不同冷冻方法对小鼠卵母细胞冻存的影响_李娜

３ 统 计 学 方 法
用统计软件 ＳＰＳＳ１１．０进 行 数 据 统 计 学 分 析。
组间率的比较采用
２
χ
检 验 ，Ｐ
＜０．０５为差 异有统
计学意义。
４ 结 果
ＯＰＳ 组 的 存 活 率 ６４．６％ 略 高 于 ＣＰＳ 组 （６０．８％），但无统计 学 差 异。ＯＰＳ 组 内 ＣＯＣ 组 复 苏率为７６．７９％，显著 高 于 ＤＯ 组 （５２．３２％），有 统 计学差异（Ｐ ＜０．０５），而 ＣＯＣ 组与 ＤＯ 组的受 精 率及 囊 胚 率 比 较，均 无 统 计 学 差 异 （Ｐ ＞０．０５）。 ＣＰＳ组内 ＣＯＣ 组 复 苏 率 为 ７２．９８％ 显 著 高 于 ＤＯ 组（４８．７８％），有 统 计 学 差 异 （Ｐ ＜０．０５），而 两 组 受精率和囊胚 形 成 率 无 统 计 学 差 异，与 ＯＰＳ 组 是 否 包 裹 颗 粒 细 胞 冻 存 的 结 论 一 致 。 见 表 １。
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孕 马 血 清 （ＰＭＳＧ），人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 （ＨＣＧ），透 明 质 酸 酶，冷 冻 基 础 液 （ＢＳ）为 含 １０％ 胎牛 血 清 的 Ｄｕｌｂｅｃｃｏ 磷 酸 盐 缓 冲 液 （ＤＰＢＳ）。 ＶＳ１：含１．５ｍｏｌ／Ｌ 丙 二 醇 （ＰＲＯＨ）及 １．５ ｍｏｌ／Ｌ 乙二醇 （ＥＧ）。ＶＳ２：含 ５．５ ｍｏｌ／Ｌ 乙 二 醇 和 ５．５ ｍｏｌ／Ｌ 丙二醇及１．０ｍｏｌ／Ｌ 的蔗糖。融解液分四个 梯度进行配制分别为１．０、０．５、０．２５、０．１２５ｍｏｌ／Ｌ 的蔗 糖＋ＢＳ液体。
１ 实 验 材 料 １．１ 实 验 动 物
昆明种 小 鼠 雌 性 ６～８ 周 龄，２２～２８ｇ／只，３０ 只。雄性 ８～１Leabharlann Baidu 周 龄，体 重 ２７～３２ｇ／只，２０ 只。 全部由长治医学院实验动物中心提供。
１．２ 试 剂 配 制
李 娜 等 ．不 同 冷 冻 方 法 对 小 鼠 卵 母 细 胞 冻 存 的 影 响
２ 实 验 方 法
２．１ 卵 母 细 胞 的 收 集
选择发情间 期 的 雌 性 小 鼠，于 当 日 １７ 时 腹 腔 注射 ＰＭＳＧ（宁 波 激 素 厂 ）１０ＩＵ／只，４８ｈ 后 腹 腔 注射 ＨＣＧ（丽珠 制 药）１０ＩＵ／只，行 控 制 性 超 促 排 卵。注射 ＨＣＧ 后１６～１８ｈ 断 颈 处 死 小 鼠，取 双 侧卵巢分离输卵 管，刺 破 输 卵 管 的 膨 大 部，收 集 卵 丘复合体。
２．３ 玻 璃 化 冷 冻 和 解 冻
２５ ℃室温下将 获 得 的 卵 冠 丘 复 合 体 在 ＤＰＢＳ 中冲洗２～３次后，分 别 选 用 不 同 载 体，将 ＣＯＣ 组 直接进行冷冻，ＤＯ 组 移 入 含 ８０ＩＵ／ｍＬ 透 明 质 酸 酶的 ＤＰＢＳ中处理１～３ｍｉｎ，机械吹打直至保留 ３ ～５层卵丘细胞，再将 卵 母 细 胞 移 入 ＤＰＢＳ 中 待 冷 冻 。 冷 冻 复 苏 过 程 如 下 ：用 拉 细 的 巴 氏 德 吸 管 将 卵 母细胞移入 ＶＳ１中５ ｍｉｎ，ＶＳ２ 中 ３０ｓ，用 拉 细 的 巴氏德吸管迅速将卵利用虹吸作用转入冷冻载体
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第 ２９ 卷 第 １ 期
长治医学院学报
Ｖｏｌ．２９ Ｎｏ．１
２０１５年 ２月 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＡＮＧＺＨＩ ＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ Ｆｅｂ． ２０１５
不同冷冻方法对小鼠卵母细胞冻存的影响
李 娜１ 姚 军２＊
摘 要 目的：探讨不同冷冻方法对小鼠卵母细胞存活率及其发育潜能的影响 。方法：采用玻璃化冷 冻技术，选取开放式载体与封闭式载体分别冻存带卵丘细胞（ＣＯＣ）或剥除卵丘细胞（ＯＤ）的小鼠卵丘复 合 体，复苏后分别作体外受精，胚胎培 养。 结 果：开 放 式 载 体 冻 存 组 存 活 卵 数 ７６．７９％ 略 高 于 封 闭 式 载 体 冻 存组７２．９８％，无统计学意义（Ｐ ＞０．０５）；两组内 ＣＯＣ 组的卵子存活率显著高于 ＤＯ 组，但有统计学差异 （Ｐ ＜０．０５），ＣＯＣ 组的受精率、囊胚率略高于 ＤＯ 组，无统计学差异（Ｐ ＞０．０５）。结论：（１）封闭式载体有 效 避 免 了 潜 在 的 污 染 问 题 ，但 不 同 载 体 对 卵 子 存 活 率 无 显 著 影 响 。 （２）卵 丘 细 胞 在 玻 璃 化 冷 冻 卵 母 细 胞 中 可 以 起 到 保 护 作 用 ，并 对 胚 胎 后 期 的 发 育 有 一 定 的 改 善 。
２１５（７６．７９） １４６（５２．３２）
２．４ 体 外 受 精 与 培 养
选取４只成 年 后 的 雄 鼠，取 出 其 每 侧 的 附 睾， 在提前准备好的受精液中用医用注射器划破附睾 的尾部，静置３０ｍｉｎ，然 后 在 浓 度 为 ５％ 的 ＣＯ２ 培 养 箱 中 获 取 足 够 数 量 的 精 子 ，用 上 游 的 办 法 去 处 理 获取的精子，并 调 整 精 子 浓 度，使 其 最 终 浓 度 为 ５ ×１０６／ｍＬ，然后 与 解 冻 后 等 待 启 用 的 卵 子 共 同 培 养。６～８ｈ 后 观 察 受 精 情 况，将 受 精 后 的 鼠 胚 继 续 培 养 ，每 隔 ２４ｈ 观 察 并 记 录 发 育 情 况 ，直 至 囊 胚 的形成。
上，立即放入 液 氮 中 保 存。 如 果 需 要 解 冻 的 时 候， 直 接 取 出 载 体 ，然 后 在 常 温 下 用 最 快 的 速 度 将 解 冻 的卵子移入蔗糖中，蔗糖需要提前３７ ℃预热，配制 蔗糖浓度为 １．０ ｍｏｌ／Ｌ，１ ｍｉｎ 后 再 依 次 移 到 浓 度 分别为 ０．５ ｍｏｌ／Ｌ、０．２ ｍｏｌ／Ｌ 和 ０．１２５ ｍｏｌ／Ｌ 的 蔗糖中，放置３ｍｉｎ，最 后 移 入 已 预 热 的 培 养 液 中， 选择透明带和胞 膜 无 损 伤 的、大 小 正 常、胞 浆 均 质 折光好的进行下一步培养。
表 １ 开 放 式 载 体 与 封 闭 式 载 体 冻 存 对 小 鼠 卵 母 细 胞 的 影 响 例 （％ ）
组别
获卵数
存活数
受精数
开放式
ＯＰＳ－ＭⅡ－ＣＯＣ ＯＰＳ－ＭⅡ－ＤＯ 封闭式 ＣＰＳ－ＭⅡ－ＣＯＣ ＣＰＳ－ＭⅡ－ＤＯ
２８０ ２７９
２８５ ２８９
Ｇｒａｄｕａｔｅ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｇｕｉｌｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ
Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｍｏｕｓｅ ｏｏｃｙｔｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ａｎｄ ｇｒｏｗｔｈ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｍｅｔｈ－ ｏｄｓ：Ｕｓｉｎｇ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｃｈｏｏｓｅ ｏｐｅｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｗｉｔｈ ｅｎｃｌｏｓｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ ｗｅｒｅ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｕｓｅ ｃｕｍｕｌｕｓ－ｏｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌｓ（ＣＯＣ）ｏｒ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｕｍｕｌｕｓ ｃｅｌｌｓ（ＯＤ），ａｆｔｅｒ ｒｅｃｏｖｅｒｙ，ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｃａｒｒｉｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｌｉｖｅ ｅｇｇ ｎｕｍｂｅｒ ｇｒｏｕｐ ７６．７９％，ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ７２．９８％ ｅｎｃｌｏｓｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ ｈａｄ ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ（Ｐ ＞０．０５）；Ｉｎ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｈｅ ＣＯＣ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ＤＯ ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｅｇｇｓ，ｓｔａｔｉｓ－ ｔｉｃａｌｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ（Ｐ ＜０．０５）．Ｔｈｅ ＣＯＣ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｒａｔｅ，ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ ｒａｔｅ ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ＤＯ，ｎｏ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ ＞０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：（１）ｔｈｅ ｅｎｃｌｏｓｅｄ ｃａｒｒｉｅｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｖｏｉｄｓ ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｂｌｅｍｓ，ｂｕｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｒｉｅｒ ｏｎ ｅｇｇｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ．（２）ｃｕｍｕｌｕｓ－ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｏｏｃｙｔｅｓ ｐｌａｙ ａｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ，ａｎｄ ｆｏｒ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌ－ ｏｐｍｅｎｔ ｈａｓ ｃｅｒｔａｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｒｅｅｚｉｎｇ；ｏｏｃｙｔｅｓ；ｇｒａｎｕｌｏｓａ ｃｅｌｌｓ
玻 璃 化 冷 冻 保 存 技 术 由 于 具 有 冻 融 损 伤 小 、操 作 简 便 等 特 点 ，已 经 成 为 最 具 应 用 前 景 的 冷 冻 保 存 技术。 卵 子 是 人 体 最 大 的 细 胞，结 构 复 杂，冷 冻 极 易 损 伤 ，玻 璃 化 冷 冻 技 术 应 用 于 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存能获得较好的 存 活 率、受 精 率 以 及 卵 裂 率，因 此 被认为是有 效 冻 存 卵 母 细 胞 的 方 法 之 一 。 ［１］ 卵 母 细 胞 的 冻 融 结 果 受 以 下 几 方 面 因 素 的 影 响 ：卵 母 细 胞本身质量的好 坏、冷 冻 保 护 剂 浓 度 的 大 小、卵 母 细 胞 在 平 衡 液 与 冷 冻 保 护 液 中 的 时 间 长 短 、冷 冻 载 体的选择、降温速 率 的 大 小、冷 冻 前 颗 粒 细 胞 是 否 去除等 。 ［２］ 卵母细胞周围包围了颗粒卵丘细 胞，颗 粒 细 胞 加 速 了 卵 子 的 成 熟 ，对 信 息 的 传 递 和 营 养 物
关 键 词 玻 璃 化 冷 冻 ；卵 母 细 胞 ；颗 粒 细 胞
中 图 分 类 号 Ｒ３１８．５２ 文 献 标 志 码 Ａ 文 献 编 号 １００６－（２０１５）０１－０１４－０３
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｆｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｏｏｃｙｔｅｓ Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖｅｄ Ｌｉ Ｎａ，Ｙａｏ Ｊｕｎ
作者单位 １ 桂林医学院研究 生 院（５４１００４） ２ 桂 林 医 学 院 附 属 医 院生殖中心 ＊ 通信作者（Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｌｙａｏｊｕｎ１２３＠１２６．ｃｏｍ）
质 的 供 给 都 有 着 非 常 关 键 的 作 用 ，但 是 颗 粒 细 胞 能 否对冻融卵子的 结 果 有 所 改 善，目 前 无 一 致 结 论， 各种研究结 果 存 在 较 大 差 异 。 ［３］ 本 研 究 以 小 鼠 为 模 型 ，探 讨 采 用 玻 璃 化 冷 冻 技 术 选 用 开 放 式 载 体 和 封 闭 式 载 体 冻 存 卵 母 细 胞 中 存 活 率 的 对 比 ，及 有 无 卵丘细胞对冻融 结 果、后 期 发 育 的 影 响，为 改 善 人 类卵母细胞的冷冻技术提供参考。
２．２ 分 组
将促排卵获得的成熟卵母细胞随机分为４组： 采用开放式载体冻存的带完整卵丘细胞的卵母细 胞组（ＯＰＳ－ＭⅡ－ＣＯＣ）和 被 拆 除 卵 丘 细 胞 的 裸 卵 组 （ＯＰＳ－ＭⅡ－ＤＯ）；采 用 封 闭 式 载 体 冻 存 的 带 完 整 卵 丘 细 胞 的 卵 母 细 胞 组 （ＣＰＳ－ＭⅡ－ＣＯＣ）和 被 拆 除 卵 丘 细 胞 的 裸 卵 组 （ＣＰＳ－ＭⅡ－ＤＯ）。