提高缺氧耐受力功能评价方法(征求意见稿)及修订说明
功能范围调整方案起草说明（上网征求意见）
关于《保健食品功能范围调整方案(征求意见稿)》有关情况的说明为贯彻落实《食品安全法》及其实施条例对保健食品实行严格监管的要求，严格保健食品准入管理，切实提高准入门槛，自2009年2月以来，国家食品药品监督管理局（下称国家局）组织开展了调整保健食品功能范围、提高保健食品功能评价方法的各项工作，并形成了《保健食品功能范围调整方案（征求意见稿）》。
现将有关情况说明如下：一、工作开展情况根据国家局工作要点和工作安排，主要从以下两个方面展开保健食品功能范围调整工作以及功能学评价程序与检验方法的修订工作。
一是深入调研，反复论证。
根据监管工作实际和社会各界反映，从2009年2月开始，国家局食品许可司（现已更名为保健食品化妆品监管司，下称保化司）先后组织召开了20次专家、监管部门和企业座谈会、研讨会，主要邀请了食品科学与工程、公共卫生与预防医学、中医学、中西医结合、药学、中药学、临床医学等相关领域的专家，以及部分国内大、中型保健食品生产企业和有关研发企业，就保健食品功能设置和调整的原则、功能范围及其合理性、保健食品功能评价方法及相关指标、判断标准的科学性等方面进行了深入调研、研讨。
在此期间，很多专家、企业和行业协会对功能调整思路、改进方法和判断标准等提出了很多意见和建议，特别是对拟取消的功能，企业非常关注。
国家局保化司会同国家局保健食品审评中心，对保健食品功能设置原则、功能调整原则以及功能调整的思路与部分专家、企业和行业协会进行了反复、深入的交流和讨论，充分考虑了《食品安全法》及其实施条例对保健食品实行严格监管的要求和当前保健食品监管工作实际，从保障公众饮食安全、维护社会稳定的高度，统一思想，提高认识。
大家普遍认为，既要采取果断措施，该取消的功能坚决取消，又要做到平稳过渡，逐步推进，重在改进和完善评价方法，提高判断标准。
经反复修改，数易其稿，形成了《保健食品功能范围调整方案（征求意见稿）》，该方案得到了绝大多数专家、监管部门、企业以及行业协会的认同。
提高缺氧耐受力功能评价方法及修订说明
提高缺氧耐受力功能评价方法(征求意见稿)及修订说明(总14页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--附件5：提高缺氧耐受力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目体重常压耐缺氧实验：存活时间常压缺氧模型实验：红细胞数和血红蛋白，丙二醛（MDA），总抗氧化能力（T-AOC）亚硝酸钠中毒缺氧实验：缺氧损伤实验: 高铁血红蛋白含量（MetHb）缺氧存活实验: 存活时间2 试验原则所列指标均为必做项目3 结果判定常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒缺氧实验、常压缺氧模型实验三项实验中任两项结果阳性可判定受试样品具有提高缺氧耐受力功能。
其中缺氧存活实验、缺氧损伤实验的结果均为阳性可判定亚硝酸钠中毒缺氧实验结果阳性。
提高缺氧耐受力功能检验方法Method for the Assessment ofEnhancing Anoxia Endurance Function1.常压耐缺氧实验原理缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等主要器官缺氧供能不足而死亡。
材料250mL磨口瓶、秒表、凡士林、钠石灰（或等量氢氧化钠和碳酸钙）。
实验动物推荐用近交系成年小鼠，单一性别，小鼠体重18－22克，每组10-15只。
实验方法剂量和分组至少设三个剂量组，同时设对照组。
以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量的30倍。
受试样品的给予经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。
受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。
实验步骤每日经口灌胃给予受试样品，对照组给予纯净水。
将动物每周称重两次，按体重调整给予受试样品的量。
各组于末次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的250mL磨口瓶内（每瓶1只），用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠死亡的时间。
红景天软胶囊提高缺氧耐受力功能实验研究
受试 液 ，供 各剂 量组灌 胃。对 照组 给予等 体积 动物 食 用油 。每 日灌 胃一 次 ，灌 胃量 为 ０１ ／０ ・ｗ，连 续 ．ｍｌ ｇ ｂ １ ３ 天 。实验期 间动 物 自由摄取 饮水 。每 天观察 动物 的 ０
活动 及生长 情况 。
１５ 仪 器 与 试 剂 ．
次灌 胃后 ｌ ，各 组动 物 自颈 部逐 只断头 ，立 即按秒表 ｈ
ＣＯ Ｅ Ｕ Ｕ Ｕ Ａ Ｙ Ｍ ＹＸ
２ １第 期 总 １ 期 草 业 与 畜牧 ０年 ７ 第８ １ ８
何正 军， 贾国夫 ，尼科 ，郭敏
（ 四川 省 草原 科 学研 究 院 ，四川 成都 ６ １３ ） １ ７ １
摘
要 ：利 用新研 制的红景天软胶囊 ，按照 《 保健食品检验与评价技术规范》进行 了小鼠常压耐缺氧实验、亚硝酸
钠 中毒存活试验和急性脑缺血性缺氧 实验研究 ，结果表明，红景天软胶 囊具有提 高缺氧耐 受力作用，对红景天软胶 囊申
报 保健 食 品 批 准 文号 、投 产 销 售具 有 重要 的 意 义 。 关 键词 ：红 景 天软 胶 囊 ；缺 氧 实验
中图分类号：Ｒ ６ － ９ ５２
文献标识码 ：Ａ
记 录小 鼠断头后 至张 口喘气停止 时 间。
１ ． 统 计 分 析 处 理 ７
电子 天平 、２ ０ｍ 磨 口瓶 、亚 硝 酸钠 、钠 石 灰 、 ５ ｌ 医用 凡 士林 、手术 剪 、秒 表 、镊 子 、药勺 、ｌ ｌ 射 ｍ注
器等 。
１６ 实验 方 法 ．
用 Ｓ Ｓ １ ．软件进 行数 据转化 和统计 分析 。分析 Ｐ Ｓ ０ １ 时 ，先 对数 据进 行方 差齐性 检 验 ，若 方差 齐 ，采 用单
提供 的红景天 软胶囊 ，按 照 《 健食 品检 验 与评 价技 保 术规 范》 要求 ，开展 提 高缺 氧 耐受力 功 能评 价实 验 。 本 文对上 述实验 数据进 行搜 集总 结 ，为促 进川 西北 高 原 红景 天产业 的发展 和红景 天软胶 囊取得 国家 保健食 品批准 文号投产 上市 销售 ，繁荣保 健食 品市场提 供依 据。 １ 材 料与方法
提高缺氧耐受力的红景天口服液的实验评价
ｔ ｉ ｌｇ ａ ａｓｓｍ ｎ ｎｓｆ ｙ ｔｅ ｃ ｔ ｏａ Ｍ Ｄｖｌｅ ｆａ ｎ ｉ ｅ ｒａｅ ｔａ ５ｇ（ 。ｗ． ｏ ｃ ｏｉ ｌ ｓｅｓ ｅｔ ａ ｔ，ｈ ｕｅ ｒ Ｔ ａ ｓ ｔ ａｄｍｃ ｗ ｒ ｇｅｔ ｎ１ ｋ ｂ ） ｘ ｏ ｃ ｏ ｅ ａ ｌ ｕ ｏ ｒｓ ｅ ｅ ｒｈ ／ｇ
ＬＵ Ｈｎ， ｉｃ ｕ ＧＵ ｎ， Ｉ Ｉ ＭＯ Ｌ— ｈ ｎ， Ｏ Ｙａ Ｘ ＡＮＧ Ｊ —ｏ ｇ， Ｅ ａ －ｕ ｉ ｌｎ Ｚ ＮＧ Ｆ ｎ ｊｎ， ｎ （． ｐ ｒ ｎ ｆ ｏ ｄＳ ｉｎ ｅ Ｓｃ ｕ ｎＵ ｉｅｓｔ， ｈ ｎ ｄ １ ０ ５ Ｓｃ ｕ ｎ Ｃ ｉａ ２Ｓｃ ｕ ｎＣ ｎｅ ｒ ｉｅ ｓ １ Ｄｅ ａｔ ｔ ｏ ｃｅ ｃ ， ｉｈ ａ ｎｖ ｒｉ Ｃ ｅ ｇ ｕ６ ０ ６ ， ｉｈ ａ ， ｈｎ ； ．ｉｈ ａ ｅ ｔｒ ｏ ｓａ ｅ ｍｅ ｏ Ｆ ｙ ｆ Ｄ
１ 产 品工艺和配 方
红景天能提 高机体组织 氧的利用率 ， 增加有 氧氧 化 酶 的活性 ， 高机体 的带 氧和供 氧能 力 ， 实现 抗 提 来 缺 氧作 用。在缺 氧环境 枸杞 多糖对心 、 、 、 、 肝 肺 脑 肌组
天甙和酪醇［ １ １ 。红景天具有抗缺氧 、 抗疲 劳翻 等功能 ， 临 床上红景 天可用 于预防高原 反应 的辅 助用 药［ ３ １ 景 。红
当人 体组织得 不到充 足的氧 ， 或不能 充分利 用氧
时， 细胞 、 组织 、 器官 的代 谢 、 能 、 机 甚至形 态结构都 可 能发 生异常变化 ， 这一病 理过程就 称为缺 氧 。缺 氧多 见于 空气 稀薄 的高原地 区 ， 一些低 氧场所 ， 如商场 、 办 公楼 、 铁 、 地 隧道 、 地下设 施等 。一 些特殊人 群也易 发 生缺 氧症 状 ， 如利用 氧 的效率 下 降 的老年 人 、 脑力 劳 动者及运动员 。因此开发具有缺氧耐 受力 的保健食 品 具有重要 的意义 。红景天 为保健食 品可用资 源 ， 景 为 天科红景 天属多 种植物 的根及根茎 ， 主要成 分有红 景
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附件5：提高缺氧耐受力功能评价方法（征求意见稿）保健食品评价试验项目、试验原则及结果判定Items, Principles and Result Assessment1 试验项目1.1 体重1.2 常压耐缺氧实验：存活时间1.3常压缺氧模型实验：红细胞数和血红蛋白，丙二醛（MDA），总抗氧化能力（T-AOC）1.4 亚硝酸钠中毒缺氧实验：1.4.1 缺氧损伤实验: 高铁血红蛋白含量（MetHb）1.4.2 缺氧存活实验: 存活时间2 试验原则所列指标均为必做项目3 结果判定3.1常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒缺氧实验、常压缺氧模型实验三项实验中任两项结果阳性可判定受试样品具有提高缺氧耐受力功能。
3.2其中缺氧存活实验、缺氧损伤实验的结果均为阳性可判定亚硝酸钠中毒缺氧实验结果阳性。
提高缺氧耐受力功能检验方法Method for the Assessment ofEnhancing Anoxia Endurance Function1.常压耐缺氧实验1.1 原理缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等主要器官缺氧供能不足而死亡。
1.2 材料250mL磨口瓶、秒表、凡士林、钠石灰（或等量氢氧化钠和碳酸钙）。
1.3 实验动物推荐用近交系成年小鼠，单一性别，小鼠体重18－22克，每组10-15只。
1.4 实验方法1.4.1 剂量和分组至少设三个剂量组，同时设对照组。
以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量的30倍。
1.4.2受试样品的给予经口灌胃给予受试样品，无法灌胃时将受试样品掺入饲料，并记录每只动物的饲料摄入量。
受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。
1.4.3 实验步骤每日经口灌胃给予受试样品，对照组给予纯净水。
将动物每周称重两次，按体重调整给予受试样品的量。
各组于末次灌胃后1小时，将各组小鼠分别放入盛有5g钠石灰的250mL磨口瓶内（每瓶1只），用凡士林封瓶口，盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，记录小鼠死亡的时间。
1.4.4 检测指标小鼠因缺氧而死亡的时间。
1.5 数据处理数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值>F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
1.6 结果判定受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。
1.7 注意事项：1.7.1每个磨口瓶内只放1只小鼠。
1.7.2磨口瓶一定要密闭封严，以防漏气，否则会影响实验结果。
1.7.3磨口瓶必须等容量(误差 1ml)，实验前先用水加以校正。
1.7.4每批实验动物的体重应尽量保持一致。
2 常压缺氧损伤模型实验2.1 原理在总大气压保持不变的情况下，降低空气中氧的百分含量，机体吸入氧量降低，导致血液中氧含量降低，组织细胞不能从血液中获得充足的氧而使能量代谢障碍，导致重要脏器组织细胞的损伤。
2.2 仪器低氧分压呼吸效应实验系统、血细胞分析仪、可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器。
2.3 实验动物推荐用近交系成年小鼠，单一性别，体重18－22g，每组10-15只。
2.4 实验方法2.4.1 剂量和分组至少设三个剂量组，同时设阴性对照组和模型对照组二个对照组。
以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，最高剂量不得超过人体推荐量的30倍。
2.4.2受试样品的给予经口灌胃给予受试样品，受试样品给予时间30天，必要时可以延长至45天。
2.4.3 实验步骤2.4.3.1造模方法每日经口灌胃给予受试样品，阴性对照组和模型对照组给予同等容量溶剂。
将动物每周称重两次，以调整受试样品剂量。
每次给予样品后，将模型对照组与各剂量组的实验动物依次放入常压缺氧装置中，通过充入氮气方法把装置内的氧含量从21%大气氧含量调整下降至10.0±0.5 % 氧含量，维持此低氧含量处理样品组和模型对照组动物6～8 h/天，每周5～6次，连续2～3周。
末次缺氧处理后，采血并取脑进行各项指标的检测。
2.4.4指标检测体重、血红蛋白含量（Hb）、脑匀浆丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）。
2.4.4.1血红蛋白含量测定方法EDTA·K2能与血液中的钙离子结合成为螯合物，从而阻止血液凝固，全血抗凝后用一般血常规检验的血细胞分析仪检测(仪器法)。
2.4.4.1.1试剂配制乙二胺四乙酸二钾（EDTA·K2·2H2O，MW404.47）,称量8mg EDTA·K2加纯净水至100ml制成抗凝剂，50μl抗凝剂可抗凝1ml小鼠全血。
1.5～2.2mg的EDTA·K2可阻止1ml血液凝固。
2.4.4.1.2 采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干净无菌的眼科镊子摘取小鼠一侧或双侧眼球，让血液自由滴入装有抗凝剂的1.5ml离心管（或商品化的抗凝管）中，采血过程中不断混匀血液与抗凝剂防止血液凝固，每只动物采集抗凝全血约1ml。
2.4.4.1.3 检测分析上机前血液颠倒混匀，注意检查是否存在凝块。
在24h内以全血细胞分析仪检测血液红Hb。
上机操作参照仪器说明书。
2.4.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定2.4.4.2.1 原理MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。
1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。
该物质在波长532nm有极大吸收峰。
可用分光光法进行测定。
2.4.4.2.2试剂0.2M乙酸盐缓冲液pH3.50.2M乙酸溶液185mL0.2M乙酸钠溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸钠SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸盐缓冲液pH7.40.2M磷酸氢二钠1920mL0.2M 磷酸二氢钾480mL2.4.4.2.3 实验步骤2.4.4.2.3.1 样品制备组织匀浆样品：取一定量的大脑组织，生理盐水冲洗、拭干、称重，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min，取上清液待测。
2.4.4.2.3.2样品测定试剂空白管样品管标准管10％脑组织匀浆0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS 0.2mL 0.2mL 0.2mL0.2M乙酸盐缓冲液 1.5mL 1.5mL 1.5mL0.8%TBA 1.5mL 1.5mL 1.5mLH2O 0.8mL 0.7mL 0.7mL混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行2.4.4.2.3.3计算B - A B- A 1过氧化脂质含量＝————×C×K = ———×40×————————（nmol/mg组织） F - A F - A 0.2×10%×1000A: 空白管吸光度B：样品管吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）K：稀释倍数2.4.4.3 组织中总抗氧化能力（T-AOC）测定方法2.4.4.3.1 原理机体中有许多抗氧化物质，能使Fe2+还原成Fe3+，后者可与菲啉类物质形成稳定的橙黄色络合物，通过在520nm比色可测出其抗氧化能力的高低。
2.4.4.3.2 试剂采用商品试剂盒：抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒。
2.4.4.3.3 样品制备准确称取脑组织重量，按重量体积比加9倍生理盐水，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），2000～2500r/min 离心10min，取上清液待测。
同时用双缩脲试剂测定10%脑组织匀浆蛋白。
2.4.4.3.4 样品测定：按试剂盒的操作要求进行。
如：试剂对照管（mL）样品管（mL）10％脑组织匀浆ａ*试剂一 1.0 1.0试剂二 2.0mL 2.0mL试剂三应用液0.5mL 0.5mL漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟试剂四0.2mL 0.2mL待测样本ａ*试剂五0.2 mL 0.2 mL混匀，放置10分钟，蒸馏水调零1cm光径，520nm测各管吸光度。
* 参考取样量：10%组织匀浆参考取样量：0.1～0.2ml2.4.4.3.5计算OD U-OD C总抗氧化能力＝——————÷30×N÷C prot（单位/mg蛋白） 0.01OD U: 测定管吸光度OD C：对照管吸光度N：反应体系稀释倍数（反应液总体积/取样量）C prot：稀释倍数待测样本蛋白浓度（mg/ml）2.5 数据处理数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。
方差齐，计算F值，F值< F0.05，各组均数间差异无显著性；F值>F0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
2.6 结果判定模型对照组与阴性对照组比较， Hb、MDA升高、T-AOC含量降低有统计学显著性意义（P<0.05），表示模型成立。
在模型成立的前提下，受试样品组MDA含量降低或T-AOC含量升高有统计学意义（P<0.05），且Hb＜210g/L，判定该项实验结果阳性。
注: 红细胞增多症评价标准参考值Hb＞210g/L。
3 亚硝酸钠中毒缺氧实验3.1 原理亚硝酸钠使二价铁血红蛋白转变为三价铁血红蛋白，生成高铁血红蛋白（MetHb），破坏血红蛋白携氧能力，造成组织细胞缺氧，随着亚硝酸钠剂量的增加，MetHb含量增加，导致组织缺氧直至死亡。
3.2 实验动物推荐使用近交系成年雄性小鼠，体重18～22g，每组10～15只。
3.3 材料亚硝酸钠, 20μl毛细管, 1ml注射器，秒表。
3.4 剂量分组实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组。