面均要小。
3、特异性引物
在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带 负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影 响Mg2+浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度。

模板：
PCR中模板DNA可以是单链分子，也可以是双链 分子，可以是线状分子，也可以是环状分子(线状 分子比环状分子的扩增效果稍好)。
就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的 数量和纯度。 一般反应中模板量为102-105个拷贝。扩增单拷贝 基因，需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母 DNA，1ng的大肠杆菌DNA。多拷贝基因扩增用
2、鼠白血病病毒(M-MLV)反转录酶
只有单个多肽亚基（最适温度37℃）
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活性：依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，
但降解RNA:DNA杂交体中的RNA的能力较弱，
且对热的稳定性较AMV反转录酶差。
M-MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。

cDNA引物
种类： 1、随机引物：不特异的引物 体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板， PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通 常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
第一章 RNA的提取和cDNA的合成
RT-PCR原理
提取总RNA
以其中的mRNA作为模板
反转录
cDNA 作模板 PCR
获得目的基因
一、RNA的提取

RNA易降解，在提取过程中要严格防止RNA
酶的污染，并设法抑制其活性。

RNA酶稳定，并广泛存在，如各种组织、人
的皮肤、手指、试剂、容器等。
采取的措施：
接纯化PCR产物的Kit可用。

反应缓冲液：
反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris〃Cl (20℃下 pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。 加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)或100μg/ml的牛血 清白蛋白(BSA)，可稳定酶活性；加入T4噬菌体的基 因32蛋白对扩增较长DNA片段有利。 各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的缓冲液。