神经变性的分子病理机制

项目名称：神经变性的分子病理机制首席科学家：张灼华中南大学

起止年限：2010.9至2015.9

依托部门：教育部

二、预期目标

（一）总体目标

揭示遗传和环境因素在PD发病和病理过程中的分子机制。包括进一步阐明PD的遗传基础，发现和鉴定新的PD相关基因；探讨环境因素在PD脑组织中引起的DNA修饰和其对神经元功能途径的影响；通过分析异常蛋白和损伤细胞器在细胞内的清除途径，了解PD相关基因的生理和病理功能。最终阐明PD特征性的路易小体形成和DA神经元选择性进行性变性死亡的机制，为设计新的PD 预防和治疗方案提供科学和实验依据。

（二）五年的预期目标

1.利用外显子捕获和第2代DNA测序技术分析PD家系的全基因组的外显子序

列（exome），发现2-3个与PD相关的新基因。并分析这些基因的生理功能和其PD致病突变的病理机制，特别是它们对蛋白异常沉积和DA神经元变性损伤中的作用；

2.确定PD患者全基因组特异性DNA甲基化基因谱，同时分析其影响的分子途

径，探讨这些途径在PD发病中的作用；

3.揭示蛋白酶体和自噬在PD发病过程中防御细胞内蛋白异常沉积的作用。分

析PD相关基因在生理和病理状况下对蛋白酶体和自噬的调节；

4.揭示PD蛋白酶体假说和线粒体假说的共同机制，为发现统一的PD病理机制

提供实验依据；

5.探讨金属离子在PD发病中蛋白异常沉积和DA神经元变性损伤的作用。揭

示PD相关环境因素与遗传因素相互作用的分子机制；

6.建立一批PD细胞和动物模型。建立PD患者特异性iPSCs细胞模型，研究在

PD患者遗传背景下的发病机理。建立一批PD相关动物模型研究PD的基因功能和PD遗传与环境作用的机制；

7.在国际权威杂志上发表50篇以上的SCI专业论文，其中IF≥10的专业论文

5-8篇、IF≥20的专业论文1-2篇，申请相关专利3-5项；

8.培养一支创新团队和中青年学术带头人队伍。确定我国在PD发病机制研究

领域前沿的学术地位；

9.促进国内外的PD研究的学术合作和研究资源的交流，以加强我国的神经退

行性疾病的基础和临床研究。

三、研究方案

（一）学术思路和技术路线

学术思路：我们的研究假设认为：遗传和环境因素的共同作用导致PD。遗传背景，包括基因突变，病理基因多态和表达异常，奠定了疾病的易感性。环境因素对遗传基因的修饰，蛋白质的结构和功能的改变及细胞的死亡的损伤增加了疾病发生的可能和病理进程，破坏了细胞的防御机制，最终引起疾病。该研究主要以阐明PD病理发生和进程中蛋白异常沉积和DA神经元变性损伤为目的，进一步破译新的PD遗传基础，发现PD相关环境因素对遗传物质的修饰，分析遗传和环境因素对细胞防御功能蛋白酶体和细胞自噬的作用。并建立适合PD研究的细胞和动物模型。为最终阐明PD的病理机制和建立新的预防和治疗方案，提供实验依据和研究材料。

技术路线图：研究技术路线如图三。

（二）创新点与特色

1.学术理论的创新：我们以遗传因素决定PD的易感性，环境因素增加神经元

的损伤和破坏细胞的防御机制为研究假设, 明确提出PD研究的“二次冲击”

假设。

2.新技术的应用：利用全基因组外显子组测序的方法发现新的PD相关基因。

全基因组外显子测序技术是目前的新技术。在国际上仅有2篇文章利用这一技术鉴定与疾病相关基因，一方面说明了这一新技术的可行性。我们已经掌握了全部技术并收集了相关PD家系，为该研究奠定了基础。

3.率先研究环境因素对DNA的作用：进行PD全基因组DNA甲基化分析以研

究环境因素与遗传因素相互作用对PD发病的影响。目前，全基因组DNA甲基化的研究仅在对干细胞分析有少数几例报道。我们已经对5例PD病人和5例对照个体的脑组织进行了十万个CpG位点测序分析。在国际上首先将这一技术用于疾病的研究。本研究将通过对10例PD病人和10例对照个体的脑组织的分析建立第一个PD病人的全基因组DNA甲基化图谱。

4.研究金属离子在PD发病中的作用：过去研究环境因素在PD发病中的作用集

中在除草剂和刹虫剂。最近的研究表明金属离子在PD发病中起重要作用。

同时，PD相关基因ATP13A2的功能之一是调节Mn2+代谢。在遗传学上为金属离子在PD发病中的重要作用提供了证据。本研究利用铁离子为模型，着重研究遗传与环境因素的相互作用。并尝试用铁螯合剂预防PD发生的可能性。

5.同时研究两条细胞内异常蛋白和异常细胞器清除途径，并发现它的共同作用

和互补作用机制及在PD病理过程中对蛋白异常沉积和DA神经元变性损伤的防御作用。

6.利用PD患者iPSCs细胞模型，排除动物遗传背景对PD病理研究的影响。

7.将建立多种新的适应于PD病理机制研究的动物模型。

（三）可行性分析

——坚实的前期研究：

1.前期研究中，中南大学医学遗传国家重点实验室、中南大学湘雅医院神经内

科在神经退行性疾病资源收集、保存和利用方面做了大量的工作。至今已经

收集了1000余例散发性PD患者、23个常染色体显性遗传PD家系、56个常染色体隐性遗传PD家系、31个遗传方式不明PD家系成员的外周血gDNA。

12个PD家系成员进行了皮肤组织保存。21个PD病例（包括家族性和散发性）的皮肤细胞株。所有PD患者均建立了临床资料数据库。中山大学附属第一医院神经内科和苏州大学附属第二医院神经内科也收集到1000余例PD 患者的临床资料和DNA样本。这些工作为鉴定新的PD相关基因提供了实验材料和依据（课题一）

2.我们已经从国际脑库中获得10个PD病人和10个年龄、性别、死亡时间相

似的对照个体的冰冻大脑皮质标本和每一个体的固定了的黑质标本。并且，我们已经成功的完成对其中5对（5个病人，5个正常人）的每一个体的八万个CpG位点的测序和分析。发现了在PD脑组织中特定的功能途径相关基因DNA甲基化改变。这是据我们所知国际上第一个在疾病标本中的高通量DNA 甲基化分析研究。这一研究为PD全基因组DNA甲基化分析提供了理论和实验依据（课题一）。

3.丰富的PD基因功能研究经验。我们在国际上首先发现了PINK1和DJ-1相互

作用的人类遗传学依据；建立了PD研究的果蝇模型；证明了Parkin，PINK1和DJ-1三个PD相关基因的产物在体内形成一个新的蛋白泛素连接酶复合体。为自噬在兴奋性氨基酸受体激动剂引起的神经元凋亡中重要作用提供了实验依据；研究了线粒体自噬与神经元死亡的分子途径。同时在PD相关基因功能的研究方面也取得相应的成果（课题二、三）。

4.在环境因素，特别是铁离子、神经毒素在神经变性过程中的作用上做出开创

性的成绩。2001年，本项目研究者率先提出“脑铁代谢紊乱造成的脑铁异常增高可能是部分神经退行性疾病，包括PD，患者神经变性的一个起始原因”

的假设。进一步的研究为这一假设提供了证据。这些结果为该计划中以铁离子为例研究环境因素在PD发病过程中的作用提供了理论和实验依据（课题四）。

5.过去的五年中，我们的课题小组已经熟练的掌握了运用BAC制备转基因小鼠

的技术，并制备了10余种转基因小鼠。还建立了小鼠行为分析技术。同时，我们已经拥有多个与本研究相关的遗传改造小鼠系，包括alpha-synuclein过