3生物剂量计

染色单体断裂
结果和讨论
六、注意事项
1、人外周血淋巴细胞培养
➢ 操作中要严格遵守无菌操作原则。 ➢ 采血时注意不要加入太多的肝素。肝素过
多可引致溶血和抑制淋巴细胞转化和分裂。 ➢ 血液离体后要保持37oC(包括照射时)。 ➢ 加入培养液的量要准确。 ➢ 器皿要洗涤干净，避免酸性或碱性物质残
概述
机体受到电离辐射后，会产生某些 生物学变化。用生物学指标准地确定已 接受辐射剂量的理论和方法，称为生物 剂量学。
某些生物剂量测定体系称为生物剂 量计。
目的和意义
• 在事故情况下，进行剂量测定首要目的是 对受照者做出剂量诊断，作为临床确定治 疗方案的依据，也为远期对健康的影响进 行危害评价提供参考。
原理
用Giemsa染色后，就可清楚看到双股都含有 BrdU的DNA链所组成的单体着色浅，而仅一条 链含有BrdU的单体着色深。这样根据两条姊妹 染色单体所显示的深浅不同，可以区分中期染色 体的姊妹染色单体（见附图）。应用姊妹染色单 体区分染色法（sister chromatid differential staining, SCD）。可以研究细胞周期、染色体半 保留复制、染色体的分子结构与畸变，以及DNA 的复制、损伤与修复等一系列问题。
• 对职业性慢性照射者的剂量估计，可以为 辐射的早期和远后效应之间的关系以及对 受照者的工作安置提供生物学依据。
生物剂量计应具备的基本条件
1、对电离辐射有特异性或至少在正常人自发 本底值很低；
2、具有较高的灵敏度，且与照射剂量相关性 较好；
3、整体与离体效应一致； 4、对各类射线均具有较好的反应； 5、对大剂量急性照射和对小剂量累积照射均
0.067mol/L，PH6.8磷酸缓冲液）， • 胎牛血清，RPMI1640培养液，PHA • 培养瓶，离心机，玻璃片。
实验步骤
1、动物照射 分别用0、0.1、0.2、0.5、 1.0、 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0Gy 60Coγ射线全身照射小鼠，每个剂量点6只 动物。
2、分离外周血淋巴细胞 照射后24h，无菌 获取小鼠外周血，加入淋巴细胞分离液， 进行梯度离心，分离外周血淋巴细胞。
8、制片 第三次固定后去上清，留 沉淀物0.2～0.4ml，混匀后用滴管 吸取细胞悬液，滴在己预先在4℃冰 冻的干净玻片上。每片1～2滴，用 嘴轻轻吹散，在酒精灯火焰上微微 烤干（或空气中自然干燥）。
9、染色 用Giemsa母液和磷酸缓冲液 （PH6.8）按1：10配成染色液，将所 制成的玻片染色10～20分钟。自来水略 洗，晾干。
（二 ）秋水仙素的应用
• 秋水仙素可以抑制纺锤丝和纺锤体的形成。 因此，在细胞培养到一定时期时加入秋水 仙素可使进行分裂的细胞停止在分裂中期， 它是观察染色体形态的最佳阶段，因此加 入秋水仙素可以累积许多中期分裂相细胞， 便于畸变的分析。
（三）低渗溶液的处理
• 细胞低渗技术的建立，使细胞膜膨胀， 从而扩大细胞的空间，大大减少染色体 的团集．重叠观象，有利于对染色体数 目和畸变的计数及辨认。
（四）细胞固定和制片技术的改进
• 应用一定比例的甲醇、冰醋酸固定 液固定细胞，可以大大提高染色体 标本质量，使染色体形态清晰，畸 变易于识别。
一、染色体畸变作为生物剂量的估计
实验原理
• 染色体畸变分析作为生物剂量估计，首先 要在离体条件下，用健康人血照射不同的 剂量，根据畸变量与照射剂量的关系制作 剂量-效应曲线。
3、细胞培养 用含10% 胎牛血清的 RPMI1640培养液配制成细胞悬液，接 种于25ml培养瓶中，移入培养箱 （37℃,5%CO2），每瓶培养液加入 PHA 0.1ml 。
人体1ml外周血中约含有1×106～3×106个 小淋巴细胞，它们几乎都处于G0期或G1期，一般 情况下是不分裂的。用人工离体培养的方法，在 培养基中加入植物血凝素（PHA），外周血淋巴细 胞经过有丝分裂刺激剂－PHA刺激后，转化为幼稚 细胞－淋巴母细胞。后者具有分裂、增殖能力。 在体外经过短期培养，可得到大量有丝分裂细胞。 细胞有丝分裂过程中，分裂中期细胞染色体的形 态最为典型。一般所说的染色体即指该期而言。 离体血经过射线照射后，可用于辐射剂量估算。 分析染色体畸变时要求分析第一周期细胞，避免 畸变的丢失。
原理
细胞在含有BrdU的培养液中培养，第一 次分裂时，中期染色体的两条姊妹染色单体的 DNA链，一股是原来的链，一股是含有BrdU的 新链，它们在染色时，两条姊妹染色单体着色 相同，显示不出差别。当细胞进入第二次分裂 时，中期染色体的两条姊妹染色单体，一条是 由单股含BrdU的DNA，另一条则是双股螺旋链 全部掺入BrdU(BB链)的DNA，由于双股都含 有BrdU的DNA分子构型有变化，DNA的螺旋化 程度降低，改变了对Giemsa染料的亲合力。
试剂与器材
1、试剂
• 2×SSC液：每1000ml蒸馏水中加 0.3molNaCl(取17.53g)和0.03mol柠檬酸钠 （8.82g），混匀。用10mol/L的NaOH调节 PH至7.0。
• 1M Na 2HP04溶液。 • PH6.8磷酸盐缓冲液。
• 染色液：Giemsa原液 • 40ug/ml秋水仙素溶液
• 发生事故时，取受照者的血，在标准条件 下进行培养、制片及畸变分析。根据所得 的dic或d+r的畸变率，从相应射线所建立 的曲线回归方程估算人员所受的剂量。
材料
• 60Coγ源， • BALB/c雄性小鼠48只， • 0.075mol/LKCl， • 固定液（3份甲醛+1份冰醋酸，用前配置） • Giemsa染色液（1份Giemsa原液+9份
关键技术
(一)人类外周血淋巴细胞培养成功
人类细胞的体外培养特别是外周血淋巴 细胞培养时，加入植物凝血素，可使培养 的淋巴细胞在短时期内进行转化和分裂增 殖，由此可在培养一定时间内获得大量的 分裂细胞。
利用这样的细胞制作成染色体标本 进行观察，可以为临床诊断及科学研究提 供染色体异常的依据。
人体1ml外周血中约含有1×106～3×106个 小淋巴细胞，它们几乎都处于G0期或G1期，一般 情况下是不分裂的。
6．分化结束后，取出玻片流水轻轻冲洗，然 后用5％的Giemsa磷酸盐缓冲液染色10～15 分钟，流水冲洗干燥后显微镜下观察。
(二) 磷酸盐Giemsa分化法
1、第1、2步同紫外线分化法 2、将标本片直接放入方玻片架上，然后放入
已有lMNa2HP04溶液并且预热80℃玻璃缸内， 保持温度分化5～10分钟。 3、取出用40～60℃蒸馏水冲洗，干燥。 4、用5%Giemsa磷酸盐缓冲液染色10～15分钟， 水洗干燥，镜检
➢ 玻片要事先冷却，取出后快速滴片以保证染色体 分散良好。每例最少要制2～3张标本片。
思考
1、培养基中添加PHA和小牛血清的作 用是什么？
2、电离辐射后染色体有哪些改变？ 3、建立生物剂量ห้องสมุดไป่ตู้的意义？
二、姊妹染色单体差别染色技术(SCD)
实验原理
每条染色体由两个染色单体组成。 每条染色单体由DNA双股核苷酸链组成。 胸腺嘧啶核苷(TdR)是核苷酸链的重要 组成部分，而5-溴脱氧尿嘧啶核苷 (BrdU)是TdR的类似物。由于二者的化 学结构相似，在DNA半保留复制过程中 BrdU代替TdR掺入到新复制的DNA链中。
• 来自一个染色体的两条单体之间同源片断 的互换称为姊妹染色单体互换（sister chromatid exchange,SCE）。这种互换是 完全的、对称的。由于姊妹染色单体染色 上的明显差异，如果姊妹染色单体间在某 些部位发生互换，则在互换处可见有一界 限明显、颜色深浅对称的互换片断。由于 SCE易于计数，即使在一定距离内发生多次 互换，也可被检测出来
留。
2、染色体标本制备方法
➢ 收集培养物要尽量完全。
➢ 低渗处理是实验成功的关键，其目的是使细胞体 积胀大，染色体松散。低渗液与培养物为4：l。 低渗时间要准确，如果时间过短，染色体相互重 叠，交叉，观察时无法辩别和计数；如果时间过 长，会造成细胞破裂，染色体丢失，不能准确计 数。
➢ 第一次固定时，一定要把沉淀打散混匀但动作要 轻。
有较好的剂量-效应关系；
6、不受环境诱变剂的干扰； 7、个体间变异小； 8、方法简便，取材方便，不增加受检者
痛苦； 9、测定方法快速，最好能在取样后48h内
给出剂量结果； 10、有可能借助于仪器实现自动化。
分类
• 细胞遗体学：染色体畸变．淋巴细胞微核； 早熟凝集染色体等；
• 体细胞基因突变：如hprt；GPA;TCR;HLA-A • 毛发
判定标准与计数
(一)SCE判定标准
1、染色单体端部出现的交换为一次交换(即 一个断裂点的交换)。
2、染色单体中间出现的交换为二次交换(即 二个断裂点的交换)。
3、着丝粒部位发生一次互换，判断不是两条 染色单体在着丝粒部发生的扭转，计为一 次SCE，但另列入“着丝粒区互换（CME）” 一项
(二)细胞分裂周期判定标准
• BrdU溶液：200ug／ml BrdU无菌溶液(避 光4℃保存)
2．器材
• 超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱 (小)、标本分化槽、30W紫外线灯、定时 钟、量筒、培养瓶、吸管、玻璃缸（小）、 玻片架、染色用具、显微镜等。
实验步骤
（一）紫外灯照射法
1、培养基制备、采血及培养过程与人体外周 血淋巴细胞培养相同。 培养基中需加入 200ug／ml BrdU 0.1ml，混匀后37℃避光 培养。
1、在分化良好的标本片上染色体全部深染的 细胞为第一周期。
2、染色体两个单体为一浅一深者为第二周期。 3、一个细胞46条染色体中有3/4染色单体浅
染者为第三周期。 4、一个细胞46条染色体中有7/8染色单体浅
染者为第四周期。
（三）计数
选择染色体分散良好、数目为2n=46 的人的中期分裂相细胞进行观察计数。 每个样品一般选择30个细胞进行SCE分 析，最后求得一个平均数。