核酸等温扩增杨银辉 ppt课件

RPA技术
RPA技术简介
RPA（recombinase polymerase amplification）技术，2006年由剑 桥大学的Olaf Piepenburg等人建立。
该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段结 合，启动DNA复制；不需要DNA解链过程。
其具有便携，免去PCR仪等大型实验室设备的使用；快速，20分 钟内得到检测结果；灵敏度高，几个拷贝即可检出；便于保藏， 采用冻干粉末状酶等优点。
近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等进 行核酸检测。
RPA的原理
四氢呋喃非碱基位点类似物
tetrahydrofuran abasic–site mimic (THF)
结果观察：
Basic RPA
lateral-flow strip
exo RPA
引物、探针设计
RPA技术的缺点
• 灵敏度高、特异性强、保真度高。
• 反应成分复杂、需要三种酶导致成本偏高、须重 复加入逆转录酶和 T7 RNA 聚合酶。
滚环放大(rolling circle amplification, RCA)技
术wenku.baidu.com
• 基于滚环只有在单链闭合状态并有相应引物存在下才能同 温滚动复制的原理。
• 基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温 核酸扩增方法。在恒温的条件下,可以产生大量的与环型 探针互补的重复序列。
IMSA扩增的优点
• IMSA 不仅拥有 LAMP 检测技术类似的应用优点， 在引物设计和扩增原理上还具有其独有的特点， 使得其具备比 LAMP 更高检测灵敏度的潜力。
• 该技术一定程度上能打破日本 LAMP 专利在我国 的应用限制，使其更好地服务于我国的传染病防 控、食品安全检测和环境物种保护等各个领域。
• RCA反应体系组成： 噬菌体 φ29DNA 聚合酶、单链环状 DNA 模板和引物
（一条或一对也可多条）。
噬菌体 φ29 DNA 聚合酶具备很强的链置换活性，无需模 板分离，酶性稳定，可连续数小时高效催化合成 DNA。
RCA的扩增原理
SAT技术
• 实时荧光核酸恒温扩增检测技术（Simultaneous Amplification and Testing，简称SAT）是将新一代的核 酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核 酸检测技术。该技术具有高灵敏度、高特异性、低污染、 反应稳定等优点。
SAT技术的原理
SAT技术（Simultaneous Amplification and Testing）是基于TMA （Transcription mediated amplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新 核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术
SAT技术的优势
• 针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特异性的 扩增和检测，有效防止假阴性结果。
• LAMP 的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故在 产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；
• 产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克隆 等基因工程操作。
NASBA的优缺点
• NASBA 是种 RNA 扩增法，因此其主要应用是对 RNA 病毒的检测。
• 整个反应能在 42℃条件下进行，经过两个小时的 扩增可将模板 RNA放大至 109~1010倍。
• • SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境中易
降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的依据，因此更利 于用药之后疗效的监测和判愈。
• • SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以最大程度地确保检
测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假阳性、假阴性 结果。
IMSA扩增
IMSA扩增的原理
IMSA扩增的原理
核酸等温扩增技术在病毒 检测中的应用
军事医学科学院微生物流行病研究所 杨银辉
核酸等温扩增技术
核酸等温扩增的优势
核酸等温扩增的种类
环介导核酸等温扩增技术（LAMP）
LAMP引物设计原则
LAMP扩增引物设计
LAMP扩增过程
环引物在茎环结构环状结构处识别并不断延伸， 使双链过早打开，有利于复杂茎环结构的成环和 外引物置换作用。这一定程度上加速了整个 LAMP 扩增循环阶段的反应。
• 同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA ）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7 RNA多聚酶从该DNA拷 贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝 再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标 记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信 号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。
LAMP的操作过程
检测方法
LAMP技术在病原体检测中的应用
LAMP技术小结
LAMP技术的优点
存在缺陷
• 所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300 bp 以内。因此，无法进行长片段 DNA 的扩增；
• LAMP 技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区， 否则极易受到污染而产生假阳性结果；
• 严格专利保护 • 反应成分复杂 • 对临床标本的检测效果较差