色谱分离过程

伯乐公司（BIO-RAD）柱层析系统
发玛西亚公司（Pharmacia）柱层析系统
国产柱层析系统
二、 色谱分离过程的基本原理
1 分离原理 色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异。 色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异。 以吸附色谱为例见图示 吸附→ 解吸→再吸附 再解吸 反复多次洗脱 反复多次洗脱→ 吸附 解吸 再吸附 →再解吸 →反复多次洗脱 被测组分分配系数不同→ 被测组分分配系数不同 差速迁移 → 分离
四、色谱分离过程基础理论
1保留值 保留值 试样中各组分在色谱柱中停留时间值或将组分带出色谱柱 所需流动相的体积值称为保留值。 所需流动相的体积值称为保留值。 1) 保留时间 ：从进样至被测组分出现浓度最大值时所需时 间 tR。 保留体积： 2) 保留体积：从进样至被测组分出现最大浓度时流动相通过 的体积， 的体积，VR。 死时间：不被固定相滞留的组分， 3) 死时间：不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大 值时所需的时间称为死时间(dead time)， 值时所需的时间称为死时间(dead time)，tM。 死体积: 不被固定相滞留的组分， 4) 死体积: 不被固定相滞留的组分，从进样至出现浓度最大 值时流动相通过的体积称为死体积(dead 值时流动相通过的体积称为死体积(dead volume) ，VM。
2分离度 分离度 相临两组分间峰顶间距离除以此两峰底宽的平均 值,衡量色谱分离条件优劣的参数 衡量色谱分离条件优劣的参数
保留值之差（ 保留值之差 （ 峰顶间距 t R 2 − t R1 ） R= = W1 + W2 峰宽和之半 2
2( t R 2 − t R1 ) R= W1 + W2
3柱效率 柱效率 塔板理论认为，一根柱子可以分为n 塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内 组分在两相间很快达到平衡， 组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块 理论塔板。设柱长为L 理论塔板高度为H 理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则 H=L/n 式中n为理论塔板数。 式中n为理论塔板数。 理论塔板数可根据色谱图上所测得的保留时间（t 理论塔板数可根据色谱图上所测得的保留时间 R） 按下式计算： 和峰宽（w）或半峰宽 wh/2 ）按下式计算： 或半峰宽（ 和峰宽 或半峰宽 按下式计算
分配系数的微小差异→ 分配系数的微小差异 吸附能力的微小差异 微小差异积累→较大差异 微小差异积累 较大差异 →吸附能力弱的组分先流出； 吸附能力弱的组分先流出； 吸附能力弱的组分先流出 吸附能力强的组分后流出
2 固定相（色谱柱填料 固定相（色谱柱填料) 硅胶衍生的固定相 离子交换树脂 大孔吸附树脂 凝胶 手性固定相
层析柱——径高比（10：1—1：100）、材质（玻璃、有 径高比（10： ）、材质 层析柱 径高比 1 100）、材质（玻璃、 机玻璃、PVC、不锈钢等）、耐压（0.05－ MPa ）、耐压 Pa） 机玻璃、PVC、不锈钢等）、耐压（0.05－10 MPa） 等
工业用的层析柱 实验室用的层析柱
——恒速 压力（蠕动泵等） 恒速、 泵——恒速、压力（蠕动泵等）
a:吸附剂 a:吸附剂
m:流动相 m:流动相
Xm: Xm: 流动相中的组分分子
Xa: Ym: Ya: Xa: 固定相中组分的分子 Ym:流动相分子 Ya:固定相中溶剂分子
吸附过程是试样中组分分子与流动相分子争夺吸附剂表 面活性中心的过程。 面活性中心的过程。
固定相 固定相是表面具有许多吸附中心的吸附剂， 固定相是表面具有许多吸附中心的吸附剂，常用 吸附剂硅胶表面的硅醇基为吸附中心。经典液相 吸附剂硅胶表面的硅醇基为吸附中心。 柱色谱和薄层色谱使用一般硅胶， 柱色谱和薄层色谱使用一般硅胶，高效液相色谱 常用球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。 常用球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。 （1）对吸附剂的要求 ） 有大的表面积和足够的吸附能力； ①有大的表面积和足够的吸附能力； 对不同的化学成分有不同的吸附力， ②对不同的化学成分有不同的吸附力，能较好地 把混合物分开； 把混合物分开； 与流动相、溶剂及样品中各成分不起化学反应； ③与流动相、溶剂及样品中各成分不起化学反应； 在所用的溶剂及流动相中不溶解； ④在所用的溶剂及流动相中不溶解； 颗粒均匀，操作过程中不会碎裂。 ⑤颗粒均匀，操作过程中不会碎裂。
C.薄层色谱法 (thin-layer chromatography, TLC) 薄层色谱法 薄层色谱法是将适当粒度的吸附剂作为固定相涂 布在平板上形成薄层， 布在平板上形成薄层，然后用与纸色谱法类似的 方法操作以达到分离目的。 方法操作以达到分离目的。
3）、按分离原理分类 ）、按分离原理分类 ）、 按色谱法分离所依据的物理或物理化学性质的不 又可将其分为： 同，又可将其分为： 1.吸附色谱法 吸附色谱法 2.分配色谱法 分配色谱法 3.离子交换色谱法 离子交换色谱法 4.尺寸排阻色谱法 尺寸排阻色谱法 5.亲和色谱法 亲和色谱法
B.纸色谱法（paper chromatography） 纸色谱法（ 纸色谱法 ） 纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体， 纸色谱法是利用滤纸作固定液的载体，把试样点 在滤纸上，然后用溶剂展开， 在滤纸上，然后用溶剂展开，各组分在滤纸的不 同位置以斑点形式显现， 同位置以斑点形式显现，根据滤纸上斑点位置及 大小进行定性和定量分析。 大小进行定性和定量分析。
（2）吸附剂的类别 ） 淀粉、葡萄糖、聚酰胺、 ①有机类 淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纤维素等 氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、 ②无机类 氧化铝、硅胶、活性炭、碳酸钙、 硅藻 土等
流动相 （1）要求 ） 应使用较纯试剂， ①应使用较纯试剂，含杂质会影响洗脱能力 ②与样品或吸附剂不发生化学反应 能溶解样品中各成分，且各被分离组分有不同的K值 ③能溶解样品中各成分，且各被分离组分有不同的 值 粘度小， ④粘度小，易流动
色谱流程及 主要部件
操作术语： 操作术语： 洗脱剂——作为流动相的液体。 作为流动相的液体。 ①洗脱剂 作为流动相的液体 ②层析剂——分离技术中的固定相 层析剂 分离技术中的固定相 展开——加入洗脱剂而使各组分分层的操作。 加入洗脱剂而使各组分分层的操作。 ③展开 加入洗脱剂而使各组分分层的操作 色谱图——展开后各组分的分布情况。 展开后各组分的分布情况。 ④色谱图 展开后各组分的分布情况 洗脱液——洗脱时从柱中流出的溶液。 洗脱时从柱中流出的溶液。 ⑤洗脱液 洗脱时从柱中流出的溶液
1.吸附色谱法 ( adsorption chromatography ) 吸附色谱法 利用吸附剂表面对不同组分物理吸附性能的差别 而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。 而使之分离的色谱法称为吸附色谱法。
分离原理 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心,利 各组分与流动相分子争夺吸附剂表面活性中心 利 用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离. 用吸附剂对不同组分的吸附能力差异而实现分离 经过吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物 经过吸附、解吸、再吸附、再解吸 最后混合物 得到分离. 得到分离
蠕动泵
馏分收集仪
自动馏分收集仪（国产） 自动馏分收集仪（进口）
检测仪 通用型—示差折光 介电常数、 示差折光、 1) 通用型 示差折光、介电常数、电导等 专用型—紫外 荧光、 紫外、 2) 专用型 紫外、荧光、放射性检测器等 记录仪、 工作站—色谱参数的选择和设定 色谱参数的选择和设定、 记录仪 、 工作站 色谱参数的选择和设定 、 自动化 操作、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、 操作、色谱数据的采集和存储，并作实时处理、 数据后处理、 数据后处理、自动打印出一套完整的色谱分析数 据……
第11章 色谱分离过程 章 chromatography
一、 概述
定义： 定义： 色谱是根据混合物中， 色谱是根据混合物中，溶质在互不混溶的两相 之间分配行为的差别， 之间分配行为的差别，引起移动速度的不同而进 行分离的方法。 行分离的方法。
典型的柱层 析分离设备
起源
几个概念 色谱柱：进行色谱分离用的细长管。 色谱柱：进行色谱分离用的细长管。 固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。 固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。 流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。 流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。
2）、 按固定相的几何形式分类 ）、 A 柱色谱法 B 纸色谱法 C 薄层色谱法
A.柱色谱法 (column chromatography) 柱色谱法 柱色谱法是将固定相装在一金属或玻璃柱中或是将 固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱， 固定相附着在毛细管内壁上做成色谱柱，试样从柱 头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。 头到柱尾沿一个方向移动而进行分离的色谱法。
3 色谱柱及柱技术 色谱柱的装填方法： 色谱柱的装填方法： 高压均浆填充 干法填充 径向压缩法 轴向压缩法 环形压缩技术
三、色谱分离过程和色谱图
图1 色谱过程
图2 色谱图
Fra Baidu bibliotek
1 色谱图（chromatogram） 色谱图（ ） 试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时， 试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时， 检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号， 检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号， 由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号 时间曲线或信号——流动相 由记录仪所记录下的信号 时间曲线或信号 流动相 体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图2 体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图 常用术语： 常用术语： 1. 基线 在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出 在操作条件下， 曲线。 曲线。 2. 色谱峰 当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小 当组分随流动相进入检测器时， 随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。 随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。 3. 峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高 峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peak height)。用h表示。 表示。 。 表示 4. 峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积 峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面积(peak area)，用 ， A表示。 表示。 表示
加样， 加样，洗脱剂冲洗 各组分与固定相无作用力——与 与 各组分与固定相无作用力 洗脱剂一起流动，得不到分离； 洗脱剂一起流动，得不到分离； 各组分与固定相有一定作用力— 各组分与固定相有一定作用力 —移动速率低于流动相。 移动速率低于流动相。 移动速率低于流动相 各组分与固定相的作用力大小不 移动速率不同， 同——移动速率不同，作用力大， 移动速率不同 作用力大， 移动慢，各组分得到分离。 移动慢，各组分得到分离。
tR 2 或 n = 16( ) W
tR 2 n = 5.54( ) Wh
2
有效塔板数（neff）
neff
t 'R 2 t 'R 2 = 5.54( ) = 16( ) wh / 2 w
来评价柱的效能比较符合实际。 用有效塔板数（neff）来评价柱的效能比较符合实际。
五、 色谱的分类
1）、按两相所处的状态分类 ）、按两相所处的状态分类 ）、
洗脱顺序 流动相的洗脱能力主要由其极性决定， 流动相的洗脱能力主要由其极性决定，极性强的流动相分 子占据极性中心的能力强，洗脱能力就强。 子占据极性中心的能力强，洗脱能力就强。流动相的选择 要依据样品的极性、吸附剂的活性而定。 要依据样品的极性、吸附剂的活性而定。吸附弱的组分先 被洗脱，吸附强的组分后被洗脱。 被洗脱，吸附强的组分后被洗脱。吸附的强弱与组分的性 极性、 质(极性、取代基的类型和数目、构型）有关。 极性 取代基的类型和数目、构型）有关。 一般规律是： 一般规律是： 非极性化合物，吸附弱。 ①非极性化合物，吸附弱。 基本母核相同，分子中取代基的极性越强， ②基本母核相同，分子中取代基的极性越强，或极性基团越 分子极性越强(但要考虑其他因素的影响 但要考虑其他因素的影响)， 多，分子极性越强 但要考虑其他因素的影响 ，吸附能力 越强。 越强。 分子中双键数越多，则吸附力越强。 ③分子中双键数越多，则吸附力越强。 能形成分子内氢键的化合物，其吸附能力降低。 ④能形成分子内氢键的化合物，其吸附能力降低。