蓝白斑筛选

蓝白斑筛选原理(入门级)

蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。

野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。

设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。

用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。

虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。

以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA（即目的片断）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。

实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。

X-Gal溶解到DMF（20mg/ml）IPTG (过滤除菌) (100mg/ml)

避光

40ul的X-Gal 14ul IPTG贮液

加到平板上,37℃、30min使吸收均匀(避光)

菌体涂板

培养15h (避光)

重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mM IPTG, 40ug/ml X-Gal指示平板上。可将50ul的X-Gal 和100 ul IPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC 保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM (IPTG配制成24 mg/ml（100 mM）的水溶液，并进行过滤除菌后保存。)，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为20mg/ml。IPTG和X- Gal需分装后保存在-20 C，可保存2-4个月。

IPTG终浓度为0.02mg/ml

X-gal终浓度为0.04mg/ml 100ml琼脂培养基加入200ul

Amp 终浓度为0.1mg/ml

15小时后菌落长出，蓝白斑也有了

IPTG 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷238.30

先将IPTG和X-gal(两者可混合）涂于Amp板上，将平皿正置放于37度约30min，待IPTG和X-gal完全吸收后，再将（连接体系转化大肠杆菌感受态细胞，加入LB培养1小时所得的）菌体涂板。

X-Gal

X-Gal也称5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside或

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，X-Gal是β-半乳糖苷酶

(β-galactosidase)的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。常用于β-半乳糖苷酶的原位染色检测以及蓝白斑筛选。

分子式为C14H15BrClNO6，分子量为408.63，CAS Number 7240-90-6。

中文名称：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷。

X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈蓝色。基于这个特点，pUC系列载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。

使用方法：

首先把X-Gal配制成20 mg/ml的二甲基甲酰胺（DMF）溶液（-20℃避光保存），然后在100 ml的琼脂培养基中，加入200 μl的上述溶液、100 μl的IPTG（24 mg/ml）和100 μl的Amp（100 mg/ml），制作成X-Gal、IPTG、Amp平板培养基。当DNA 片段插入至pUC系列载体（或其他带有lacZ、Amp基因载体），然后转化至lacZ 缺失细胞中后，涂布上述的X–Gal、IPTG、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体（白色为具有DNA插入片段的基因重组体）。

注意事项：

◆培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：50 μl/3 ml（20mg/ml）。

◆含有X-Gal的培养基4℃避光保存，须在1~2周内使用

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