丙酮丁醇发酵菌的分子遗传改造

摘要 丙酮丁醇梭菌及拜氏梭菌是重要的 ABE (丙酮 、丁醇和乙醇 )工业生产菌株 ,其发酵产物中 的丙酮和丁醇均为重要的化工原料 ,汽车发动机试验证明丁醇还是一种性能优于乙醇的极具潜 力的生物燃料和燃料添加剂 。随着新生物技术的不断发展及工业生产的需求 ,遗传工程改造不 断应用于丙酮丁醇生产菌株 。在前人研究及工业实践的基础上 ,对丙酮丁醇生产菌株的遗传特 性及其分子遗传改造取得的进展进行了详细概述 。 关键词 丁醇 丙酮丁醇梭菌 拜氏梭菌 基因工程 分子遗传学 中图分类号 Q819
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中国生物工程杂志 China B iotechnology
Vol. 29 No. 10 2009
醇耐受浓度可以从 0. 5% ～1. 5%不断提高 ,尽管菌株 对丁醇耐受浓度提高了 ,但是发酵丁醇产量尚未显著 增加 [ 7 ] 。
2 丙酮丁醇生产菌株遗传改造研究进展
图 1 丙酮丁醇梭菌的基因组图谱 F ig. 1 The genom e map of C. acetobu tylicum
acetobu tylicum 能够 将 淀 粉 转 化 为 丙 酮 、丁 醇 及 乙 醇 。 迄今 ,用于丙酮丁醇发酵最主要的两株野生菌为 C. acetobu tylicum ATCC 824 及 C. beijerinckii NC IMB 8052 (两种菌统称为产溶剂梭菌 ) 。前者的基因组序列已经 在 2001年完成 [1 ] ,后者的基因组序列在 2007年 6月由 美国 Joint Genome Institute完成全基因组测定 [2 ] 。这两 株菌都能 利 用 淀粉 , 但在 系 统 发育 上 相 距 较 远 。 C. acetobu tylicum ATCC 824 基因组由 3 940 880 bp 组成 , 编码 3762 个多肽 , 并含有一个 192 000 bp 的大质粒 pSOL ,编码 176 个多肽 。而 C. beijerinck ii NC IMB 8052 基因组由 6 000 632 bp 组成 ,不含质粒 ,溶剂产生基因 都位于染色体上 。很多研究认为 C. beijerinckii的底物 谱和适宜 pH 范围更宽 ,在丙酮丁醇发酵上可能比 C. acetobu tylicum ATCC 824 更具有工业应用潜力 [3 ] 。 借助于基因组学的研究工具 ,这两株菌中与丙酮 丁醇合成相关的遗传基础已经基本阐明 。丙酮生物合 成分支途径中的两个关键酶是辅酶 A 转移酶 ( CoAT) 和乙酰乙酸脱羧酶 (AADC) ,它们一方面直接催化葡萄 糖代谢中间产物乙酰辅酶 A 经乙酰乙酸生成丙酮 ,同 时又通过 转 化 乙 酸 和 丁 酸 间 接 促 进 丙 酮 和 丁 醇 的 合 成 。C. acetobu tylicum 中 ,与溶剂合成相关的基因簇位 于一个兆质粒上 ,称为 sol操纵子 ( adhE2ctfA 2ctfB , 编码 一个多功能醛 /醇脱氢酶及一个 CoAT, ctfA 和 ctfB 分别 编码 CoAT的两个亚基 。) 。编码丁醇脱氢酶的两个基
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丙酮丁醇发酵菌的分子遗传改造 3
杨 明 1 刘力强 133 牛 昆 1 贾娟娟 1 李 寅 2 张延平 2 王正品 1
(1 华北制药集团生物燃料研究所 石家庄 050015 2 中国科学院微生物研究所 北京 100101)
丁醇除了是重要的有机化工原料外 ,还是一种极 具潜力的新型生物燃料 。其热值 、辛烷值与汽油相当 ; 含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近 ; 不会腐蚀 管道 ,便于管道输送 ;蒸汽压低 ,安全性高 ,且能与汽油 以任意比混合 。由于具有这些优点 ,因此引起了各国 研究者 和 企 业 的 兴 趣 。丙 酮 丁 醇 梭 菌 ( C lostrid ium acetobu ty licum )在很早以前就被用于溶剂丙酮和丁醇的 生产 ,二战后 , 石化工业的迅猛发展及原料价格的上 涨 ,使得丙酮丁醇发酵 (ABE发酵 )生产被石化法替代 。 近几年随着石油价格的迅猛增长 ,石油化工生产丁醇 成本也随之增长 ,生物发酵法生产丁醇重新受到关注 。 同时随着生物技术的飞速发展 ,采用分子生物学手段 、 基因改造技术以及代谢工程来增加丙酮丁醇梭菌发酵 溶剂特别是丁醇的产量又成为研究的热点 。本文在这 一前提下 ,对丁醇产生菌的分子遗传工程改造研究及 其在育种中的应用进行了概括和总结 。
决定丁醇成本的核心问题是丁醇的产量 、丁醇对 底物的转化率 、以及底物的价格 。因此 ,对菌株遗传改 造的研究主要围绕提高底物的转化率 、提高生产菌株 对溶剂的耐受性及选择更廉价的底物进行 。 2. 1 基因改造提高丁醇产量 为了提高所需溶剂的产量 ,对丙酮丁醇生物合成 途径中的主要酶进行遗传修饰 ,可导致丙酮丁醇转化 率的改变 。M ermelstein 等 [8 ]将 adc、ctfA 和 ctfB 3 个基 因重组成由 adc基因启动子 2操纵子统一控制的 ace操 纵子结构 ,构建重组质粒 pFNK6,转化 C. acetobu ty licum ATCC 824株 ,与相应的野生菌比较 ,在 3 种 pH 的发酵 条件下 , CoAT和 AADC 的活性分别提高 4 ～33 倍和 4 ～38倍 ,丙酮 、丁醇和乙醇的产量分别提高了 95%、 37%和 90% ,而且两种酶的表达时间都从生产菌的稳 定期提前到对数生长早期 。 Sillers等 [9 ]通过改变 aad ( adhE1)基因表达模式 ,利用 ptb强启动子代替梭菌自 身启动子 ,并且下调 CoAT的表达 ,结果 aad 提前高度 表达 ,使得丁醇和乙醇的产量比对照菌株都有所增加 , 丙酮产量下降 ,总溶剂产量可达 30 g /L ,说明 aad 基因 对于醇的选择性比较强 。除丙酮丁醇合成关键基因之 外 ,关于 其 它 影 响 梭 菌 溶 剂 产 生 的 基 因 也 有 报 道 。 Tomas等 [10 ]将过量表达热激蛋白 ( g roES 和 g roEL ) 的 质粒转入 C. acetobu tylicum ATCC 824 中 , 构建了新的 菌株 ,产总溶剂浓度与野生菌株 、质粒对照菌株相比分 别提高 40%和 33% ,代谢活性周期比野生菌株延长了 215 倍 。2002年 , Durre等 [11 ]对梭菌的转录因子进行了 研究 ,发现转录因子 S po0A 可能对孢子的形成和溶剂的 产生起到了关键调控作用 。随后 , Scotcher等 [12 ]发现了 S po IIE调节基因 ,该基因通过调节转录因子 S po0A ,实 现对溶剂和孢子生成的调节 。 通过基因阻断或抑制技术 ,可以改变丁醇 、丙酮和 乙醇之间的比例 ,减少副产物的产生 。 Green等 [13 ]通过 非复制性质粒 ,对 aad基因进行阻断试验 ,发现丁醇合 成显著下降 ,转化子经过 25 次传代 ,此性状稳定存在 , 证实了 aad基因在丁醇合成中起着重要作用 。而其进 一步的研究发现 ,敲除磷酸转乙酰酶基因 pta或丁酸激 酶基因 buk,丁酸合成会减少 ,而丁醇产量明显提高 [14 ] 。
1 丙酮丁醇生产菌的分子遗传学研究进展
1861年巴斯德首次发现细菌能够产生丁醇 , 1912 年魏 兹 曼 ( W eizmann ) 发 现 了 一 种 梭 菌 C lostrid ium
收稿日期 : 2009205225 修回日期 : 2009207224 3 河北省科学技术研究与发展计划重大技术创新项目 (08275509Z) 、石 家 庄 市 科 学 应 用 技 术 研 究 与 开 发 资 金 项 目 (8120103A )资助项目 33通讯作者 ,电子信箱 : ncpcllq@163. com
因 bdhA 及 bdhB 也成簇存在 , 但它们位于染色体上 。 而与乙酸 /丁酸合成的相关基因 ,如磷酸转乙酰酶 /乙 酸激酶 、磷酸转丁酰酶 /丁酸激酶基因也都在一个基因 簇上 (图 1) [4 ] 。而在 C. beijerinckii中 ,这些基因都位于 染色体上 。 用于产溶剂梭菌 C. beijerinck ii的整合质粒研究较 为成熟 ,已成功用该方法将 spoOA 等通过同源交换定 点整合到该菌的染色体上 。而 C. acetobu ty licum 胞内的 核酸内切酶会切割外源 DNA ,因此有关该菌的遗传操 作系统发展缓慢 。目前已经证明质粒 pAM β1、p IM13 及 pCBU2在 C. acetobu ty licum 中具有较高的遗传稳定 性 ,但是在转化前需要进行甲基化修饰 ,以免被梭菌的 核酸内切酶消化 。这些质粒在 C. acetobu tylicum 中的 拷贝数大约为 : 7 ( p IM13 ) 或 14 ( pCBU2 ) ,已经成功地 用于 C. acetobu ty licum 的基因工程研究 。 对于溶剂产生菌来说 ,溶剂本身对产生菌的毒性 是其溶剂产量的主要限制因素 。溶剂进入膜后 ,使膜 作为渗透屏障和蛋白嵌入平台的功能减弱 , 渗透性 、流 动性和无序性增大的细胞膜使微生物难以抵御溶剂的 毒害作用 [5 ] 。梭菌对丁醇比较敏感 ,耐丁醇浓度不能 超过 2% ,其原因主要包括 :丁醇破坏了适合梭菌细胞 生长的 pH 值 ;降低了细胞内的 ATP水平 ;抑制了对葡 萄糖的吸收 [6 ] 。一系列的突变筛选实验证明 ,梭菌丁
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杨 明 等 :丙酮丁醇发酵菌的分子遗传改造
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上海植物生理研究所利用 II型内含子载体阻断技术成 功阻断了 buk和 solR 基因 ,获得的突变菌株比对照菌 株丁 醇 产 量 分 别 提 高 了 44% 和 37% [15 ] 。 Tummala 等 [16 ]过度表达乙醇 /乙醛脱氢酶 ,并且通过反义 RNA 技术抑制 CoAT活性 ,下调乙酰辅酶 A 转移酶基因 ctfB 的表达 ,最终使得丁醇产量增加到 2. 8 倍 。反义 RNA 技术抑制丙酮合成途径中酶 adc和 ctfA /B 的活性时发 现 ,两者酶活性都有所下降 ,但是 adc的下调不影响丙 酮的形成 ,下调 ctfA /B 使丙酮和丁醇的产量明显下降 , 说明 ctfA /B 是 丙 酮 丁 醇 合 成 途 径 的 关 键 基 因 [17 ] 。 Nakayama 等 [18 ] 也 通 过 反 义 RNA 技 术 抑 制 C. saccha roperbu tylaceton icum 的氢 化 酶 基 因 簇 hupCBA 的 表达 ,突变株产氢量提高 3. 1 倍 ,伴随的丙酮产量提高 1. 6倍 ,而丁醇的产量却下降 75. 6%。 2. 2 提高自身丁醇耐受性 美国西北大学的 Papoutsakis研究小组在美国能源 部支持下 ,以 C. acetobu tylicum 为模型 ,将耐受丁醇突 变株和野生型菌株分别在丁醇培养基和基础培养基中 培养 , 进 行 DNA 芯 片 对 比 分 析 , 发 现 热 休 克 蛋 白 H SP18、H SP90 及一些其它蛋白的表达可能与溶剂耐受 性相关 [ 19～21 ] 。 Ezeji等 [3 ]对 C. beijerinck ii NC IMB 8052 进行 化 学 诱 变 , 筛 选 获 得 丁 醇 耐 受 性 提 高 的 C. beijerinck ii BA101菌株 ,在简单 、便宜的培养基中生长较 好 ,适于工业应用 。而且该菌株具有良好的传代稳定 性 ,适宜连续生产 ,与出发菌株 8052 相比 ,葡萄糖利用 率提高明显 ,批式发酵总溶剂浓度达到 3. 3% ,其中丁 醇产量 17～21g /L ,是目前国际上报道的丁醇分批发酵 的最高产量 。Borden 等 [22 ]利用 C. acetobu tylicum 基因 文库分离到了耐受丁醇基因 ,这些基因属于转录调节 因子 ,对这些基因进行表达发现耐受能力提高了 81%。 反义 RNA 同 样 用 于 提 高 梭 菌 丁 醇 耐 受 性 的 实 验 , Lyanage等 [23 ]通过反义抑制甘油脱氢酶基因 g ldA 的表 达来提高 C. beijerinck ii NC IMB 8052 的 丁 醇 耐受 性 。 各种微生物对丁醇的耐受性是不尽相同的 , Knoshaug 等 [24 ]通过比较 24种微生物对丁醇的耐受性 ,发现大多 数微生物的耐丁醇浓度在 1% ～2%之间 ,几株酵母菌 可以耐丁醇 2% , 只有两株乳酸菌能耐丁醇浓度达到 3% ,这为构建其他耐受丁醇基因工程菌株生产丁醇提 供了理论依据 。我们也通过自然筛选 ,从牛粪 、马粪等 食草动物粪便中分离到了几株耐受高浓度丁醇的细菌 菌株 ,耐丁醇浓度可达到 30 g /L ,目前正在对其进行鉴 定 ,摸清遗传背景 ,为利用这些高耐受菌株提高丁醇产