高通量测序技术的类型原理及应用--ppt
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高通量测序原理课件
传统的测序方法，适用于小规模测序项目。
高通量测序技术
采用并行测序的方法，能够大幅提高测序效率 和准确性。
高通量DNA。2DNA片段连接
将DNA片段连接到测序引物和适配器。
3
DNA扩增
通过PCR或桥式PCR扩增DNA片段。
4
测序反应
利用测序技术获取DNA片段的序列信息。
高通量测序原理课件
欢迎来到高通量测序原理课件！ 在本课程中，我们将深入介绍高通量测序的 原理和应用，帮助您理解这项革命性的技术。
高通量测序原理简介
高通量测序是一种先进的基因测序技术，它能够以前所未有的速度和准确度获取DNA序列信息。它已经在许多 领域产生了深远的影响。
测序方法概述
Sanger测序
Ion Torrent
无需芯片，具有快速和灵敏的 测序技术。
结论和展望
高通量测序技术的快速发展为生命科学研究带来了巨大的机遇。未来，我们 可以期待更加高效和经济的测序方法的出现，推动理和分析，得出DNA序列。
应用领域与发展趋势
高通量测序已经广泛应用于基因组学、医学研究、农业科学等领域。随着技术的不断革新，我们可以期待更多 令人兴奋的应用和创新。
主要技术平台对比
Illumina
市场主导者，提供高度准确和 高通量的测序服务。
PacBio
长读段测序，适用于复杂基因 组和结构变异的研究。
高通量测序技术
采用并行测序的方法，能够大幅提高测序效率 和准确性。
高通量DNA。2DNA片段连接
将DNA片段连接到测序引物和适配器。
3
DNA扩增
通过PCR或桥式PCR扩增DNA片段。
4
测序反应
利用测序技术获取DNA片段的序列信息。
高通量测序原理课件
欢迎来到高通量测序原理课件！ 在本课程中，我们将深入介绍高通量测序的 原理和应用，帮助您理解这项革命性的技术。
高通量测序原理简介
高通量测序是一种先进的基因测序技术，它能够以前所未有的速度和准确度获取DNA序列信息。它已经在许多 领域产生了深远的影响。
测序方法概述
Sanger测序
Ion Torrent
无需芯片，具有快速和灵敏的 测序技术。
结论和展望
高通量测序技术的快速发展为生命科学研究带来了巨大的机遇。未来，我们 可以期待更加高效和经济的测序方法的出现，推动理和分析，得出DNA序列。
应用领域与发展趋势
高通量测序已经广泛应用于基因组学、医学研究、农业科学等领域。随着技术的不断革新，我们可以期待更多 令人兴奋的应用和创新。
主要技术平台对比
Illumina
市场主导者，提供高度准确和 高通量的测序服务。
PacBio
长读段测序，适用于复杂基因 组和结构变异的研究。
高通量测序原理和应用
高通量测序原理和应用
高通量测序是以DNA测序为基础的一种技术，旨在实现快速和准确地读取整 个基因组。本展示将介绍高通量测序的定义、测序技术、应用场景及其在医 学中的重要性。
高通量测序的定义和原理
高通量测序指的是通过并行测序技术，以迅速、高效地测定DNA或RNA序列。 它基于光学、电化学或生物学等原理，通过将待测样本切割成小片段，并用 核酸测序技术读取、记录和分析这些片段的序列信息。
第一代测序技术
Sanger测序法
由Frederick Sanger在1977年开发，是第一代测序技术的代表。它基于二进制分子链终止法，使用放射性同 位素或荧光染料进行标记。
第二代测序技术
Illumina测序
利用bridgePCR技术，通过可控制的DNA合成和荧光校验基团，实现对DNA片段的快速高通量测序。
应用场景和优势
1 基因组学研究
高通量测序革新了基因组学研究，为解读基因组提供了更快速、更准确的方法。
2 医学诊断
它可以检测基因变异、确定疾病风险和提供个体化医疗方案。
3 生物多样性研究
通过对DNA或RNA片段的测序，可以快速鉴定物种和了解生物多样性。
高通量测序在医学中的应用
遗传病筛查
肿瘤基因组学
可以快速检测潜在的遗传病风险， 帮助家庭做出更明智的生育决策。
通过测序肿瘤细胞的DNA片段， 可以发现肿瘤突变、预测疗效、 指导个体化治疗。
药物基因组学
通过分析个体基因型，可以确定 个体对药物的反应，指导用药剂 量和选择。
未来发展趋势
未来高通量测序技术将更加快速、准确和经济。同时，与人工智能和大数据的结合，将促进高通量测序在个性 化医学和精准治疗方面的深入应用。
第三代测序技术
高通量测序是以DNA测序为基础的一种技术，旨在实现快速和准确地读取整 个基因组。本展示将介绍高通量测序的定义、测序技术、应用场景及其在医 学中的重要性。
高通量测序的定义和原理
高通量测序指的是通过并行测序技术，以迅速、高效地测定DNA或RNA序列。 它基于光学、电化学或生物学等原理，通过将待测样本切割成小片段，并用 核酸测序技术读取、记录和分析这些片段的序列信息。
第一代测序技术
Sanger测序法
由Frederick Sanger在1977年开发，是第一代测序技术的代表。它基于二进制分子链终止法，使用放射性同 位素或荧光染料进行标记。
第二代测序技术
Illumina测序
利用bridgePCR技术，通过可控制的DNA合成和荧光校验基团，实现对DNA片段的快速高通量测序。
应用场景和优势
1 基因组学研究
高通量测序革新了基因组学研究，为解读基因组提供了更快速、更准确的方法。
2 医学诊断
它可以检测基因变异、确定疾病风险和提供个体化医疗方案。
3 生物多样性研究
通过对DNA或RNA片段的测序，可以快速鉴定物种和了解生物多样性。
高通量测序在医学中的应用
遗传病筛查
肿瘤基因组学
可以快速检测潜在的遗传病风险， 帮助家庭做出更明智的生育决策。
通过测序肿瘤细胞的DNA片段， 可以发现肿瘤突变、预测疗效、 指导个体化治疗。
药物基因组学
通过分析个体基因型，可以确定 个体对药物的反应，指导用药剂 量和选择。
未来发展趋势
未来高通量测序技术将更加快速、准确和经济。同时，与人工智能和大数据的结合，将促进高通量测序在个性 化医学和精准治疗方面的深入应用。
第三代测序技术
高通量测序技术的基本原理及其应用
高通量测序技术的基本原理及其应用高通量测序技术是一种用于分析DNA或RNA序列的先进工具。
自2005年首次商业化以来，高通量测序技术已经成为生物医学研究领域中最受欢迎的技术之一。
本文将介绍高通量测序技术的基本原理以及其在各种生物研究中的应用。
一、高通量测序的基本原理高通量测序技术通过对DNA或RNA序列进行多轮扩增和差异式回收来实现序列的读取。
这些扩增和回收过程通过从核酸库中选取并扩增特定区域的DNA或RNA序列并将这些序列与标志物添加到瓶底上的方法来实现。
在扩增过程中，DNA序列被切成小碎片，并与适配器连接。
这些适配器具有序列信息，以帮助下一阶段将它们区分开来。
然后，这些DNA片段被反复复制和放大，以产生大量的DNA片段。
这些片段被装入流式细胞仪等设备中，以便单个分子可以被读取。
在差异式回收的过程中，将标记DNA（即在扩增过程中附加的标签）与扩增的DNA片段分离。
这是通过在特定区域上捕获（将标记DNA与其匹配的DNA区域连接）完成的。
这些DNA片段然后被读取并映射到基因组或转录组上，以详细分析其序列。
二、高通量测序技术的应用高通量测序技术可以用于许多应用领域，如基因组学，转录组学，表观遗传学和元基因组学。
以下是一些例子：1.基因组学高通量测序技术被广泛用于研究基因组结构和功能。
它可以识别基因组中的单核苷酸多态性（SNP），从而对个体或种群中的基因组变异进行研究。
此外，它也可以用于构建DNA序列库，用于组装参考基因组和研究基因组进化。
2.转录组学高通量测序技术可以用于分析特定细胞中的基因表达模式和代谢途径。
这些信息可以帮助生物学家理解细胞的生长和分化，并对某些疾病的发生有所帮助。
此外，通过将RNA序列映射到基因组上，可以有效地注释基因组，并识别各种转录本和剪切变异。
3.表观遗传学高通量测序技术可以用于研究表观遗传学变异，如DNA甲基化和组蛋白修饰。
通过研究这些变异，生物学家可以了解这些变异是如何影响细胞表达模式的。
【完整】高通量测序原理资料PPT
无需建库，自动化样品制备，简单；
序（de novo sequencing） 拼接带来困难 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；
技术特色突出表现
• 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独 运行一个样品，也可以把多个样品混合在 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；
• 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降 根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，
基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号减，读取序列较短，给从头测序（de novo sequencing） 拼接带来困难 移除其他未掺入的核苷酸
低，信号衰减，读取序列较短，给从头测 Solexa 的基本原理
• 4种标记过的核苷酸
O HN
ON
PPP
O
3’
保护基团
荧光基团
掺入 检测 去保护基团 去荧光基团
O
X
5’
HN
DNA O N
O
O
3’ OH 游离3‘末端
Next cycle
A
C G
T
C
A
T
G A
T
G
C
Sequencing-by-Synthesis (SBS)
3’ 5’
T G C T A C G A T A C C C G A T C G A T
两端接上 adapters
循环扩增DNA片段成“DNA簇”
20 microns
Sequence
~1000 DNA片段per ~ 1 µm “DNA簇” ~1000 “DNA簇” per 100 µm square ~40 million clusters per experiment
序（de novo sequencing） 拼接带来困难 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；
技术特色突出表现
• 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独 运行一个样品，也可以把多个样品混合在 每张测序芯片有8 个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；
• 基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降 根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列，
基于可逆反应，随反应轮数增加，效率降低，信号减，读取序列较短，给从头测序（de novo sequencing） 拼接带来困难 移除其他未掺入的核苷酸
低，信号衰减，读取序列较短，给从头测 Solexa 的基本原理
• 4种标记过的核苷酸
O HN
ON
PPP
O
3’
保护基团
荧光基团
掺入 检测 去保护基团 去荧光基团
O
X
5’
HN
DNA O N
O
O
3’ OH 游离3‘末端
Next cycle
A
C G
T
C
A
T
G A
T
G
C
Sequencing-by-Synthesis (SBS)
3’ 5’
T G C T A C G A T A C C C G A T C G A T
两端接上 adapters
循环扩增DNA片段成“DNA簇”
20 microns
Sequence
~1000 DNA片段per ~ 1 µm “DNA簇” ~1000 “DNA簇” per 100 µm square ~40 million clusters per experiment
高通量测序技术平台流程与应用PPT课件
2020/1/6
6
2020/1/6
7
Illumina DN基因组ADN甲A随基机打断化测序流程 ↓ DNA片段的末端修复 ↓ 将 ‘A’ 碱基加入到 DNA片段的3’末端 ↓ DNA片段末端加上特别处理的甲基化接头 ↓ 重亚硫酸盐处理 ↓ 去盐处理 ation上的成簇扩增 ↓ Illumina Genome Analyzer上的测序 ↓ 生物信息学分析
2020/1/6
5
Illumina 转录组测序流程 Total RNA的DNase I 酶消化 ↓ mRNA 分离和随机打断 ↓ cDNA第一链和第二链的合成 ↓ DNA片段的末端修复 ↓ 将“A”碱基加入到DNA片段的3′末端 ↓ 在DNA片段的末端加上特定接头 ation上的成簇扩增 ↓ Illumina Genome Analyzer上的测序 ↓ 生物信息学分析
2020/1/6
8
Illumina Ch染I色P质-免s疫共e沉q淀 测序流程
↓ 目的DNA片段
↓ DNA片段的末端修复
↓ 将 ‘A’ 碱基加入到 DNA片段的3‘末端
↓ DNA片段末端加上接头
↓ PStation成簇扩增
↓ Illumina Genome Analyzer上的测序
↓ 生物信息学分析
2020/1/6
9
Illumina Meta-Genomics DNA
测序流程
Meta基因组的提取 ↓
DNA随机打断 ↓
DNA片段末端修复 ↓
将‘A’碱基加入到DNA片段的3′末端 ↓
在DNA片段的末端加上接头 ↓
纯化连接产物 ↓
P Station的成簇扩增 ↓
Illumina Genome Analyzer上的测序 ↓
高通量测序技术及实用数据分析ppt课件
第三代测序：单分子测序
不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序，第三代 分子测序，不需要进行PCR扩增。
早在2008年，HelicoBio Science 公司的Harris等在Science上报道了他们开发的 TIRM（total internal reflection microscopy）测序技术。
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Ion Torrent测序技术：
使用半导体技术将生化反应与电流强度直接联系。在聚合酶反应时，每聚合 一个碱基会释放出相应的质子，引起周围环境PH的变化，将PH变化转化为 电流的变化，最终记录电流信号，获得测序序列。读长约200bp，根据芯片 不同可以一次产生10M-20G的数据。
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物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到
实时测定DNA序列的目的。
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14
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15
Hiseq2000/Hiseq1000（HIseq2500/Hiseq1500）平台简介： 原理：基于DNA单分子簇边合成 ➢ 将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸
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7
常见的高通量测序测序平台
;.
8
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9
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10
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11
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12
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13
焦磷酸测序技术：引物与模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP
sulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引
• 每一个k-mer作为图中一个节点，两 个k-mer如果在同一read中相邻，则 形成一个边。
高通量测序技术的类型原理及应用--ppt
高通量测序技术的优点
大规模平行测序(massively parallel signature sequencing，MPSS)：它利用芯片进行测序，可以在
数百万个点上同时阅读测序，把平行处理的思想用到极 致。
成本低廉：利用高通量测序技术进行人类基因组测
序，耗资不到传统测序法的1%。
高通量测序技术的优点
第二代测序技术
原理：酶级联化学发光反应
1.首先将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并与DNA 聚 合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、 底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。
2.在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与 模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出 等摩尔数的焦磷酸。
类型及原理
目前，所说的高通量测序技术主要是指454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina公司推 出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的单分子测序技术。
第二代测序技术
2005年，454 Life Sciences 公司( 现已被Roche 公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法 的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序 技术的先河。
高通量测序技术有完美的定量功能：这是因
为样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中这种 DNA的丰度。这一点有望取代以前的基因表达芯片 技术用于基因表达的研究。
高通量测序技术的应用
大规模基因组测序 基因表达分析 非编码小分子RNA的鉴定 转录因子靶基因的筛选 DNA甲基化相关研究 其他
全基因组测序
高通量测序技术在发展初期由于读长较短，使 其在对未知基因组从头测序( denovo Sequencing) 的 应用受到限制，只能用于基因组重测序。
高通量测序技术及其在农业上的应用.ppt
3.4 外显子组测序
外显子组是指全部外显子区域的集合，该区域包含 合成蛋白质所需的重要信息，涵盖了与个体表型相关的绝 大部分功能性变异，能够直接发现与蛋白质功能变异相关 的遗传突变 。
3.5小分子RNA测序
小分子RNA是一类长约20～30个核苷酸的非编码 RNA分子，其介导的转录后基因调控是植物中的一种新型 基因调控机制。
3.1 全基因组重测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物 种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对 个体或群体进行差异性分析。全基因组重测序的 个体，通过序列比对，可以找到大量的单核苷酸 多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel， Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV ，Structure Variation) ， 通过生物信息学手 段，分析不同个体基因组间的结构差异，同时完 成注释。
Moxon等利用454－FLX法分析了番茄叶片和果实 中的小分子RNA表达情况，结果表明: 番茄miR390 和 miR1917在果实中的表达量远高于在叶片中，而且 miR1917的靶基因LeCTR1在番茄成熟过程中应答乙烯 时表达量显著下调，因此认为这2个miRNA可能参与了番 茄果实的发育过程。
• 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序 列拼接工作更加高效、准确。
Illumina Solexa简介
• 桥式PCR • 边合成边测序 • 可逆终止物
HiSeq 2000
Solexa 的特点与主要应用
• 读长较短，100－150bp • 通量高，25G每天，120-150G每Run • 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究
3.1.2 利用重测序技术鉴定突变体突变基因
临床医学技术培训PPT高通量测序与临床诊断
肿瘤基因突变背景
肿瘤的发生和发展与基因突变密切相关，不同患者的基因突变情 况各异。
高通量测序技术应用
利用高通量测序技术对肿瘤患者的基因进行突变筛查，找出与肿瘤 相关的特定基因变异。
个性化治疗指导
根据患者的基因变异情况，制定针对性的治疗方案，提高治疗效果 和患者生存率。
案例三：新生儿基因筛查预防遗传性疾病
感谢观看
高通量测序原理
边合成边测序
利用DNA聚合酶和带有荧光标记 的dNTP，在DNA合成过程中实 时检测荧光信号，实现DNA序列
的测定。
桥式PCR扩增
将DNA片段固定在芯片上，通过 桥式PCR扩增形成DNA簇，提高 测序信号的强度和准确性。
可逆终止剂
使用可逆终止剂暂停DNA链的延伸 ，以便在每次反应中只加入一个 dNTP，确保测序的准确性。
DNA质量检测
利用凝胶电泳、分光光度计等方法对提取的DNA进行质量。
利用生物信息学方法对测序数 据进行处理和分析，包括序列 比对、变异检测、基因表达分 析等。
结果解读与报告
根据分析结果，结合临床信息 ，对疾病进行诊断、预后评估
或个性化治疗建议。
04
生物信息学在高通量测序数据分 析中应用
基因变异检测及注释方法
单核苷酸变异（SNV）检测
插入/缺失（INDEL）检测
通过比对测序数据与参考基因组，识别单 个碱基的替换、插入或缺失。
对组装得到的基因组进 行基因结构预测、功能
注释等分析。
基因结构预测
识别基因组中的编码区 、非编码区以及调控元
件等。
功能注释
对预测得到的基因进行 功能描述，包括基因产 物、参与的生物学过程
等。
转录组学和蛋白质组学数据分析
肿瘤的发生和发展与基因突变密切相关，不同患者的基因突变情 况各异。
高通量测序技术应用
利用高通量测序技术对肿瘤患者的基因进行突变筛查，找出与肿瘤 相关的特定基因变异。
个性化治疗指导
根据患者的基因变异情况，制定针对性的治疗方案，提高治疗效果 和患者生存率。
案例三：新生儿基因筛查预防遗传性疾病
感谢观看
高通量测序原理
边合成边测序
利用DNA聚合酶和带有荧光标记 的dNTP，在DNA合成过程中实 时检测荧光信号，实现DNA序列
的测定。
桥式PCR扩增
将DNA片段固定在芯片上，通过 桥式PCR扩增形成DNA簇，提高 测序信号的强度和准确性。
可逆终止剂
使用可逆终止剂暂停DNA链的延伸 ，以便在每次反应中只加入一个 dNTP，确保测序的准确性。
DNA质量检测
利用凝胶电泳、分光光度计等方法对提取的DNA进行质量。
利用生物信息学方法对测序数 据进行处理和分析，包括序列 比对、变异检测、基因表达分 析等。
结果解读与报告
根据分析结果，结合临床信息 ，对疾病进行诊断、预后评估
或个性化治疗建议。
04
生物信息学在高通量测序数据分 析中应用
基因变异检测及注释方法
单核苷酸变异（SNV）检测
插入/缺失（INDEL）检测
通过比对测序数据与参考基因组，识别单 个碱基的替换、插入或缺失。
对组装得到的基因组进 行基因结构预测、功能
注释等分析。
基因结构预测
识别基因组中的编码区 、非编码区以及调控元
件等。
功能注释
对预测得到的基因进行 功能描述，包括基因产 物、参与的生物学过程
等。
转录组学和蛋白质组学数据分析
高通量基因测序技术的原理和应用
高通量基因测序技术的原理和应用一、背景介绍在现代生命科学研究中，基因测序技术是一项重要的研究手段。
过去的二十年中，基因测序技术发生了革命性的变化，从最初需要数年时间、费用高昂的Sanger测序，到如今能够高效、快速并且相对经济地完成大规模基因测序的高通量测序技术。
高通量基因测序技术已经成为了基因功能研究、疾病诊断和个性化医疗等领域中最常用和最为核心的技术之一。
二、基本原理高通量测序技术通过对大量DNA分子进行同时测序，可以完成快速而高效的序列分析工作。
高通量测序技术通常分为两大类：第一类是基于大型平台的测序技术，如Illumina、Ion Torrent、Pacific Biosciences等；第二类是基于小型平台的测序技术，如Nanopore技术。
1. 基于大型平台的高通量测序技术原理基于大型平台（如Illumina）的测序技术的核心原理是通过PCR扩增，将待测DNA分子拆分成小片段，并用荧光探针或逆转录酶将其测定。
其过程主要包括分析文库制备、片段连接、大规模PCR扩增和测序读取等。
其中，最常用的是Illumina公司的HiSeq和MiSeq系列平台，这些平台可以自动化地产生数百GB的测序数据。
2. 基于小型平台的高通量测序技术原理基于小型平台（如Nanopore）的高通量测序技术则是通过直接测序DNA分子，而不需要拆分成小片段。
它的原理是将DNA分子通过一个细小的孔洞（即纳米孔）中，利用同工酶的原理，计算其独特的电流特征来实现DNA序列测定。
此类技术通常需要更少的前期处理步骤，也能够大大缩短分析的时间。
三、应用领域高通量测序技术可以被广泛应用于各种不同的生命科学研究和临床诊断中，如下列举几个较为重要的应用领域：1. 基因组学高通量测序技术已经成为基因组学研究中最常用和最为核心的技术之一，它可以完成基因组测序工作，识别大规模遗传变异，并加速对基因组结构与功能的深入了解。
2. 疾病研究高通量测序技术可以使得疾病研究变得更加高效，并且有助于解决许多难题，例如：基因组变异与疾病的关联；致病基因的发现；疾病基因的检测和诊断等。
高通量测序技术及原理介绍ppt课件
Bustard
• Base with highest corrected intensity is called
AC
G
T
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
C
Gerald
• Filtering removes low quality base calls
GEneration of Recursive Analyses Linked by
▪ Visualize the data, reports the results
Sequencing process
1 Library prep (~ 6 hrs)
2 Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)
1-8 samples
3 Sequencing (~ 46 to 120 hrs)
1-8 samples
Fragment DNA Repair ends / Add A overhang
Ligate adapters Select ligated DNA
Hybridize to flow cell Extend hybridized oligos Perform bridge amplification
Solexa
Flow cell in GAIIx
Image re-analysis pipleline
Instrument PC
Images (.tif) Lane 1..8
Cycle 1..36
Tile_Cycle_Image_a, Tile_Cycle_Image_c, Tile_Cycle_Image_g, Tile_Cycle_Image_t
高通量测序技术的类型原理及应用-ppt
纳米孔测序原理
概述
纳米孔测序技术利用电 场驱动DNA通过纳米孔， 通过检测电流变化来判 断DNA序列。
原理
DNA通过纳米孔时，不 同碱基对产生的电学信 号不同，根据信号差异 进行测序。
特点
单分子测序、实时检测、 便携式，适用于单分子 水平的基因组测序和变 异检测。
合成测序原理
概述
合成测序技术是通过连续添加碱基并检测产物来推断DNA 序列的技术。
特点
高通量测序技术具有高速度、高 准确性、高灵敏度、高通量和高 信息量等特点，能够快速获取大 量基因组序列信息。
高通量测序技术的发展历程
1977年
01
1986年
02
03
1990年
Sanger等提出DNA测序方法， 即双脱氧终止法，奠定了DNA测 序的基础。
Maxam和Gilbert提出另一种测 序方法，即化学降解法。
微生物多样性研究
高通量测序技术可以测定微生物群落的基因组序列，有助于研究微 生物多样性和生态学。
农业与动植物研究
作物育种与改良
高通量测序技术可以测定作物的基因组序列，为 作物育种和改良提供技术支持。
动物遗传资源保护
高通量测序技术可以检测动物的遗传变异，有助 于动物遗传资源的保护和评估。
生态学与进化研究
原理
合成过程中加入不同碱基的类似物，通过检测产物中特定 碱基的量来确定DNA序列。
特点
高精度、高分辨率、低成本，适用于基因组测序和SNP检 测。
光学图谱测序原理
概述
光学图谱测序技术利用光学显微镜和 分子标记技术对DNA进行定位和测
序。
原理
在DNA分子上标记荧光染料或量子 点等光学标记，通过光学显微镜观察
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学和生物医学研究领域带来革命性的变革。
复旦大学
复旦大学
谢
谢！
复旦大学
其他
复旦大学
全基因组测序
高通量测序技术在发展初期由于读长较短，
使其在对未知基因组从头测序( denovo
Sequencing) 的应用受到限制，只能用于基因组
重测序。
基因组重测序是指对已知基因组序列的物种进
行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体
或群体进行差异性分析。
复旦大学
高通量RNA测序及其在转录组 和基因表达调控上的应用
复旦大学
该技术的原理：
1.通过ChIP技术利用抗体特异性地富集交联的目 的蛋白-DNA复合体；
2.将得到的DNA片段进行高通量测序；
3.将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组
上，从而获得全基因组范围内与组蛋白或转录因
子等互作的DNA 区段信息。
复旦大学
基因组DNA 甲基化分析
DNA甲基化在维持细胞正常功能、遗传印记和
复旦大学
单分子测序技术
Ion PGM测序技术 原理
基于半导体芯片技术，在半导体芯片的微 孔中固定DNA链，随后依次掺入ACGT，随着 每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过 每个孔底部时能被检测到。
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单分子测序技术
主要优点：
大大节省了成本和时间
主要缺点：
测序仪的价格昂贵
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基化和高密度的CpG 更加敏感，而MDB-Seq 对 高度甲基化和中等密度的CpG 更加敏感； BS-Seq不经过富集直接测序。
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存在的问题
测序速度提高了，但后续的海量测序数据的分析 却成为一大难题。 不适合小规模测序。 新一代测序仪价格昂贵。
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Hiseq 2000高通量测序仪
solexa高通量测序仪
亚硫酸氢盐测序( bisulfite-sequencing，BS-Seq)。
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MeDIP-Seq和MBD-Seq首先通过特异性结合 甲基化DNA的MBD2b 或5‘-甲基胞嘧啶抗体富集 高甲基化的DNA，然后再对富集到的片段测序； MeDIP-Seq 和MBD-Seq 都是基于富集的原
理，二者是相辅相成的。MeDIP-Seq 对高度甲
末端终止子；
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3.洗涤、成像，切开荧光染料和抑制基团； 4.洗涤、加帽，允许下一个核苷酸的掺入； 5.这样通过掺入、检测和切除的反复循环，即 可实时读取大量序列。
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单分子测序技术
单分子实时技术(SMRT)
该技术利用单分子技术和DNA聚合酶，在聚
合反应的同时就可以读取测产物。
SMRT测序技术在测序速度、读长和成本方面 有着巨大的优势和潜力。
最近科学家们将高通量测序技术应用于转录组 分析开发出了RNA测序技术(RNA-Seq) ，该技术能 够在全基因组范围内检测基因表达情况，进行差异 基因筛选分析。
由于RNA-Seq技术具有通量高、可重复性高、
检测范围宽、定量准等特点，已经广泛应用于细菌、
拟南芥、水稻和人类等生物转录组的研究。
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转录组研究是从整体水平研究基因功能以及基
染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP) 技术是研究体内蛋白质与 DNA 之间相互作用的强有力工具，在转录因 子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究 中被广泛应用。
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染色质免疫共沉淀测序(chromatin immune
precipitation sequencing，ChIP-Seq) 技术充 分结合了ChIP和高通量测序技术的优势，能 够在全基因组范围内高效地研究目的蛋白的 结合位点。
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第二代测序技术
Illumina公司目前拥有三种测序平台，分别 为HiSeq 2000、HiSeq 1000、Genome Analyzer IIx (/ )； ABI 公司则主要是SOLiD 3 和SOLiD 4 两个 测序平台。 从通量这个最直观的数字看来，HiSeq 2000 领先于SOLiD 4。 HiSeq 2000 测序平台单次反应 可以读取200G的数据，而SOLiD 4 仅为100G 左 右。
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单分子测序技术
在第二代测序平台不断完善和广泛应用的 同时，以对单分子DNA进行非PCR测序 为主要特征的更新的测序技术也初显端倪。 2008年4月Helico BioScience公司的Harris 等在Science上报道了他们开发的基于全内 反射显微镜(total Internal reflection microscopy,TIRM) 的测序技术—单分子测 序技术。
高通量测序技术的优点
高通量测序技术有完美的定量功能：这是
因为样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中
这种DNA的丰度。这一点有望取代以前的基因表
达芯片技术用于基因表达的研究。
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高通量测序技术的应用
大规模基因组测序 基因表达分析 非编码小分子RNA的鉴定 转录因子靶基因的筛选 DNA甲基化相关研究
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高通量测序技术的优点
大规模平行测序(massively parallel signature sequencing，MPSS)：它利用芯片进行测序，可
以在数百万个点上同时阅读测序，把平行处理的思 想用到极致。
成本低廉：利用高通量测序技术进行人类基因
组测序，耗资不到传统测序法的1%。
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因结构。但是，多数研究人员感兴趣的是某一特
定的生物过程、发育阶段或处理后的基因表达情
况。
建立在高通量测序基础上的数字化基因表达
谱(digital gene expression profiling)分析无需预先针
对已知序列设计探针，即可对任何生物整体转录
活动进行检测，因此应用范围更加广泛。
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高通量RNA 测序技术另一个广泛应用的领域 是小RNA 的研究。 小RNA在植物的生长、发育和外界胁迫应答等
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就测序读长来说，454 测序平台读长最长， 目前已经达到400nt。因此，454 平台比较适合对 未知基因组从头测序，但是在判断连续单碱基重 复区时准确度不高。 Solexa 测序读长较454 短，仅为100nt 左右， 但测序通量高、价位低，适合基因组重测序等。 SOLiD 读长也较短，但测序精度较高，特 别适合SNP 检测等。
细致全貌的分析成为可能。
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类型及原理
目前，所说的高通量测序技术主要是指 454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina 公司推出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的单
分子测序技术。
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第二代测序技术
2005年，454 Life Sciences 公司( 现已被 Roche公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷 酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了 第二代测序技术的先河。
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第二代测序技术
原理：酶级联化学发光反应
1.首先将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并与 DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺
即生成新DNA 互补链时，要么加入的 dNTP 通过酶促级联反应催化底物激发出荧光， 要么直接加入被荧光标记的dNTP 或半简并引物， 在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。 通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得 互补链序列信息。
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第二代测序技术
优点：
操作极为简便：无需进行电泳； 可以在芯片上进行高通量分析； 大大节省了成本和时间。
件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数
目成正比。
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第二代测序技术
此后，Illumina 公司和ABI 公司相继推出 了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)测序技术。
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第二代测序技术
原理：与焦磷酸测序法的类似，核心思想
都是边合成边测序(sequencing by synthesis)。
苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同
孵育。 2.在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该
dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物
链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。
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第二代测序技术
原理：酶级联化学发光反应
3.焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP 就会促使氧
合荧光素的合成并释放可见光，CCD 检测后通过软
方面具有重要功能。
但由于小RNA序列短、同源性高，因此利用基
因芯片检测小RNA非常困难。
高通量测序技术不但能够克服这一难题，而且
能够发现新的小RNA。目前，高通量测序技术已经
成功的应用于拟南芥、水稻和小麦等生物小RNA的
研究。
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ChIP-Seq 技术及其在DNA和 蛋白质相互作用研究中的应用
单分子测序技术
目前Helico BioScience公司的HeliScope测序 仪售价近百万美元，这是一般实验室和科研单位 所不能承受的。 Life Techologies公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGMTM) 测序仪价格仅为普通 测序仪的1/10，而且研究人员能够在2h内获取从 10Mb到1Gb以上高精确度序列。
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单分子测序技术
基于全内反射显微镜(total Internal reflection microscopy, TIRM) 的测序技术原理：
1.将待测DNA样品随机打断成小片段，在每个小片
段的末端加上poly-dA；
2.将小片段DNA模板与固定在检测芯片上的poly-dT
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谢
谢！
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其他
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全基因组测序
高通量测序技术在发展初期由于读长较短，
使其在对未知基因组从头测序( denovo
Sequencing) 的应用受到限制，只能用于基因组
重测序。
基因组重测序是指对已知基因组序列的物种进
行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体
或群体进行差异性分析。
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高通量RNA测序及其在转录组 和基因表达调控上的应用
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该技术的原理：
1.通过ChIP技术利用抗体特异性地富集交联的目 的蛋白-DNA复合体；
2.将得到的DNA片段进行高通量测序；
3.将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组
上，从而获得全基因组范围内与组蛋白或转录因
子等互作的DNA 区段信息。
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基因组DNA 甲基化分析
DNA甲基化在维持细胞正常功能、遗传印记和
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单分子测序技术
Ion PGM测序技术 原理
基于半导体芯片技术，在半导体芯片的微 孔中固定DNA链，随后依次掺入ACGT，随着 每个碱基的掺入，释放出氢离子，在它们穿过 每个孔底部时能被检测到。
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单分子测序技术
主要优点：
大大节省了成本和时间
主要缺点：
测序仪的价格昂贵
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基化和高密度的CpG 更加敏感，而MDB-Seq 对 高度甲基化和中等密度的CpG 更加敏感； BS-Seq不经过富集直接测序。
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存在的问题
测序速度提高了，但后续的海量测序数据的分析 却成为一大难题。 不适合小规模测序。 新一代测序仪价格昂贵。
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Hiseq 2000高通量测序仪
solexa高通量测序仪
亚硫酸氢盐测序( bisulfite-sequencing，BS-Seq)。
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MeDIP-Seq和MBD-Seq首先通过特异性结合 甲基化DNA的MBD2b 或5‘-甲基胞嘧啶抗体富集 高甲基化的DNA，然后再对富集到的片段测序； MeDIP-Seq 和MBD-Seq 都是基于富集的原
理，二者是相辅相成的。MeDIP-Seq 对高度甲
末端终止子；
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3.洗涤、成像，切开荧光染料和抑制基团； 4.洗涤、加帽，允许下一个核苷酸的掺入； 5.这样通过掺入、检测和切除的反复循环，即 可实时读取大量序列。
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单分子测序技术
单分子实时技术(SMRT)
该技术利用单分子技术和DNA聚合酶，在聚
合反应的同时就可以读取测产物。
SMRT测序技术在测序速度、读长和成本方面 有着巨大的优势和潜力。
最近科学家们将高通量测序技术应用于转录组 分析开发出了RNA测序技术(RNA-Seq) ，该技术能 够在全基因组范围内检测基因表达情况，进行差异 基因筛选分析。
由于RNA-Seq技术具有通量高、可重复性高、
检测范围宽、定量准等特点，已经广泛应用于细菌、
拟南芥、水稻和人类等生物转录组的研究。
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转录组研究是从整体水平研究基因功能以及基
染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP) 技术是研究体内蛋白质与 DNA 之间相互作用的强有力工具，在转录因 子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究 中被广泛应用。
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染色质免疫共沉淀测序(chromatin immune
precipitation sequencing，ChIP-Seq) 技术充 分结合了ChIP和高通量测序技术的优势，能 够在全基因组范围内高效地研究目的蛋白的 结合位点。
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第二代测序技术
Illumina公司目前拥有三种测序平台，分别 为HiSeq 2000、HiSeq 1000、Genome Analyzer IIx (/ )； ABI 公司则主要是SOLiD 3 和SOLiD 4 两个 测序平台。 从通量这个最直观的数字看来，HiSeq 2000 领先于SOLiD 4。 HiSeq 2000 测序平台单次反应 可以读取200G的数据，而SOLiD 4 仅为100G 左 右。
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单分子测序技术
在第二代测序平台不断完善和广泛应用的 同时，以对单分子DNA进行非PCR测序 为主要特征的更新的测序技术也初显端倪。 2008年4月Helico BioScience公司的Harris 等在Science上报道了他们开发的基于全内 反射显微镜(total Internal reflection microscopy,TIRM) 的测序技术—单分子测 序技术。
高通量测序技术的优点
高通量测序技术有完美的定量功能：这是
因为样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中
这种DNA的丰度。这一点有望取代以前的基因表
达芯片技术用于基因表达的研究。
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高通量测序技术的应用
大规模基因组测序 基因表达分析 非编码小分子RNA的鉴定 转录因子靶基因的筛选 DNA甲基化相关研究
复旦大学
高通量测序技术的优点
大规模平行测序(massively parallel signature sequencing，MPSS)：它利用芯片进行测序，可
以在数百万个点上同时阅读测序，把平行处理的思 想用到极致。
成本低廉：利用高通量测序技术进行人类基因
组测序，耗资不到传统测序法的1%。
复旦大学
因结构。但是，多数研究人员感兴趣的是某一特
定的生物过程、发育阶段或处理后的基因表达情
况。
建立在高通量测序基础上的数字化基因表达
谱(digital gene expression profiling)分析无需预先针
对已知序列设计探针，即可对任何生物整体转录
活动进行检测，因此应用范围更加广泛。
复旦大学
高通量RNA 测序技术另一个广泛应用的领域 是小RNA 的研究。 小RNA在植物的生长、发育和外界胁迫应答等
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就测序读长来说，454 测序平台读长最长， 目前已经达到400nt。因此，454 平台比较适合对 未知基因组从头测序，但是在判断连续单碱基重 复区时准确度不高。 Solexa 测序读长较454 短，仅为100nt 左右， 但测序通量高、价位低，适合基因组重测序等。 SOLiD 读长也较短，但测序精度较高，特 别适合SNP 检测等。
细致全貌的分析成为可能。
复旦大学
类型及原理
目前，所说的高通量测序技术主要是指 454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina 公司推出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的单
分子测序技术。
复旦大学
第二代测序技术
2005年，454 Life Sciences 公司( 现已被 Roche公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷 酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了 第二代测序技术的先河。
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第二代测序技术
原理：酶级联化学发光反应
1.首先将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并与 DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺
即生成新DNA 互补链时，要么加入的 dNTP 通过酶促级联反应催化底物激发出荧光， 要么直接加入被荧光标记的dNTP 或半简并引物， 在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。 通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得 互补链序列信息。
复旦大学
第二代测序技术
优点：
操作极为简便：无需进行电泳； 可以在芯片上进行高通量分析； 大大节省了成本和时间。
件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数
目成正比。
复旦大学
第二代测序技术
此后，Illumina 公司和ABI 公司相继推出 了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)测序技术。
复旦大学
第二代测序技术
原理：与焦磷酸测序法的类似，核心思想
都是边合成边测序(sequencing by synthesis)。
苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同
孵育。 2.在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该
dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物
链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。
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第二代测序技术
原理：酶级联化学发光反应
3.焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP 就会促使氧
合荧光素的合成并释放可见光，CCD 检测后通过软
方面具有重要功能。
但由于小RNA序列短、同源性高，因此利用基
因芯片检测小RNA非常困难。
高通量测序技术不但能够克服这一难题，而且
能够发现新的小RNA。目前，高通量测序技术已经
成功的应用于拟南芥、水稻和小麦等生物小RNA的
研究。
复旦大学
ChIP-Seq 技术及其在DNA和 蛋白质相互作用研究中的应用
单分子测序技术
目前Helico BioScience公司的HeliScope测序 仪售价近百万美元，这是一般实验室和科研单位 所不能承受的。 Life Techologies公司推出的Ion Personal Genome Machine (PGMTM) 测序仪价格仅为普通 测序仪的1/10，而且研究人员能够在2h内获取从 10Mb到1Gb以上高精确度序列。
复旦大学
单分子测序技术
基于全内反射显微镜(total Internal reflection microscopy, TIRM) 的测序技术原理：
1.将待测DNA样品随机打断成小片段，在每个小片
段的末端加上poly-dA；
2.将小片段DNA模板与固定在检测芯片上的poly-dT