微生物实验报告

《脓汁和粪便标本中病原菌的检测》

实验目的：本次脓汁粪便标本中病原微生物的检测实验，旨在通过培养基制备，病原菌的分离与培养，以及细菌鉴别实验如革兰氏染色法，血浆凝固酶试验，药敏试验，半固体接种法实验，从而对医学微生物学主要的研究方法和手段有一定程度的了解，初步掌握微生物试验的基本技能和原理，也有助于无菌观念的树立。

1.实验器材：

接种针、接种环、油性笔、打火机、试管架、普通冰箱、冷藏室、隔水式电热恒温培养箱、生物显微镜、电炉、蒸馏水、玻片缸、消毒液、1‰新洁而灭、天平、砝码、细菌干粉培养基、锥形瓶、量筒、试管筐、糖发酵管、灭菌平皿、试管（棉塞）、刻度吸管、洗耳球、称量纸、硫酸纸、牛皮纸、橡皮筋、尺子

2.实验方法与步骤：

2.1培养基的制备、消毒和灭菌

培养基制备的一般程序：

①调配→溶化→矫正pH →分装→灭菌→检定→保存。

②干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→灭菌→检定→保存。

③如下图表格内容要求所示制备培养基。

表一

组号培养基称量

(g)

水量

(ml)

煮沸

(次)

分装

(ml)

备注（40人份）

1 营养琼脂11.4 300 4瓶，500ml瓶，平板

2～4 营养琼脂 2.9 75 3 5 15支，中试管，斜面

5～7 营养肉汤 1.1 50 1 3 15支，小试管，液体

8～10 半固体 1.5 50 3 3 15支，小试管，高层2．2细菌的分离与培养

2.2.1采用平板划线分离法，取脓汁标本在普通平板表面划线，取粪便标本在伊红美蓝固体培养基表面划线，使之分散成单个细菌，在37℃培养18～24h ，从而分离出单个菌落。

2.2.2观察形成菌落的大小、形状、边缘、表面、颜色。

2.2.3细菌的纯培养：取脓汁标本在普通平板上的黄色、白色单菌落，粪便标本在伊红美蓝平板上的紫黑色、淡粉红色单菌落接种在四个斜面培养基，标记，在37℃培养18h。

2.3细菌个体形态特征的观察

2.3.1革兰染色法观察细菌形态。涂片→干燥→固定→染色。涂片：取一玻片在玻片的左右两侧上加生理盐水3～4ul，2滴，分别取黄色和紫黑菌菌苔少许（1mm小菌落的半量）与左右两侧盐水混匀，涂成1cm2。干燥：在空气中放置至干燥。固定：在酒精灯上来回横穿2到3次对其进行固定。染色：结晶

紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→95％乙醇→脱色约20秒钟→水洗稀释→复红→复染1分钟→水洗→吸干,镜检。

2.3.2取另一玻片，取白色和粉红色菌苔，操作与上述同。

2.4细菌生化反应鉴定

2.4.1糖发酵试验用接种针分别挑少许紫黑和粉红色的细菌接种到葡萄糖发酵管和乳糖发酵管中，在37℃下，培养24小时，观察其产酸产气情况。

2.4.2细菌药物敏感性试验接种环分别取黄、白、紫黑、粉红色四种菌液3～6ul×2环，各自在四个平板上，作平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。37℃18～24小时培养，观察结果。

2.4.3血浆凝固酶试验取二滴兔血浆置于洁净的玻片上，分别用接种环取白色和黄色菌苔(2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合，涂匀呈云雾状，立即观察结果。

2.4.4半固体接种法接种针斜面取四种不同颜色的细菌，各自接种进四个半固体培养基，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。在37℃下,培养24小时，观察结果。

2.4.5 痢疾血清玻片凝集反应取载玻片1张，滴加痢疾血清和生理盐水各15ul，2滴。用接种环挑取少许紫黑色菌落和粉红色菌落，各自与上述混合液液滴混匀，观察结果。

3.实验结果与讨论

3.1脓汁和粪便病原微生物检测结果。

3.1.1细菌的分离与培养的结果。脓汁中的细菌在普通平板上形成黄色和白色菌落。粪便中的细菌在伊红美蓝固体培养基上形成紫黑色和粉红色菌落。

伊红美蓝为指示剂，具有抑制革兰氏阳性菌生长的作用。大肠杆菌分解乳糖产酸，使伊红美蓝呈色，形成紫黑色菌落，且有金属光泽；肠道致病菌不发酵乳糖，菌落成粉红色，有时可因碱性物质较多，细菌带负电荷染上美蓝而成蓝色菌落。

3.1.2观察细菌形态的实验结果。脓汁的黄色和白色菌落中的细菌革兰染色紫色，阳性，萄萄串珠样排列球菌，疑似葡萄球菌。紫黑色和粉红色的细菌呈杆状，粉红色，说明为革兰氏阴性菌。

用革兰染色法观察细菌的形态时脱色时间不要太久免得影响实验结果，油镜放入光路之前，一定要在标本的观察部位上加一滴浸油。使用后记得擦洗干净。3.1.3糖发酵试验结果。不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此，可以鉴别各种细菌。紫黑色细菌在葡萄糖和乳糖发酵罐中皆变色和产生气泡，说明紫黑色细菌均能分解葡萄糖和乳糖，产酸产气。粉红色细菌在葡萄糖发酵管中变色但不产生气泡，说明其能分解葡萄糖，产酸不产气；在乳糖发酵罐中既不变色又不产生气泡，说明其不能分解乳糖，不产酸不产气。

在进行糖发酵试验时，试验完成后，管口不能朝上，这是因为管口朝上时，反应过程中产生的气体会溢出，观察不到正确的实验结果，最终会影响到细菌的最终鉴定。

3.1.4药敏实验结果。

表二常用药敏试验纸片判断标准

抗菌药物纸片含药量耐药抑菌圈直径(mm)

耐药中度敏感敏感

青霉素G(葡萄

球菌)

10单位≤28 - ≥29

链霉素10微克≤11 12～14 ≥15

庆大霉素10微克≤12 13～14 ≥15

四环素30微克≤14 15～18 ≥19

氯霉素30微克≤12 13～17 ≥18

磺胺300微克≤12 13～16 ≥17

表四药敏实验结果分析

青霉素链霉素庆大霉素黄色细菌+ + +

白色细菌+ + +

紫黑细菌- + +

粉红细菌- + +

注：耐药－，中度敏感±，敏感＋

G+金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素敏感，对链霉素中度敏感。感染后用青霉素治疗效果较好。G-粉红色和紫黑色细菌对青霉素耐药，对链霉素敏感。感染后用链霉素治疗效果较好。G+球菌和G-杆菌对广谱抗菌素庆大霉素都敏感。

3.1.5血浆凝固酶试验的结果分析。观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质，说明其为凝固酶阳性，是致病菌；白色菌落细菌不出现凝集反应，说明其为凝固酶阴性，不是致病菌

3.1.6紫黑色和粉红色细菌在半固体培养基中的结果。紫黑色细菌在半固体培养基内呈扩散生长,培基混浊，说明该细菌有鞭毛；粉红色细菌在半固体培养基内沿接种线生长,培基清澈透明，说明该细菌无鞭毛。

表五紫黑色和粉红色细菌生化反应结果分析

紫黑菌落粉红色菌落

葡萄糖乳糖

半固

体

葡萄糖乳糖

半固

体

⊕⊕+ + - -

3.1.7痢疾血清玻片凝集反应的结果分析。紫黑色菌落的细菌不能使痢疾血清产生颗粒性物质，说明其不是引起痢疾的致病菌；粉红色菌落的细菌使痢疾血清产生颗粒性物质，说明其是引起痢疾的致病菌。

在适量电解质存在的情况下，颗粒性抗原(细菌)与特异性抗体混合，如果比例合适，则出现肉眼可见的凝集块，称为凝集反应。凝集反应的机制是由于抗原与其相应抗体间存在着相对应的极性基。极性基的相互吸附，使抗原外周的水化膜除去，由亲水溶胶变成憎水溶胶。电解质具有降低电位的作用，使抗原颗粒间的排斥力消除，从而产生了凝集现象。

附肠道各菌属生化反应鉴别表。