过氧化氢酶活性测定1

实验 48 过氧化物酶活性的测定（比色法）

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合

作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断

发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

一、原理

在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物

质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定

过氧化物酶活性。

二、实验材料、试剂与仪器设备

（一）实验材料

马铃薯块茎。

（二）试剂

1 ． 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液 pH6.0 （见附录）。

2 ．反应混合液： 100 mmol ／ L 磷酸缓冲液（ pH6.0 ） 50 mL 于烧杯中，

加入愈创木酚 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶

液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。

（三）仪器设备

分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管，离心机。

三、实验步骤

1 ．称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，

以 4000 r ／ min 离心 15 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5

mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。

2 ．取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液

3 mL 和磷酸缓冲

液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL （如酶

活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm

下吸光度值，每隔 1min 读数一次。

四、结果计算

以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]

表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位

（ u ）表示。

过氧化物酶活性 [u/ （ g · min ） ]=

式中：Δ A 470 ——反应时间内吸光度的变化。W ——植物鲜重， g 。

V T ——提取酶液总体积， mL 。

V s ——测定时取用酶液体积 , mL 。

t ——反应时间， min 。

POD（过氧化物酶）活性的测定

使用愈创木酚比色法。

（1）酶液提取

（2）活性测定

2.9mL 0.5mol/L pH 6.0磷酸缓冲液，加入1mL 0.05mol/L愈创木酚和0.1mL酶提取液，30℃

水浴保温15min 后迅速放入冰浴中，立即加入1mL 2%的H2O2（0.667mL 30% H2O2溶于100mL 蒸馏水，现配现用。）激活反应，立即在470nm 下测定吸光度值，每隔30s 记录一次吸光度，共记录5次。

试验重复2次取平均值记录。

（3） 酶活力的计算：以每秒钟内OD 值变化0.01为一个酶活力单位（U ），酶活性用U/(mg ·min)表示。

A D

0.01t ∆⨯=酶活力U

其中：A ∆------反应时间内吸光度的变化值

D

------稀释倍数（粗酶液总体积

实验取用体积，其中取用体积为0.1mL ） t ------反应时间（本实验为30S ）

愈创木酚法

称取一定质量的植物材料放入研钵中，加入提取液1 mL(0. 05 mol /L pH 5. 5 的磷酸缓冲液) ，研磨，再加入9 mL 提取液，将匀浆全部转入离心管中，4 000 r /min 4 ℃离心10 min ，上清液即酶的粗提取液。测定酶活性时，将4 mL 反应混合液( 磷酸缓冲液2 mL 、酶液1 mL 、0. 05 mol /L 愈创木酚1 mL)和1 mL 2% H2O2加入试管中立即摇匀并迅速倒入比色皿中，于470 nm 波长下用U-2800 型紫外可见分光光度计比色，立刻记录吸光度值，以后每30 s 记录1次，记录4 min ，以缓冲液代替酶液作对照，

POD 活性=V 1·ΔOD/0. 01V 2W ·Δt

式中:ΔOD 为反应初速度阶段的吸光度差，比色波长470 nm;Δt 为ΔOD 对应的时间(min) ;ΔOD /Δt 为直线部分的斜率，在此阶段吸光度与反应时间成正比;V1为提取酶液总体积(mL) ;V2为测定时取用的提取酶液体积(mL) ;W 为植物样品鲜重( g) ;0. 01 为以吸光度值(ΔOD) 变化0. 01 为1 个酶活性单位( u)。

过氧化氢酶活性的测定．取0.2ｇ去壳种子，液氮中研磨成粉，然后加入提取液(50 mmol/L ， pH 7.0 的磷酸缓冲液，20%甘油，1 mmol/L 还原型谷胱甘肽，2 mmol/L 抗坏血酸，1%聚乙烯吡咯烷酮)5 mL 继续研磨成匀浆，4 ℃，10 000 r/min 离心15 min. 在1 mL 反应体系(10 mmol/L ，pH7.0 磷酸钾缓冲液，10 mmol/L H2O2)中加入适量酶提取液，混匀后在240 nm 下测定OD 值. 过氧化氢酶活性以每分钟每克鲜重样品分解H2O2 的毫克数表示