高分辨率溶解曲线HRM突变筛查和基因分型系统
高分辨熔解曲线
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
高分辨率溶解曲线简介资料
高分辨率溶解曲线简介(2011-09-01 11:30:50)转载▼标签：杂谈高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting ），简称 HRM ，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。
一、HRM技术的基本原理：HRM 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。
不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。
以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。
而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。
图一： A ：纯合子样品 B ：杂合子样品如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。
这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。
如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。
下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。
以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。
高分辨率溶解曲线HRM突变筛查与基因分型系统课件
Small Amplicon Genotyping 扩增小片段直接进行基因型鉴定
•使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(~61℃) ,高 温内标Tm (~92 ℃) •内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。
•PCR片段的Tm值范围： 70-88 ℃
•优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已知突变位点进行 基因分型
为何要使用温度内标
A>T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线h Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用
— 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping）
—小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
软件自动基因分型，PCR产物不需要处理
谢谢！
HRM – Lunaprobe genotyping
HRM – Lunaprobe genotyping
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
HRM技术
最新SNP检测方法！无与伦比！！SNP, 无与伦比, 检测高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HR）技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR 技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler® 480和Rotor-Gene 6000）和饱和染料（LC Green、Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用1.SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
2.基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
3.新突变的筛查。
4.甲基化的筛查。
5.遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
6.HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
7.法医学鉴定、亲子鉴定。
8.动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM特点高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
hrm高分辨率溶解曲线实验流程
hrm高分辨率溶解曲线实验流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法—HRM 技术应用
高通量、低本钞票SNP、突变或甲基化检测方法—HRM技术应用HRM介绍HRM技术是high-resolutionmeltinganalysis即高分辨熔解曲曲折折曲曲折折折折线分析技术，是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直截了当运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用本钞票低，结果正确，实现了真正的闭管操作，HR M技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的要紧原理是依据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲曲折折曲曲折折折折线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度到达对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪〔L ightCycler®480和Rotor-Gene6000〕和饱和染料〔LCGreen、EvaGreen等〕的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用• SNP〔单核苷酸多态性〕的筛查。
•基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
•新突变的筛查。
•甲基化的筛查。
•遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
• HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
•法医学鉴定、亲子鉴定。
•动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM特点•高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
•高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序〞的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
•特异性好：PCR产物无需后续处理，特异性高达100%。
HRM技术发展和应用
HRM技术发展和应用作者：马自俭来源：《畜牧兽医科学》 2018年第3期摘要：高分辨率溶解曲线技术( HRM)是将饱和荧光染料，荧光探针和实时荧光定量PCR技术的优点进行整合而产生的一种用于检测基因突变位点和进行基因分型的新技术。
高分辨率溶解曲线技术以其成本低，通量高，简便快捷，高灵敏度和高特异性著称。
本文主要介绍HRM技术的研究进展和应用，以期为应用该技术的爱好者做理论参考。
关键词：高分辨率溶解曲线技术(HRM)；原理；发展中图分类号：Q754 文献标识码：B doi：10. 3969/j. issn. 2096-3637. 2018. 03.0251HRM的发展史HRM技术是近几年来新兴起的一种用于检测单核苷酸多态性的诊断技术。
HRM检测技术除了具有高通量、低成本、灵敏性和特异性高之外，真正实现了闭管操作，因此，HRM检测技术深受国内外科研人员的关注并得到广泛的应用。
已经商品化的用于HRM检测的仪器是LightScanner，它是由美国Idaho公司生产的专门用于单核苷酸多态性位点的检测的仪器，可以在5min的时间里检测96或者384个样品进行突变位点的检测。
此外，市场上其他公司的荧光定量PCR仪器也可以完成对突变位点的检测，如伯乐公司和罗氏公司生产的荧光定量PCR仪可以完成对反应产物的突变位点的检测和基因分型。
目前，常用的应用于基因分型的比较准确的方法之一是探针法，但是探针的合成成本比较高，因此，其临床应用也受到极大的限制。
而本文所介绍的HRM技术不会受到碱基的位点或者碱基的类型限制，也不需要合成价格较高的探针，只需要在反应结束后对反应产物进行一步溶解，再用仪器对溶解曲线进行分析，完成基因分型和突变位点的扫描。
2高分辨率溶解曲线技术的原理高分辨率溶解曲线技术的原理非常简单，就是在PCR扩增结束后，另设置一个解链的步骤。
在温度逐渐上升的阶段，DNA双链由于受到热力作用，碱基之间的氢键会逐步打开，在碱基双链解开到一半的时候，会产生一个解链加剧的点，这个关键点的温度就是DNA双链的Tm温度，在DNA双链逐渐打开的过程叫做溶解。
基于熔解曲线分析技术的鹿茸药材分子鉴别
基于熔解曲线分析技术的鹿茸药材分子鉴别高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）是一种主要用于基因分型和突变扫描的分子诊断技术，在中药真伪鉴定中有着广泛应用前景。
文章将高分辨率熔解曲线技术应用于鹿茸真伪鉴别，利用COⅠ序列，在退火温度为60 ℃，45个循环数的条件下，建立正品鹿茸药材熔解曲线模型，并筛选确定其DNA模板浓度、引物浓度、Mg2+浓度的适宜范围。
结果表明，鹿茸药材在模板DNA质量浓度为10～100 mg·L-1、引物浓度0.2 μmol·L-1，Mg2+浓度 2.0 mmol·L-1的条件下，梅花鹿熔解曲线为双峰，其Tm分别为（81.96±0.07），（84.51±0.03）℃;马鹿熔解曲线为双峰，其Tm为（82.58±0.13），（85.95±0.05）℃。
该方法可以实现简单、快速、高通量、可视化的鹿茸药材真伪鉴定。
标签：高分辨熔解曲线;鹿茸药材;分子鉴定Molecular identification of hairy antler by analysis of high resolution meltingCHEN Kang1，2，JIANG Chao1，YUAN Yuan1*，HUANG Lu-qi1，JIN Yan1（1. State Key Laboratory of Dao-di Herbs，National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2. Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230038，China）[Abstract]High resolution melting （HRM），an important technology for genotyping and mutation scanning，has broad prospects in the authenticity of traditional Chinese medicine. This paper selected universal COⅠprimers and used HRM to establish a new method for authenticity of Hairy Antler. PCR was conducted at the annealing temperature of 60 ℃and 45 cycles. The range of the DNA template concentration，the primer concentration and the Mg2+ ion concentration were further optimized. The results showed that the Tm values of Cervus nippon were （81.96±0.07），（84.51±0.03）℃and Cervus elaphus was（82.58±0.13），（85.95±0.05）℃with 10-100 mg·L-1 DNA template，0.2 μmol·L-1 primer，2.0 mmol·L-1 Mg2+. This method can authenticate of hairy antler and is simple，fast，high-throughput，visualization.[Key words]high resolution melting; hairy antler; molecular identificationdoi：10.4268/cjcmm20150409鹿茸始载于《神农本草经》，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的功效，能够提高机体工作能力、减轻疲劳，改善睡眠、饮食及蛋白质代谢障碍，增加肾脏利尿功能[1]。
高分辨溶解曲线突变检测
高分辨熔解曲线突变检测高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。
该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。
HRM原理HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。
在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。
不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。
因此不能用于熔解曲线的检测。
而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。
HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用HRM应用：•检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁•鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变•基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失•特定突变、多态性位点的筛选•外显子和短扩增子基因型扫描HRM特点：•灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。
如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。
高分辨率溶解曲线HRM1
?突变扫描
? 目前应用HRM进行突变扫描的基因有：Ckit、乙酰辅酶A脱酶的中链、原肉毒碱缺乏 症、RET、表皮生长因子受体EGFR、K— ras、苯丙氨酸羟化酶、p53、HER2、囊肿 性纤维化基因的几个外显子等等．
? 甲基化分析
? HRM分析还为DNA甲基化状态的检测另辟 蹊径。DNA样品通过亚硫酸氢盐的处理， 将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶。这样， 原先未甲基化模板所产生的PCR产物比甲 基化模板的Tm要低。
Nucleic Acids Research,2009,Vol.37,No.12
? 序列配对
? 有些研究并不需要完全的基因型。而只需知道 DNA序列是否匹配，例如：组织移植、基因 型．表型的相关性和辩证性．在活器官移植中。 需要对HLA进行基因分型．这个主要牵涉到 HLAA，B，C和DR等几个位点．当两个个体的熔解 曲线完全相同时就说明 HLA基因型完全匹配．
? 2、饱和染料：为什么要饱和染料呢？因为饱和染料饱和 了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发 生重排，荧光信号能准确的反映DNA的解链。这样熔解曲 线才有了更高的分辨率。
HRM在分子诊断中的应用
? 基因分型 ? 突变扫描 ? 甲基化分析 ? 序列配对
? 基因分型
? 传统的基因分型方法或者耗时费力，或者需要购 买价格不菲的探针。 HRM分析无需制备探针；有 了饱和染料， PCR产物全程被标记，因此所有的 熔解区域都能检测到。对于同一扩增子内的不同 杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。
HRM
_____一种用于突变扫描和基因分型的遗传学分析方法
? 高分辨率熔解曲线 (high resolution melting) 是在 实时荧光 PCR基础上发展起来的一种新的实时定 量新技术。
HRM应用实验设计及结果分析
HRM分析过程
原始曲线 随着DNA熔解，插入 DNA双链中的染料被 释放，荧光信号骤降
对PCR的扩增子进行加热，温度 从50℃逐渐上升到95℃。扩增子逐 渐解链，到达熔解温度（Tm）时， DNA双链完全分开。
初期，荧光强度很高，随着温度 升高，双链DNA逐渐减少，荧光强 度下降。通过检测器，记录荧光变 化的过程。对数据作图，就生成了 熔解曲线 。
三、反应体系
Component Diluent (Mol. Biol. Grade water) PCR Buffer MgCl2 dNTPs Forward primer Reverse primer SYTO®9 EvaGreen Taq DNA polymerase DNA Template Concentration 1X 1.5 mM 0.2 mM 300 nM 300 nM 1.5 µM 1-2X 1.25 U 3 x 109 copies/µL
扩增子的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。只要一个碱基发生了突 变，就会改变DNA链的解链温度。 解链温度差异极小，零点几摄氏度，使用高分辨率的仪器才可以检测。
孔间温度差异（温度均一性：Tm的标准偏差为0.020-0.264℃），孔间温度均一性要达到 0.264 ℃以内才能保证HRM分析结果的准确性。大多数Real Time PCR仪的孔间温度差在 0.3-0.5℃，决定了无法胜任HRM 熔解速率（最低要求：0.1℃/秒） 数据密度（最低要求：10个数据点/℃）
导数图 “速率”曲线的最高 峰是分离速率最大的 点，即等于熔解温度
HRM应用主要基于两种技术的 进步：
• •
双链DNA嵌入型饱和荧光染料如 LC Green 具有精确控温装置和高密度数据 采集的仪器
高分辨溶解(HRM)分析
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 基因的突变扫描： 前后重复、杂合子缺失。 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
高分辨溶解（ 第二课 高分辨溶解（HRM）分析 ）
hnxide@
高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
HRM实验指导
高分辨熔解曲线分析技术高分辨熔解曲线分析技术，high resolution melting，简称HRM，是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。
HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：PCR检测用到的罗氏的LightCycler® 480 Control Kit和High Resolution Melting Master等。
High Resolution Melting Master中含有2× Master Mix(包含热启动Taq DNA Polymerase反应缓冲液，dNTP mix，高分辨率染料),25mM MgCl2，PCR级别的H2O，用于调整反应的最终体系。
本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、QSP 盒装吸头、冰盒，罗氏的LightCycler® 480，还有常规的离心机、水浴锅等。
HRM 体系配制实验中用到的HRM试剂盒需要对MgCl2溶液进行最近的浓度确认，以一管DNA样品为例展开实验。
先加入1号管的2× Master Mix 165μl，再加入9号管的primer mix 33μl，最后加8号管的mutation突变体33μl，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。
高分辨率溶解曲线和TEAL-TIME PCR
目前，有不少人把高分辨率熔解曲线(HRM)和Real-time的熔解曲线混为一谈，只要一听到熔解曲线4个字就和荧光定量联系在一起了，再加上现在市面上有些仪器兼具荧光定量和HRM的功能，使一些同行更加迷惑。
今天去给大家讲一下两者之间的区别。
（一）.两者的原理HRM：不同核酸分子的片段长短、GC 含量、GC 分布等是不同的，因此任何双链DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。
Real-time：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
（二）.两者的采集过程HRM：高分辨率熔解曲线（HRM）是在PCR反应之后，对PCR产物进行升温变性，采集荧光信号的变化，绘制成不同形状的曲线。
Real-time：是在PCR过程中采集荧光信号。
（三）.两者的应用HRM：筛查未知突变和针对已知位点进行基因分型。
基因分型的方法为非标记探针法和小片段法。
Real-time：定量及基因分型。
基因分型的方法是：Taqman探针，水解探针等。
（四）.基因分型方法的费用HRM基因分型方法的费用远低于Taqman探针和水解探针。
（五）.两者所用的染料HRM：LC Green饱和染料，能与DNA双链的碱基紧密结合，不抑制PCR反应，在PCR反应过程中是过饱和的状态。
Real-time：SYBR Green不饱和染料，不能与DNA双链的碱基紧密结合，浓度高时会抑制PCR反应，只能少量加入。
广州誉维生物科技仪器有限公司上传。
检测AKT1基因E17K突变的高分辨率熔解曲线法HRM
非小细胞肺癌的基因组ＤＮＡ样本经ＰＣＲ扩增 后，取１０ ＩｘＬ ＰＣＲ扩增产物，加入ｌ ｔｚＬＣｇｒｅｅｎ荧光染 料，１“Ｌ １０ Ｉｘｍｏｌ检测探针。加１５斗Ｌ矿物油。短 暂离心后将样品置高分辨率溶解曲线仪内分析 （Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＨＲ—１），样品温度和荧光强度转 换为１６位的数字信号，理想的分辨率分别为０．００２ ℃和０．００２％。每摄氏度扫描约５０个点，样品升温 速度为０．３。Ｃ／ｓ，在６５．０—７３．０扫描得到探针的熔 解曲线。荧光强度通过在扫描前后定义基线来设 定荧光强度０—１００％。每个样品在温度扫描点得 到的荧光值按照荧光强度Ｏ一１００％计算。
对筛选单碱基突变来说有一系列的方法。包 括：ＰＣＲ—ＲＦＬＰ（限制性酶切片段长度多态性），等位 基冈竞争性抑制ＰＣＲ，以及“Ｔａｑｍａｎ”法基因分型。 每种方法有其独特的优点或不足。这些方法的不 足之处在于它们只能检测特定的突变（竞争性抑 制，Ｔａｑｍａｎ）或需要ＰＣＲ后处理产物（ＰＣＲ—ＲＦＬＰ， 竞争性抑制）或者相对昂贵的探针用于显示结果 （Ｔａｑｍａｎ）。而ＨＲＭ能检测扩增子中存在的任何序 列变化。因此，该方法既可以检测特定突变位点， 也可以筛查整个扩增序列的变化。而且，使用荧光 嵌入性染料使ＨＲＭ反应可以在反应管内完成，省 去了ＰＣＲ后处理的步骤。
高分辨率熔解曲线分析:一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术
高分辨率熔解曲线分析：一种新的用于遗传病基因突变筛查的技术李东至【摘要】@@ 目前,DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性(single nucleotide polymorplaism,SNP)的检测方法有2种:一是针对特定的位点合成序列特异性探针,如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等,用于检测已知突变;二是以核酸的物理性质为基础的检测方法,如变性一高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等,此类方法可用作突变筛查,但无法明确突变性质.【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》【年(卷),期】2011(003)002【总页数】3页(P1-3)【作者】李东至【作者单位】广州市妇女儿童医疗中心,产前诊断中心,广东,广州,510623【正文语种】中文目前，DNA碱基变异如突变或单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测方法有2种：一是针对特定的位点合成序列特异性探针，如Taqman探针法、位点特异寡核苷酸分析、反向斑点杂交及基因芯片等，用于检测已知突变；二是以核酸的物理性质为基础的检测方法，如变性-高效液相层析、单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳及构象敏感凝胶电泳等，此类方法可用作突变筛查，但无法明确突变性质。
这2种方法在应用上有其局限性，如成本高、操作繁琐、耗时、以及相对低通量。
DNA测序是突变／SNP检测的金标准，但不适于大规模突变筛查和流行病学研究。
2002年犹他大学和爱德华科技公司合作开发出突变／SNP检测分析的一项新技术—高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting，HRM）［1］。
这种技术不受突变碱基位点与类型的限制，可同时对扩增片段进行未知突变扫描和已知突变的基因分型。
因其操作简便、快速、高通量、低成本和真正实现了闭管操作而受到普遍的关注，成为近年来兴起的一种高通量突变扫描和基因分型技术。
高分辨率熔解曲线
高分辨率熔解曲线（HRM）技术的应用举例HRM应用举例1 突变筛查HRM的特点是高灵敏度和高特异性，检测灵敏度可以达到1%-0.1%，既能检测出已知突变，也能检测出未知突变。
在大量样本、多个突变位点的筛查上，比传统的非均一性方法（如dHPLC）更方便、性价比更高，因为后者需要将扩增产物转移到另一台仪器上进行突变分析（表1）。
表1、突变检测方法的比较研究方法优点缺点直接测序法突变检测金标准，能发现已知和未知突变位点每个位点均需要经PCR扩增，然后测序，成本较高，工作量大，周期特别长，价格昂贵，不适合大样本、少位点的样本检测，容易交叉污染。
Taqman探针法适合已知突变位点、位点数量少、通量高的检测价格昂贵（探针合成费用高），不能同时发现未知突变位点普通PCR方法技术简便，价格便宜，仅适用已知SNP判断，不能确定何种突变，适宜少量样本检测费时费力，速度较慢，灵敏度差；RFLP仅能检测有酶切位点的片断，无酶切位点不能检测；上述方法都需要凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，使结果出现偏差。
SSCP、DGGE花费时间长、稳定性差、灵敏度有限，难以大规模开展工作。
芯片技术与传统的仪器检测方法相比具有高通量、微型化、自动化、防污染等特点仅适用于全基因组扫描，不适宜单个或少数基因的突变位点检测，精度低，价格昂贵。
Illumina技术这种方案可以帮助研究人员在得益于起始样品量要求很低优点的同时，还能够检测多个感兴趣的区域，从而检出罕见的基因突变。
高通量检测，在全基因组上扫描分析上有优势，价格昂贵。
MALDI-TOF MS 质谱技术检测速度快，理论上能分开单个碱基变化这种纯物理检测易受到样本因素的多种干扰，如盐离子含量等，适宜于已经优化的特定突变检测，不适宜该服务商未做过或很少做过的新突变检测。
检测过程需要多点质控，否则精确度很低。
另外，很重要的一点是过程复杂：PCR+电泳+割胶+纯化等，最后才是质谱监测，PCR需要自己做，并不便宜。
应用高分辨熔解曲线技术检测苯丙酮尿症PAH基因突变
应用高分辨熔解曲线技术检测苯丙酮尿症PAH基因突变摘要：目的建立操作简便、快速、成本低、结果准确的鉴定PAH基因外显子突变的基因诊断方法。
方法应用高分辨熔解曲线（High Resolution Melting，HRM）技术，对山西省已经临床确诊的85例PKU患儿进行外显子突变进行检测，并将检测结果进行测序验证。
结果在受检的山西省患儿中，PAH基因外显子突变位点HRM技术检测结果和测序结果完全相符。
结论高分辨熔解曲线技术操作简便，快速，使用成本低，结果准确，可作为PAH基因外显子突变的快速灵敏检测方法。
关键词：苯丙酮尿症；外显子；高分辨熔解曲线（HRM）技术；突变热点；基因诊断【Abstract】Objective Establish a simple，rapid，inexpensive and sensitive methodfor detection of the hot mutation region in exon of the gene for PAH.Method HRM technology was used to detect mutation in exon in 85 classical type PKU patients and the mutations in all samples were validated by direct sequencing.Results The results detected by HRM is in good agreement with the result obtained by direct sequencing.Conclusion The HRM analysis is a simple，rapid，inexpensive and sensitive method for detection of the hot mutation region in exon of the gene for PAH. 【Key words】phenylketonuria；exon；HRM；Mutational hotspot；Gene Diagnosis 苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是一种氨基酸代谢异常的常染色体隐性遗传病。
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内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Small Amplicon Genotyping
扩增小片段直接进行基因型鉴定
•使用已知Tm值的双链DNA做温 度内标，低温内标Tm(~61℃) , 高温内标Tm (~92 ℃) •内标能够实现96/384孔板的温度 均一矫正。 •PCR片段的Tm值范围： 70-88 ℃ •优点：不需要探针，直接利用 PCR产物针对已知突变位点进行 基因分型
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• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
PCR
Lightscanner高分辨溶解曲线结果
LC Green plus —— 高分辨溶解曲线专用荧光染料
Saturating dye
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
HRM – Lunaprobe genotyping
HRM – Lunaprobe genotyping
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
1 Probe – 1 SNP, All Possible SNPs
Class 1 C:T, G:A Class 3 C:G
SNP及突变研究的最新工具 高分辨率熔解曲线（High Resolution Melting） 突变筛查和基因分型系统
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting） • 高分辨熔解曲线在遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析;T SNP without Calibration – 72bp
Apply Temperature Calibration
A>T SNP with Calibration
Small Amplicon Genotyping
M.H.Ye等对北京油鸡A-FABP基因进行小片段法基因分型，扩增片段为 56bp，灰色曲线显示的是杂合型（CT），蓝颜色和红颜色曲线分别代表 纯合型CC和TT。
Mutation Scanning
未知SNP扫描
M.H.Ye等对北京油鸡CAPN1基因外显子进行扫描，筛查其潜在SNPs。
Bernhard等对Barley的eukaryotic translation
initiation factor 4E (eIF4E) gene基因外显子进行突变扫描结果
Bernhard J. HoWnger · Hai-Chun Jing ·Kim E. Hammond-Kosack · Kostya Kanyuka (Barley Application) Theor Appl Genet (2009) 119:851–865 DOI 10.1007/s00122-009-1094-2 数据来自英国洛桑农业实验站
内容提示
• 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）的定义 • 高分辨熔解曲线在蚕的遗传育种中的应用 — 筛查突变 （mutation scanning） — 基因分型（Mutation Genotyping） —小片段+内标法（ Small Amplicon Genotyping ） —非标记探针法（Unlabeled Probe Genotyping，LunaProbe） —SSR分析 — 检测甲基化 • HRM仪器
Class 2 C:A, G:T
Class 4 A:T
1 Probe, 2 SNPs, 1 Amplicon
2 Probes, 2 SNPs, 1 Amplicon- ApoE
2 Probes, 2 SNPs, 2 Amplicons - HFE
Amplicon Scanning – 发现新的突变
High Resolution DNA Melting（HRM)是基于有序列变化的Amplicon之间微弱的 Tm值差异，通过DNA片段熔解曲线的差异进行突变检测，比如：
LightScanner突变检测原理 Wild type Tube 1 Homozygote Tube 2 Tube 3 Heterozygo te
rr
Mix Rr:rr by 1:1 Rrrr
RR
Mix RR:Rr by 1:1 RRRr Rr
David De ，Yong Song at el.Application og high-resolution DNA melting for genotyping and variant scanning of diploid and autotetraploid potato Mol Breeding (2010) 25:67–90