蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题解析
2024届新高考生物(选考)专题5 生物技术与工程 重点小专题14 基因工程
基因工程
考点一 基因工程 考点二 蛋白质工程 备用习题
网 络 构 建
1.判断有关基因工程和蛋白质工程说法的正误
高 (1)DNA连接酶作用的底物可以是DNA片段,也可以是单个核苷酸。 (×)
频 (2)用限制酶处理目的基因和Ti质粒,涉及氢键和磷酸二酯键的断裂。 ( √ )
易 错
(3)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。( ×)
料仅指四种脱氧核苷酸。
(4)利用PCR扩增目的基因时,不需要知道目的基因的全部碱基序列。 (√ )
(5)PCR过程中,模板DNA和引物能在每一次扩增中重复使用。 (×)
高 频
(6)PCR扩增区域由2个引物来决定。
(×)
易 (7)耐高温的DNA聚合酶只能从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。 (× )
错 ●
是3'→5',非模板链(也就是a链)是5'→3';DNA复制中子链延伸方向为5'→3',故引物方向为
5'→3',所以F1配对的单链是3'→5'的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
考点一
(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是
否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了J-V5融合蛋白,
错 ●
(3)利用PCR技术扩增抗虫基因时,PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。(√ )
考 前
[解析] (1)PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行,需提供DNA模板、2种引物、
清 四种脱氧核苷酸及耐高温的DNA聚合酶等。
零 (2)PCR过程中不需要解旋酶,DNA解旋是在高温下实现的,并且PCR需要的原
重组质粒的构建经验 [技巧]
![重组质粒的构建经验 [技巧]](https://img.taocdn.com/s3/m/f026746187c24028915fc3fa.png)
重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
重组蛋白表达技术的使用中常见问题
重组蛋白表达技术的使用中常见问题蛋白质是生命体内重要的组成部分，它们参与了几乎所有的生物过程。
为了研究和利用蛋白质的功能，科学家们通过重组蛋白表达技术来大量产生目标蛋白。
然而，在使用重组蛋白表达技术的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将详细探讨重组蛋白表达技术使用中的一些常见问题，并提供相应的解决方法。
1. 表达水平低在使用重组蛋白表达技术时，常常会遇到表达水平低的问题。
低表达水平可能由多种原因引起，包括启动子的活性不足、转录过程中的阻塞或降解、翻译后期的限制以及蛋白质的不稳定性等。
解决方法：- 优化启动子选择：选择活性较高的启动子，如T7、CMV或SP6启动子。
- 优化培养条件：优化培养基组分、培养温度、表达宿主菌的载体拷贝数等，以提高蛋白表达水平。
- 优化转化方法：尝试使用电转化、化学转化或峰值冲击转化等方法来提高表达宿主菌的转化效率。
- 优化培养时间：延长培养时间，以便提高目标蛋白的表达水平。
2. 目标蛋白形成包含体在表达过程中，目标蛋白常常形成包含体（inclusion body），即蛋白质以不溶性的聚集体形式存在。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养温度、培养基成分，提高溶解蛋白的折叠效率。
- 引入辅助蛋白质：结合引入辅助蛋白质的策略，帮助目标蛋白的正确折叠和溶解。
- 进行亲和纯化：通过抗标签或亲和层析等技术，将包含体中包含的目标蛋白从非特异性蛋白质中进行纯化。
3. 目标蛋白磷酸化或糖基化不足重组蛋白质常常需要进行修饰，包括磷酸化和糖基化等。
然而，有时目标蛋白表达后，修饰的程度不足，影响功能和稳定性。
解决方法：- 优化培养条件：调整培养基中相关原料的浓度，如添加合适的磷酸盐或糖类物质，促进修饰的进行。
- 引入修饰相关基因：将相关调控基因引入到表达宿主菌中，提高修饰相关酶的表达水平。
- 转化进化系统：构建具有修饰相关基因的酵母或细菌转化进化系统，通过长时间的适应培养，提高修饰效率。
4. 目标蛋白的折叠和稳定性问题有些目标蛋白在表达和纯化过程中容易失去活性或不稳定。
2022届高考生物一轮复习第十一单元现代生物科技专题第37讲基因工程作业含解析苏教版
第37讲基因工程1．下列关于各种酶的叙述，不正确的是( )A．DNA连接酶能将2个具有末端互补的DNA片段连接在一起B．PCR反应体系中的引物可作为DNA聚合酶作用的起点C．限制性内切酶可识别一段特殊的核苷酸序列，并在特定位点切割D．原核细胞RNA聚合酶以RNA为模板合成互补RNA解析：DNA连接酶能将2个具有末端互补的DNA片段连接在一起，形成磷酸二酯键，A正确；在PCR技术中，DNA聚合酶与引物结合后，才能将单个的脱氧核苷酸加到模板链上，因此引物可作为DNA聚合酶作用的起点，B正确；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，C正确；原核细胞转录时，RNA聚合酶以DNA为模板合成互补RNA，D错误。
答案：D2．2015年诺贝尔化学奖颁给了研究DNA修复细胞基质的两位科学家，细胞通过DNA损伤修复可使DNA(基因)在复制过程中受到损伤的结构大部分得以恢复，如图为其中的一种方式——切除修复过程示意图。
下列有关叙述不正确的是( )A．图示过程的完成，可能需要多种酶的共同作用B．图中二聚体的形成可能是物理化学等因素的作用C．该修复过程遵循碱基互补配对原则D．对DNA(基因)的损伤修复，从生物变异角度看属于基因重组解析：图示过程的完成需要限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等的共同作用，A正确；二聚体的形成可能是受环境因素的影响，如物理、化学等因素，B正确；在两个胸腺嘧啶脱氧核苷酸封闭缺口的过程中利用了碱基互补配对原则，C正确；修复过程的变化不属于生物变异，D错误。
答案：D3．利用人胰岛B细胞构建cDNA文库，然后通过核酸分子杂交技术从中筛选目的基因，筛选过程如下图所示。
下列说法错误的是( )A．cDNA文库的构建需要用到逆转录酶B．cDNA文库的基因数目比基因组文库的基因数目少C．核酸分子杂交的原理是碱基互补配对D．从该文库中可筛选到胰高血糖素基因解析：cDNA是以mRNA为模板，经逆转录酶催化形成的，故cDNA文库的构建需要用到逆转录酶，A正确；由于cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因，故两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，B正确；核酸分子杂交的原理是碱基互补配对，C正确；胰岛B细胞内的胰高血糖素基因不表达，所以从胰岛B细胞内提取不到胰高血糖素基因的mRNA，无法逆转录形成胰高血糖素基因的cDNA，故不能从利用人胰岛B细胞构建的cDNA文库中筛选到胰高血糖素基因，D错误。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
重组质粒的构建酶切应注意的问题
（转）重组质粒的构建酶切应注意的问题重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下：1) 克隆基因的酶切位点问题2) 载体酶切的问题3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行；而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DN 段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4NdeI 6NheI 3NotI 8PmeI 6SacI 3SalI 3SmaI 3HindIII 3BstI 8SphI 4XhoI 3XbaI 3SmaI 4案例分析一：本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
后查文献得知症结所在，在NdeI序列后加上六个保护碱基后，迎刃而解。
大家引以为戒啊。
现在普通酶我都引入三个保护碱基。
现在碱基合成价格也不贵了，为保证酶切充分，连接顺利，不用节约那点钱，再说若一次不成功，重复实验花费时间与金钱更多，孰利孰弊，不言自明。
蛋白质表达与纯化常见问题解答
蛋白质表达与纯化常见问题解答蛋白质表达与纯化是生物科学研究中常见的实验技术，用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等。
然而，在进行蛋白质表达与纯化实验时，常常会遇到一些问题。
本文将针对蛋白质表达与纯化过程中的常见问题进行解答，帮助读者更好地进行实验和解决实验中可能遇到的困难。
一、蛋白质表达问题解答1. 为什么我的目的蛋白质在大肠杆菌中表达得不好？蛋白质表达的成功与多种因素相关，包括宿主菌的选择、启动子的选择、表达载体的构建等。
首先，确认宿主菌是否合适，某些蛋白质可能需要使用其他细菌或真核细胞进行表达。
其次，选择合适的启动子和表达载体，确保表达水平能够满足需求。
另外，光照条件、温度、培养基的选择等也会对表达效果产生影响。
2. 我应该选择哪种表达载体？选择表达载体应根据实验需求来定。
一般来说，常用的表达载体有质粒和病毒载体。
质粒表达系统适用于小规模表达和纯化，而病毒载体表达系统适用于大规模表达和高效表达。
另外，如果需要对蛋白质进行特定修饰，如标记或融合蛋白表达，可选择相应的表达载体。
3. 如何对表达后的蛋白质进行检测？常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE、Western blot和质谱分析等。
SDS-PAGE能够分析蛋白质的分子量和纯度，Western blot可以检测特定蛋白质的表达水平，质谱则可以确定蛋白质的分子量和结构。
根据实验需求选择合适的方法进行检测。
二、蛋白质纯化问题解答1. 我应该选择哪种纯化方法？选择纯化方法取决于蛋白质的性质和需求。
常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
亲和层析适用于具有特异结合能力的配体，离子交换层析适用于根据蛋白质电荷差异进行分离，凝胶过滤层析适用于根据蛋白质的分子量进行分离。
根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。
2. 如何确定纯化效果？纯化效果可通过测定蛋白质的比活性、比强度和纯度来确定。
比活性和比强度分别指的是单位反应物质的相应活性或强度，纯度则指的是蛋白质在总样品中所占的比例。
原核表达系统蛋白表达问题解析
活性蛋白整体方案原核表达系统蛋白表达问题解析摘要：本文主要对原核蛋白表达纯化体系中的常见问题进行收集整理，并附有解决思路和相应的实际操作。
外源DNA片段成功插到载体里面（PCR鉴定），但无法表达蛋白一般判断目的基因是否表达，首先要进行SDS-PAGE检测。
跑胶的时候一定要设对照：Marker，标准品阳性对照，以及空白载体(诱导)和重组载体(不诱导)2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。
跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做western blot了。
银染的灵敏度在0.1～1ng；或是Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western blot。
在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要先判断载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。
其次要对测序结果进行确定，确定插入的每个碱基都是正确的，没有意外终止的情况。
最后，也需要注意基因中是否有稀有密码子，可更换表达菌株。
每种菌株都有自己独特的设计，或者是蛋白酶缺陷，或者是重组酶缺陷，改造的目的都是为了让质粒在细菌中存在更稳定，表达的产物不易被降解。
不同的载体要配合一定的菌株使用，像pET系列就一定需要有T7RNA聚合酶片段整合在细菌中的菌株才可用于表达。
采用不同调控机制会使用不同的表达菌株，所以换菌株一定要仔细看过载体的调控方式再换。
例如，使用BL21(DE3)菌株表达不成功可以尝试用Rosetta系列菌株表达，它能够由一种氯霉素抗性的、与pET相容的质粒提供AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNA。
所以这类菌株能够明显改善大肠杆菌中由于稀有密码子造成的表达限制。
有时不明原因的表达蛋白截短(比预期的分子量要小很多)也可能是由于稀有密码子造成的。
没有发现原则性错误之后，可以从表达条件入手，梯度条件改变表达温度、IPTG浓度，低温、较长时间的表达有利于蛋白稳定、融合表达；低浓度的IPTG可以减少化学物质对细胞的损伤。
蛋白表达常见问题分析
蛋白表达常见问题分析影响蛋白表达有许多因素，如目的蛋白自身的特点，表达载体、表达菌株的组合，诱导表达的条件，培养基的选择等，都有可能对蛋白的表达产生影响。
针对蛋白表达中的一些常见问题，可尝试用如下方法加以解决。
一、蛋白不表达或表达量很低1．选择正确的表达载体与表达菌株基于T7 启动子的载体（如pET 系列载体）应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 启动子的表达载体（如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体）应选用BL21 表达菌株。
对细胞有毒性的蛋白，应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。
对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。
2．尝试不同的表达系统与菌株不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它的菌株或表达载体。
3．表达条件的优化选择不同的培养基。
对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖（0.1%~0.5%），可以明显提高表达量。
较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。
但是可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。
菌体的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。
对于大部分蛋白，应在菌液的对数生长期（OD ≈ 0.5）进行诱导。
二、目的蛋白不可溶，形成包涵体首先确认目的蛋白是否有表达。
裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，还是形成了包涵体。
包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。
在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达系统与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。
目前认为包涵体的形成是基于蛋白在菌体内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。
原核蛋白表达常见问题解析
原核蛋⽩表达常见问题解析原核蛋⽩表达常见问题解析1、为什么⽬的蛋⽩总是以包涵体的形式出现？在原核蛋⽩表达纯化中⽬的蛋⽩经常发⽣错误的折叠，并聚集成为包涵体。
经过诱导，⽬的蛋⽩通常可达细胞总蛋⽩的50%以上。
虽然有⼀定⽐例的蛋⽩以可溶的单体形式存在，⽽多达95%（甚⾄更多）的蛋⽩则在包涵体中。
实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采⽤特别的培养基等⽅法获得更多的可溶蛋⽩。
2、跨膜蛋⽩为什么很难表达？跨膜蛋⽩的表达成功率相对较低是⼀个实验结果，究其原理，⽬前众说纷纭很多种理论。
以我们浅薄的理解层⾯来看，主要有以下⼏个原因：跨膜蛋⽩⼀般都是强疏⽔性的氨基酸分⼦和亲⽔性的分⼦跳跃式的连接，形成的亲⽔疏⽔的⼀个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞⼀样完成信号肽识别及切除、引导内质⽹、⾼尔基体重新包装及分泌这⼀复杂过程，有些蛋⽩是多次跨膜，对于原核细胞来说⼏乎是不可能完成的任务。
另外，对于疏⽔性的⽚段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏⽔性多肽会抑制翻译过程，甚⾄与原核膜结构融合形成毒性，出于⽣物⾃我保护的本能，所有的细胞器都会停⽌合成蛋⽩的过程。
3、如何选择蛋⽩表达宿主菌？4、我们有哪些原核蛋⽩纯化⽅式？如何选择不同的纯化⽅式？答：我们公司的蛋⽩纯化⽅法⼤致分为亲和纯化、离⼦交换、切胶回收三类。
1、常规情况下，⼀般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进⾏亲和纯化获得融合蛋⽩，⽤亲和纯化的⽅法⼀般可以获得85%以上纯度的蛋⽩，亲和纯化的⽅便快捷。
2、如果需要⽬的蛋⽩不含有任何标签，怎么选择纯化⽅式？。
（1）可表达融合蛋⽩，⽤蛋⽩⼯具酶切割融合蛋⽩，再进⾏纯化除去⼯具酶。
此⽅法能快速得到蛋⽩。
（2）可表达不含标签的蛋⽩，进⾏离⼦、分⼦筛、疏⽔等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋⽩。
蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题解析
本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pET-32a（+），从Eco RⅠ和HindⅢ酶切位点插入PCR产物-PrP435。
但由于单菌落所得载体pET-32a （+）在Eco RⅠ位点突变，由GAATTC突变为GAATTA（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a（+），在4℃连接过夜、TSS法转化E.coli DH5a 未获成功。
而将一周以后在4℃保存的连接液TSS法转化E.coli DH5 a却获成功。
我们利用双引物primergenome进行菌落PCR筛选阳性克隆时发现，本应扩增出430 bp的DNA片断，实验结果却扩增出约1300 bp，860 bp，430 bp三个DNA条带。
消除所有污染因素后，结果依然是三个DNA条带。
由此我们怀疑可能是PCR产物串联以后连入pET-32a（+）。
根据以上现象我们对结果作如下探索：疑似串联重组质粒命名为PrPX -pET-32a（+），PrPX-pET-32a（+）转化E.coli BL21（DE3），进行表达鉴定；Eco RⅠ单酶切PrP X-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆；用引物primervector 进行菌落PCR鉴定；使用5′primergenome单引物进行菌落PCR筛选鉴定； PrPX-pET-32a（+）和pET-32a（+）测序。
试验结果表明：表达出49 KD蛋白，比单拷贝克隆表达蛋白（35 KD）多15 KD，相当于2倍拷贝串联克隆表达蛋白大小。
由于插入片段已突变出两个终止子，所以我们认为PrP435串联数应在2以上，前一拷贝应为反向插入，而后一拷贝应为正向插入。
使用5′primergenome单引物进行菌落PCR，试验结果扩增出约860 bp，420 bp，两个DNA片段，420 bp附近有稍大模糊条带，据此我们认为：串联数应在4以上。
因为，由图3-5，使用5′primergenome单引物进行菌落PCR时，上游因物在E1-E6处和PrPX -pET-32a（+）退火，下游引物在H1-H5处和PrPX-pET-32a（+）退火，上游因物带有Eco RⅠ酶切位点可以与载体上E0产生错配。
DNA重组-载体构建常见问题及解决方法
载体构建中常见问题及解决方法重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。
所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)目的片段的扩增3) 载体酶切的问题4) 连接片段浓度比的问题5）菌液的提取6）酶切鉴定7）表达鉴定一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。
参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。
注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基二目的片段的扩增目的片段扩增失败的原因和可采取措施：1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。
三载体酶切的问题酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：1）酶切质粒浓度和纯度要好2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切四连接片段浓度比的问题1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。
蛋白质不表达：常见原因及分析
蛋白质不表达：常见原因及分析蛋白质不表达：常见原因及分析1.载体构建错误。
这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。
比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。
2.宿主菌选择不当。
不同的宿主菌其基因型是不一样的。
有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。
因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。
3. 密码子的使用频率低。
有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。
优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。
曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。
一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。
但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。
4、质粒不稳定或者质粒丢失。
pET系统通常比较稳定。
但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。
还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。
这种情况多见于真核表达系统。
5、蛋白酶将蛋白降解了。
这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。
当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。
N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。
C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。
C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。
蛋白质表达的常见问题及其解决办法
蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。
然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。
本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。
一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。
不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。
常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。
找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。
解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。
对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。
对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。
此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。
二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。
在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。
解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。
分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。
此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。
三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。
然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。
解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。
首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。
其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。
此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。
四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。
分子克隆及蛋白表达常见问题和对策
三、克隆过程概述
2、PCR筛选和限制酶酶切法 提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知 的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。 PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步 鉴定插入片段的大小。
注意： 菌落PCR技术筛选阳性克隆时，如果克隆的基因本身 来源于宿主的话，不能采用该技术
当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平 端载体相连，此为平末端连接，连接效率差些。
三、克隆过程概述
有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的 表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰，如同聚 物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得 相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。
连：用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA相 连接，形成重组DNA分子；
转：将重组DNA分子送入宿主细胞中进行复 制和扩增；
选：从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分 子的个体。
二、基因克隆
基因工程技术的两个最基本的特点： 1、分子水平上的操作 2、细胞水平上的表达
分子水平上的操作即是体外重组的过程， 是利用工具酶对DNA分子进行“外科手术"。 基因克隆技术又称为分子克隆、基因的无性 繁殖、基因操作、重组DNA技术以及基因工 程等。
一、重要意义与应用
基因过表达、RNAi、基因敲除、基因的定 点突变、CRISPR/Cas9等技术已在生命科学 研究中广泛应用，没有掌握分子克隆技术科 研将寸步难行。
二、基因克隆
（一）分子克隆技术的诞生
1972年11月，在檀香山有关质粒的会议上首次 出现基因克隆技术的想法。
Stanley Cohen （1986年诺奖获得者），对 Herbert W.Boyer 关于细菌酶切割DNA分子特定部 分的介绍很感兴趣。在威基基的一间熟食店里，两 位科学家相遇，构思出了一个开创现代生物技术产 业的实验。
重组表达质粒的构建
重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。
重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。
蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。
特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。
⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。
大肠杆菌重组效率低的原因
大肠杆菌重组效率低的原因分析在基因工程和生物制药领域，大肠杆菌常常被用作一种常用的宿主细胞，用于重组蛋白的表达。
然而，大肠杆菌重组效率低的问题是普遍存在的。
本文将就大肠杆菌重组效率低的原因进行详细分析，主要包括以下几个方面：1. 宿主细胞选择不当大肠杆菌有很多种类和菌株，不同种类和菌株的大肠杆菌在重组效率上存在差异。
如果宿主细胞选择不当，就可能影响重组蛋白的表达和稳定性，从而导致重组效率下降。
因此，在选择宿主细胞时，需要考虑菌株的特性和用途，以确保获得最佳的重组效果。
2. 重组质粒构建不合适重组质粒是用于克隆和表达外源基因的一种载体。
如果质粒构建不合适，如启动子选择不当、密码子使用不当等，就会影响重组蛋白的表达和稳定性，从而降低重组效率。
因此，在构建重组质粒时，需要仔细考虑质粒的结构和组成，以确保获得最佳的重组效果。
3. 转化条件不充分大肠杆菌的转化条件对重组效率有很大的影响。
如果转化条件不充分，如转化时间短、转化浓度低等，就会导致转化效率下降，从而影响重组效率。
因此，在转化大肠杆菌时，需要仔细控制转化条件，以确保获得最佳的重组效果。
4. 宿主细胞内质粒丢失在大肠杆菌细胞中，质粒是独立于染色体DNA而存在的DNA分子。
在某些情况下，宿主细胞内的质粒可能会丢失，从而导致重组蛋白表达下降。
为了解决这个问题，可以采用一些方法来稳定质粒在宿主细胞内的表达，如使用筛选压力、增加质粒拷贝数等。
5. 基因表达水平低在大肠杆菌中，不同基因的表达水平存在差异。
如果基因表达水平低，就会导致重组蛋白表达量不足，从而影响重组效率。
为了提高基因表达水平，可以采用一些方法来优化基因表达调控元件，如优化启动子和终止子、使用强启动子等。
6. 宿主细胞状态不佳大肠杆菌的状态对重组效率也有很大的影响。
如果宿主细胞状态不佳，如处于停滞期或者被污染等，就会导致重组蛋白表达不稳定或者下降。
因此，需要保持良好的宿主细胞状态，避免使用被污染的细胞。
大肠杆菌重组蛋白表达存在的问题
大肠杆菌重组蛋白表达存在的问题一、概述大肠杆菌(Escherichia coli)是一种广泛存在于土壤和水中的革兰氏阴性细菌，是重要的生物工程表达系统。
大肠杆菌重组蛋白表达系统因其高效、简便和成本低廉而被广泛应用于生物制药、基因工程和研究领域。
然而，大肠杆菌重组蛋白表达过程中存在一系列问题，限制了其在实际应用中的发展。
二、表达负荷过大在大肠杆菌重组蛋白表达系统中，由于外源基因的表达和蛋白质合成会对细胞的正常代谢和生理过程造成负担，因此表达负荷过大是一个常见问题。
这会导致目的蛋白无法高效表达，或者甚至导致细胞逝去，影响蛋白表达的稳定性和可靠性。
三、蛋白质结构错误大肠杆菌重组蛋白表达系统中，外源基因的表达受到诸多因素的影响，例如启动子的选择、转录水平、翻译后修饰等，这些都可能导致目的蛋白结构错误。
蛋白质结构错误会降低蛋白活性和稳定性，影响其在实际应用中的效果。
四、蛋白质纯度较低在大肠杆菌重组蛋白表达系统中，外源基因的表达会导致大量的杂蛋白和热蛋白的产生，这些都会降低目的蛋白的纯度。
低纯度的蛋白在实际应用中无法满足质量标准，限制了其广泛应用。
五、蛋白聚集和包含体形成在大肠杆菌重组蛋白表达系统中，外源基因的表达会导致蛋白聚集和包含体形成，这些都会影响蛋白的溶解性和稳定性。
蛋白聚集和包含体形成是影响大肠杆菌重组蛋白表达系统应用的重要问题之一。
六、表达宿主毒性外源基因的表达可能会产生毒性蛋白，例如膜蛋白、毒素等，这些都会对大肠杆菌宿主细胞产生毒性作用，甚至导致细胞逝去。
表达宿主毒性的问题不仅影响了目的蛋白的表达效率，还可能对表达宿主细胞的健康造成影响。
七、解决方案及展望针对以上存在的问题，研究人员提出了一系列解决方案。
例如通过优化启动子和调整转录水平，减轻表达宿主的负荷；设计合适的蛋白结构域，提高蛋白质结构的稳定性；采用亲和纯化技术和蛋白纯化缓冲液，提高蛋白质的纯度；利用融合蛋白和分子筛等技术，降低蛋白聚集和包含体的形成；通过调整表达条件和优化表达宿主，减轻表达宿主的毒性等。
遗传工程中重组载体的构建及稳定性问题
·64·工 作 研 究农业开发与装备 2015年第10期摘要：遗传工程，又称基因工程，其最终目的就是获得可以工业化生产的下游产品或外源基因稳定表达的产物，而重组质粒作为基因工程中的核心步骤，其稳定性对基因工程产物的生产也至关重要。
本文简要阐述了几种常用的重组质粒的构建方法，并就其稳定性在遗传工程中的重要性、提高稳定性措施等几个方面作一简要介绍。
关键词：重组质粒；不稳定性；原因；措施1 重组载体构建的方法1.1 传统的载体构建方法质粒载体DNA在体外经限制性内切酶酶切，然后在DNA连接酶的作用下同目的基因结合成环，最终得到转化载体。
为了与合适的启动子、选择性标记基因等序列元件连接，中间还需要转换多个载体和一系列的酶切、连接、转化、回收等工作，因此，传统的载体构建方法路线设计和实际操作往往比较麻烦，通常需要构建多个中间载体，费时费力。
但是，采用传统的构建方法还是一种比较安全、稳妥的选择，而且能够获得预期的结果。
1.2 Gateway技术Gateway是Invitrogen公司开发的一项基因克隆和表达的新技术，它利用位点特异重组构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶，而且一旦拥有了一个入门载体，就可以利用它将目标基因多次转移到各种不同的表达载体上。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而不会影响不同基因的测序结果，因而每当使用一种新的表达系统时，可以节省大量时间。
1.3 含三段T-DNA载体由于目标基因和选择标记基因位于不同载体或不同T-DNA 上，后代中能够获得无标记转基因植株，获得频率同样比较低。
叶兴国等研究构建了包含三段T-DNA的双元表达载体，其中的一段T-DNA区域含标记基因，另外二段T-DNA区域含目标基因，用其转化大豆后较高频率获得了无标记转基因植株。
1.4 一步克隆法是一种多片段拼接的单交换表达载体，是一种简便、通用、高效的复杂载体构建方法，它适合构建大小为6 kb以下的载体。
分子生物学实验常见问题分析及对策-20
分子生物学实验常见问题分析及对策-20分子生物学实验常见问题分析及对策-20质粒的提取常见问题与对策Q1: 提质粒没有明显的沉淀，能说明是没有提出来吗？跑完电泳还是没有条带能证明质粒没提出来吗？A: 提质粒的时候没有明显的沉淀，也有可能是由于你加的乙醇量少或异丙醇量不足或质量有问题。
或者质粒太少了难以用肉眼看出。
跑完电泳还是没有条带也有可能是跑胶时配置胶出问题，或染色剂不够，或者你加的质粒量少。
要具体情况再分析Q2:质粒条带很暗而且通常只有一条带是什么问题？A:没有用试剂盒提取的话可能考虑技术问题。
如果常做质粒的提取，且用的是试剂盒，还出现这种情况，就要从质粒本身着手考虑了：首先做个PCR鉴定一下，确保有质粒的情况下，很可能质粒是低拷贝的，如此就要用大量的细菌来提取质粒。
一般的用可以用水煮法提(1ml菌液离心,沉淀加50μl DEPC 水,100度水煮3-4分钟,离心取上清夜,含有大量的质粒)用1-2μl作为模板跑PCR效果很好。
Q3: 用分光光度计测得的质粒浓度很高，但是跑出来的电泳却看不到条带，这是什么原因？A: 三种可能：1）可能EB有问题，应同时检查同一块胶上其它样品是否有条带。
2）计算OD260/280比例，有可能为蛋白污染所致。
3）稀释后上样的浓度过低。
Q4: 提质粒电泳显示应该几条带？哪种情况较好？A: 质粒在电泳时会出现三种情况的图谱：1）三条带，按照电泳泳动速度（快到慢）排列为：超螺旋、缺口闭环、开环。
经常会出现。
2）两条带，超螺旋/闭环/开环任意两种。
3）一条带，超螺旋。
至于那种情况好，要看我们进一步实验的目的了。
1）进行分子克隆的操作，构建载体。
这随便那种情况都可以，不会影响你的后续实验。
所以在这种情况下，没必要评比谁好谁不好。
2）进行细胞转染。
因为转染必须要超螺旋，所以它们的质量好坏顺序是： 3）、2）、1）。
Q5: 如何降低质粒变性超螺旋的含量？A: 理论上，用碱裂解法抽提质粒，变性超螺旋的出现是不可避免的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
本实验源于一次失败的实验，从平板挑单菌落提取载体pET-32a（+），从
Eco RⅠ和HindⅢ酶切位点插入PCR产物-PrP
435。
但由于单菌落所得载体pET-32a （+）在Eco RⅠ位点突变，由GAATTC突变为GAATTA（已测序），按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a（+），在4℃连接过夜、TSS法转化E.coli DH5a 未获成功。
而将一周以后在4℃保存的连接液TSS法转化E.coli DH5 a却获成功。
我们利用双引物primer
genome
进行菌落PCR筛选阳性克隆时发现，本应扩增出430 bp的DNA片断，实验结果却扩增出约1300 bp，860 bp，430 bp三个DNA条带。
消除所有污染因素后，结果依然是三个DNA条带。
由此我们怀疑可能是PCR产物串联以后连入pET-32a（+）。
根据以上现象我们对结果作如下探索：疑似串联重组质粒命名为
PrP
X -pET-32a（+），PrP
X
-pET-32a（+）转化E.coli BL21（DE3），进行表达鉴
定；Eco RⅠ单酶切PrP X-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，试图获得
单拷贝阳性克隆；用引物primer
vector 进行菌落PCR鉴定；使用5′primer
genome
单
引物进行菌落PCR筛选鉴定； PrP
X
-pET-32a（+）和pET-32a（+）测序。
试验结
果表明：表达出49 KD蛋白，比单拷贝克隆表达蛋白（35 KD）多15 KD，相当于2倍拷贝串联克隆表达蛋白大小。
由于插入片段已突变出两个终止子，所以我
们认为PrP
435
串联数应在2以上，前一拷贝应为反向插入，而后一拷贝应为正向插入。
使用5′primer
genome
单引物进行菌落PCR，试验结果扩增出约860 bp，420 bp，两个DNA片段，420 bp附近有稍大模糊条带，据此我们认为：串联数应在4以
上。
因为，由图3-5，使用5′primer
genome
单引物进行菌落PCR时，上游因物在
E1-E6处和PrP
X -pET-32a（+）退火，下游引物在H1-H5处和PrP
X
-pET-32a（+）
退火，上游因物带有Eco RⅠ酶切位点可以与载体上E0产生错配。
所以E1和H1之间可扩增出430 bp片段，E1和H5之间可扩增出约1300 bp片段，E1和E4之间可扩增出约860 bp片段。
E1和3之间Taq酶同时往中间扩增，Taq酶要占一定的空间，就会使下游引物所加的HindⅢ酶切位点和三个保护性碱基消失一部分，扩增出约420 bp（比430 bp小）条带。
其他各条带可同理推出。
图3-5串联质粒PrP X-pET-32a（+）多克隆位点
Fig.3-5 The MCS of cascade recombinant PrP X-pET-32a（+）
sense strand ，anti- sense strand ， H HindⅢ，
E Eco RⅠ，vector
本实验早期我们用Eco RⅠ单酶切PrP X-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，并重新连接，试图获得单拷贝阳性克隆，但重复多次，经表达鉴定，未获成功。
原因是Eco RⅠ位点突变（已测序）。
以后重复该实验所用pET-32a（+）Eco RⅠ位点完好，Eco RⅠ单酶切PrP X-pET-32a（+），琼脂糖凝胶回收，重新连接，实验结果获得单拷贝阳性克隆。
-pET-32a（+）经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成PrP
X
功。
原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列，形成DNA的某种二级结构造成测序困难。
虽本实验然重复出了失误实验的结果，表达出了相应的蛋白作，但也只是一次探索。
建议对以下三个方面作进一步得把探索性研究，首先由于测序无法完成，可进一步做Western-Blot鉴定（使用牛朊蛋白单抗做过两次，非特异性较强，未能得到好的照片）；其次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链并产生
一个终止子，导致蛋白表达量很低，而且为无用蛋白，若能将引物primer
genome 两个酶切位点作颠倒，使用单酶切两种PCR产物（酶切位点相互颠倒），作连接以后，再做克隆，可克隆入完全正向连接的串联克隆；再次，此方法上游第一个连入拷贝为反向反意义链，可表达出PrP核心片段的反义肽，可做反义肽方面的进一步探索。
有时候实验中出现串连并不是我们所期望的，如何避免串连，提高连接效率?笔者做过这方面的探讨。
具体如下：由于细菌在遗传上的不稳定性，在进行细菌操作时，应挑选多个菌落。
在实验过程中曾经遇到pET-32a（+）Eco RⅠ位点由GAATTC突变为GAATTA（已测序），造成连接以后连接产物的串联，就是由于在操作过程中挑选单个菌落造成的。
重组质粒构建通常使用酶切然后胶回收再连接、转化，最后进行阳性克隆鉴定的方法。
但实验中经常遇到酶切操作困难和胶回收量低、转化效率低、串连等问题。
特别是进行双酶切时，由于两个酶在通用buffer中的效率不一致，琼脂糖凝胶电泳无法区分单酶切和双酶切，连接产物中可能混有大量的空载体，这样就会给阳性克隆筛选带来麻烦。
还有可能由于过多的剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，还可造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。
我们将重组质粒的构建方法略加改进，取得了良好的效果和重复性。
具体操作介绍如下：
pET-32a（+）去RNA，经溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、氯仿、乙醇沉淀。
将pET-32a（+）与PCR产物按1：20的比例混合，Eco RⅠ和Hind Ⅲ双酶切2小时。
酶切产物不进行任何形式的纯化，直接用1/10量连接2小时。
连接产物立即转化E.coli DH5α，在含50 ug/ml AMP 的液体TB培养基中过夜，收集细菌提取质粒、纯化。
用pET-32a（+）多克隆位点上Eco RⅠ和Hind Ⅲ之间已被双酶切去除的SalⅠ位点对应酶SalⅠ单酶切（图1－8），使pET-32a（+）空载体线性化。
酶切产物转化E.coli BL-21，涂布含50 ug/ml AMP LB平板，挑单菌落进行菌落PCR，筛选阳性克隆。
转化E.coli BL-21之前也可进行阳性克隆富集。
上述包含阳性克隆和pET-32a（+）空载体混合质粒，用SalⅠ和XholⅠ双酶切，乙醇回收去掉小片段， T4DNA连接酶连接反应体系同上。
TSS缓冲液转化E.coli BL-21（DE3）。
（图1-7， 1-8）
图1-7 一种新的重组质粒构建方法
Fig.1-7 A new method for the contruction of recombinant plasmid
图1-8 pET-32a（+）多克隆位点
Fig. pET-32a（+） MCS
此方法具有很大的跳跃性，不需检测酶切是否完全，SalⅠ单酶切使pET-32a （+）空载体线性化。
E.coli BL-21的转化效率大约是E.coli DH5α的1/10（见《pET System Manual》22页），线性化pET-32a（+）比超螺旋质粒转化率低的多，线性化空载体转入E.coli BL-21的几率很小。
经两次富集阳性克隆，菌落PCR筛选阳性克隆率几乎100%。
传统方法使用胶回收pET-32a（+）的浓度
很低，难于测定OD
值，载体和PCR产物比例不当很容易造成串联，本方法未
260
将载体和PCR产物的酶切小片段去除，各粘性末端都有对应的酶切小片段，串联的几率降低到最小。
所以连接时可以不加限制的增加PCR产物的量，极大的提高了正确连接的效率。
胶回收DNA，可能由于剧烈条件造成酶切产物个别核苷酸的丢失，造成重组质粒的错义突变甚至无义突变。
本方法将胶回收DNA步骤取消，降低质粒的错义突变和无义突变的几率。