第三章 沉淀法

高向低进行扩散渗透，而大分子物质如蛋白质等则
留在袋内。为了加快透析速度，应不断更新透析液， 若用温和搅动的办法则效果较好；为了避免蛋白质 或酶类破坏，通常宜在低温下进行。
透析时注意以下几点：
（1）透析袋的处理
购买的透析袋(或纸) 用蒸馏水洗净,无漏洞时，即可 使用。
除去某些易被金属或水解酶等破坏的样品中所含盐 类时，透析袋的处理方法： 将l0厘米长的透析袋置500毫升含1mmo1／L EDTA-Na2的2％碳酸氢钠溶液中煮沸10分钟，用干 净镊子或戴橡皮手套取出，蒸馏水煮沸、漂洗后， 即可使用。用过的透析袋依上述方法处理，能重复 使用，若不马上使用，可泡在蒸馏水中置低温 （4℃）；或泡在70％的乙醇中保存。
的速率快。因此，对一种有效成分而言，
(2)盐的分级范围的差异性
当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白
质的Ks值都很大，而且盐析范围(盐离子强
度)差异明显，则分离效果好；若Ks值很大，
但盐析范围差异较小，则分离效果不好。
三种蛋白质的盐析曲线图
沉 淀 量 （ ）
B A
C
mg
30
40
50
60
70 80 90 硫酸铵饱和度%
有机溶剂沉淀
除了疏水之外的其它作 用力 甲醇、丙酮等有机溶剂
蛋白质在其pI下， 因电荷为零而聚集 沉淀；若加入盐类， 会阻碍其聚集而增 加溶解度。
降低水活性，使溶液的 介电常数下降，增加蛋 白质溶质分子之间的作 用力，而聚集在一起。
其它 说明
对较低浓度缓冲液 进行透析是盐溶的 反向过程。
非极性蛋白质较早沉 淀下来；在硫酸铵中 蛋白质相当稳定。
②饱和溶液加入法：
在蛋白质溶液中逐步加入预先调好pH的饱和
硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵量可
用下列公式计算： S2 - S1 S3 - S2
V = V0
V ＝需加入硫酸铵溶液的体积(毫升)；
V。=原来溶剂的体积（毫升)；
S1＝原来溶液的百分饱和度； S2＝要求达到的百分饱和度； S3＝需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用100%)。
(4)蛋白质的纯度和浓度
蛋白质存在的形式(均一的，还是混合的)和
浓度不同，盐析范围和溶解度也不同。在混
合的蛋白质溶液中，不同分子间的相互作用
会发生共沉淀现象。蛋白浓度越高，这种现
象越明显，盐析分离效果则越差。因此．一
般控制样品液蛋白浓度在0.2％一2％为宜。
(5)其他因素
其它在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmo1/L的EDTA-Na盐，以除去沉淀剂中带入 的金属离子。
酸银检查，直到透析液中检测不出现硫
酸钡或氯化银沉淀为止，即透析完成。
二、有机溶剂沉淀法
有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因： 1、与盐溶液一样具有脱水作用； 2、有机溶剂的介电常数比水小，导致
溶剂的极性减小。
常用的有机溶剂：甲醇、乙醇和丙酮。
用有机溶剂沉淀蛋白质．需加入的有机溶剂 量，—般以体积为单位按照下列公式计算： S2-S1 100-S2
优点：比加入固体硫酸铵沉淀法温和； 缺点：对于大体积样品不适用。因为硫
酸铵溶液的大量加入，将导致样品溶液
体积增加。例如，当样品达到50％硫酸 铵饱和度时，其体积增加一倍。
③透析盐析法
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大 体积盐溶液中，通过透析作用来改变蛋白质 溶液中的盐浓度。 特点：盐浓度是以连续的状态变化，可以避
例如，在某些蛋白质溶液中只要加入0.0050.02nmol/L Zn2+，就可大大减少有机溶剂的
用量，而将蛋白质沉淀出来。
各种盐析及沉淀法的比较
盐溶 影响 因素 试剂 发生 机制
蛋白质分子表面的 带电基团 NaCl(单价离子)
盐析
蛋白质分子表面的非 极性基团 硫酸铵(两价离子) 硫酸铵的两价离子， 在溶液中抢走附在蛋 白质表面(非极性)的 水分子，使得非极性 部分相互吸引而聚集 沉淀。
V = V0 ×
V＝需加入有机溶剂的体积；Vo＝蛋白溶液的
原始体积；S1＝蛋白溶液中有机溶剂的浓度
(体积百分浓度)；S2＝蛋白溶液中欲达到的溶
剂浓度(体积百分浓度)。
如果使用的有机溶剂含量不是100％而是95%，
则公式中的100应改95，余此类推。
用有机溶剂沉淀法分离某些蛋白质时，效果
也不错。如，从解酚假单胞菌分离邻苯二酚2,3-双加氧酶时,在粗提液中加入50％到60％ 的冷丙酮溶剂,能把几乎全部欲分离物沉淀出 来。有机溶剂沉淀法的操作与硫酸铵盐析法
蛋 40 白 质 沉 淀 20
100%饱和度 时的溶质量
%
20Leabharlann 406080
100
硫酸铵溶液的饱和度
硫酸铵的分级试验
饱和度 范围% 0~40 40~60 酶沉淀 蛋白 % 沉淀% 4 25 62 22 纯化 倍数 2.8 备注 酶在40~60%盐中沉淀比 60~80%的多，要改试 45~70%的盐沉淀。 45~70%的盐收得率高但 纯化倍数<第一次，欲 提高纯度，需试48~65% 的盐饱和度。
透析袋或透析管的孔径和规格因厂而异。透
析袋的孔径大小除与其型号有关外，还受处 理方法的影响。例如，用64%氯化锌溶液浸 泡过的透析袋，可使其孔径增大到能通过 135000道尔顿的大分子。而经乙酰化作用的
透析袋，则可使其孔径缩小到能阻滞甲醇分
子的通过。
(2)选用适当的透析液
一般选用的透析液均为低离子强度的中性缓 冲液。对含有辅基的酶透析时，在透析液中
有机溶剂的分级作用。中性盐的离子强度在0.05以
下时，能防止蛋白质变性。
用有机溶剂沉淀蛋白质时，宜在稀盐溶液或低浓度
缓冲液中进行。
(3)多价阳离子的作用
有些蛋白质和多价阳离子(如Zn2+、Cu2+等)能 结合形成复合物，致使蛋白质在有机溶剂中 的溶解度降低。这对在高浓度溶剂中才能沉 淀的蛋白质特别有益。
免盐浓度局部升高产生的不良影响，分离效
果好。
缺点：实际应用过程受透析袋容积有限、
速度缓慢等因子的制约，故只用于要求较
精确、样品体积小的试验中。
2．盐析曲线的制作
用盐析法沉淀欲分离样品时所需盐浓度范围 要通过实验确定。 具体步骤： 取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离 溶液，调节pH至稳定范围，分6-10次加入不 同量的硫酸铵：第一次加硫酸铵到溶液出现 微弱混浊状态时，静置一段时间，离心或过 滤即得到第一个分级沉淀部分。接着以同样 的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中．则得 到第二个分级沉淀部分。
相似。
需要指出：
(1)低温下操作 由于有机溶剂加入水溶液时产生放热反应会
引起蛋白质变性，因此必须把所用之有机溶
剂预冷至-10℃，而且整个操作要在低温下 进行。
(2)中性盐的作用
加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶
解度，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作用，同时
还可提高分级效果。
但是，加入的量过多，则可引起蛋白质析出，影响
的作用。比如将2-3mol/L硫酸铵盐析的蛋白
质置低温下保存一年其性质没有变化；
D. 硫酸铵价廉易得，废液可肥田。
缺点：
即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。
(2)硫酸铵盐析的操作
①固体加入法：
在大体积粗制品溶液中逐步加入固体硫酸铵，加
到一定饱和度时，蛋白质可沉淀出来。
注意：
控制加硫酸铵的速度，在搅拌下、以少量多次方
宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。为了
防止微生物生长，透析应在4℃进行或在透 析液中添加0.02％叠氮化钠。
(3)掌握透析时间
操作在搅拌下进行时，样品液与透析液体
积之比以1:10较好，一般三小时可达平衡。 若透析在静止状态下过夜进行时，则比例
应扩大到1：20以上。
注意:
脱盐是否彻底，要经常检查： 如除去的是硫酸铵，可用10%氯化钡 检查，如除去的是氯化钠，可用10％硝
式表示:
lgS＝β- Ka· M
式中β表示有效成分在水中溶解度的对数值；M表示克
分子浓度；Ka表示有效成分在特定条件下的数值，即
表示有效成分之溶解度降低的速率是随着盐浓度的增 加而增加的。
Ka值大，则意味着有效成分溶解度降低 Ka值越大，分级范围越窄。盐析效果就
越好。 某一蛋白质的Ka值不仅与蛋白质本身的 性质有关，而且与溶液的pH、温度和盐 的种类等因子也有关。
其优点：
A. 温度系数小而溶解度大(25℃时饱和溶解度 为4.1mol/L,即767g/L;0℃为3.9mol/L，即 676g/L)，适合许多蛋白质和酶的盐析；
B. 分级沉淀效果比其他盐好。比如：有些抽提 液经过加入适量硫酸铵的一步分组沉淀,就 可除去杂蛋白75%以上； C. 不容易引起蛋白质变性，有稳定蛋白质结构
(3)pH和盐浓度
溶解度与pH和盐浓度有密切关系。当这两种因子变 动时，溶解度将发生明显的变化。 例如，兔肌甘油醛磷酸脱氢酶(等电点8.5左右)在 PH＝6.0时，能溶于3.2mol/L(NH4)2SO4溶液，但当 PH调至7时，立即产生沉淀，甚至有结晶析出。 选择适当pH的盐溶液，可提高对有效成分的盐析效 果；另外硫酸铵水溶液显酸性，为防止其对某些蛋 白质的破坏，应及时用氨水调pH至中性或视有效成 分的pH而定。
式缓慢地加入，待先加的硫酸铵溶解后再加入少
量的硫酸铵。
例如： 在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱 和度达35%，尿素酶基本上仍留在溶液中。 而饱和度达55％时．尿素酶几乎全都沉淀出 来(见表2-1)。欲将蛋白质溶液变成一定的硫 酸铵盐饱和溶液时，要加入的硫酸铵数量可 从硫酸铵饱和溶液计算表查得。