蛋白的变性和复性
华中农业大学生化期中重点
基础生物化学试题题型一．名词解释（每题2分，共20分）生物化学：研究生命有机体的组成和生命活动过程中的化学变化和相互联系的科学，即研究生命活动化学本质的科学。
生物大分子：组成生命体活动的生物有机大分子。
蛋白质的变性：蛋白质受到某些物理或化学因素的影响，使其分子内部原有的高级结构发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能随之变化或丧失，但并未导致蛋白质一级结构的变化。
DNA的变性：是指在一定物理或化学因素作用下，核酸的双螺旋结构中碱基之间的氢键断裂，变成单键的过程。
肽平面：肽键具有部分双键的特征，不能自由旋转，使得肽键两端的原子处在一个刚性的平面上，这个平面叫做肽平面（酰胺平面）。
蛋白质结构域：由肽链上相邻的超二级结构紧密联系，形成两个或多个在空间有明显区别的局部区域叫结构域。
酶活力：在最适条件下，单位时间内催化底物减少的量或者产物的生成量。
米氏常数：米氏方程中的Km，表示酶促反应速度达到最大速度的一半时底物浓度。
同工酶：催化一种化学反应，但其酶本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
酶的竞争性抑制作用：有些抑制剂和底物的结构极为相似，可和底物竞争与酶结合，当抑制剂与酶结合，就妨碍了底物与酶结合，减少了酶作用的机会，因而降低了酶的活力。
葡萄糖的异生作用：是非糖前体合成葡萄糖的过程。
糖酵解：将葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应。
mRNA的“帽子”结构（M7G）：真核生物的mRNA转录后在其5’端添加的7-甲基鸟苷。
蛋白质的一级结构：多肽链内氨基酸残基从N端到C端的排列顺序。
蛋白质的二级结构：肽链主链不同肽段通过自身的相互作用、形成氢键，沿某一主轴旋转折叠而形成的局部空间结构。
蛋白质的三级结构：多肽链在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠。
蛋白质的四级结构：由相同或不同亚基按照一定排列方式聚集而成的蛋白质结构。
蛋白质的盐析沉积：通过加入中性盐改变蛋白质胶体结构，使蛋白质沉淀析出的现象叫盐析。
生物化学2.10.2蛋白质的变性与复性
实质
维持蛋白质空间结构的次级键和二硫键 被破坏，引起天然构象解体，但多肽链 主链共价键并未打断，即一级结构不变。
蛋白质的变性（denatura学因素：
• 强酸、强碱、脲、去污 剂（十二烷基硫酸钠 （SDS））、重金属盐、 三氯醋酸、浓乙醇等。
物理因素：
• 加热、高压、紫外线照 射、X-射线、超声波、 剧烈振荡和搅拌等
蛋白质的变性后的表现
1、生物活性丧失； 2、一些侧链基团暴露出来； 3、一些理化性质改变； 4、生物化学性质改变。
蛋白质的变性后的表现
蛋白质的复性
如果引起变性的因素比较温和，当除去变性因素后， 变性蛋白质又可重新回复到天然构象，原有的理化性质 和生物活性得到部分或全部恢复，这种现象称作复性 （renaturation）。
变性与凝固应用举例 • 生鸡蛋煮熟变为块状。 • 急救重金属盐(如氯化高汞)中毒时，可给患者
吃大量乳品或蛋清
蛋白质的重要性质之二
变性与复性
主讲教师：杜秋丽
蛋白质的重要性质之二
变性与复性
主讲教师：杜秋丽
蛋白质的变性（denaturation）
天然蛋白质在某些理化因素的影响下，如热、光、 机械力、酸碱、有机溶剂、重金属离子、变性剂（如 尿素等），分子内部高度规律性的空间结构发生变化， 结果导致其生物活性部分或全部丧失。
蛋白质的变性（denaturation）
实例：核糖核酸酶变性与复性作用
天然状态，有催化活性
8 M 尿素 -巯基乙醇
变性
非折叠状态，无活性
天然状态 –S-S-键恢复 而且是正确配对
蛋白质的变性和凝固
在某些物理和化学因素作用下，蛋白质分子的特定 空间构象被破坏，导致变性。天然蛋白质变性后， 分子相互凝聚、缠结形成固体，即蛋白质的凝固。
蛋白质变性与复性
蛋白质相互作用与复合物分离
蛋白质变性
利用变性剂分离和纯化蛋白质复合物 中的各个组分，有助于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物的组成。
蛋白质复性
在研究蛋白质相互作用和复合物分离 后，通过复性技术将蛋白质恢复其天 然状态，可用于进一步的功能和结构 研究。
蛋白质优化与改造
蛋白质变性
通过蛋白质变性技术可以去除非必需的氨基酸残基或引入突 变，从而优化蛋白质的稳定性、活性或选择性。
蛋白质复性
复性后的蛋白质可用于进一步的功能和结构研究，以验证优 化和改造的效果。
人工酶设计与合成
蛋白质变性
在人工酶设计与合成过程中，利用变性技术可以去除天然酶中的非必需部分，提 高酶的活性和选择性。
蛋白质复性
复性后的酶可用于催化特定化学反应，以验证人工酶的活性和效果。
生物制药与疫苗开发
蛋白质变性
医疗领域
改进蛋白质检测和诊断技术，提高疾病诊断的准 确性和效率，为患者提供更好的医疗服务。
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蛋白质变性与复性
目录
CONTENTS
• 蛋白质变性 • 蛋白质复性 • 蛋白质变性与复性的应用 • 蛋白质变性与复性的研究进展 • 蛋白质变性与复性的挑战与前景
01 蛋白质变性
定义
蛋白质变性是指蛋白质在某些物理和 化学因素作用下，其特定的空间构象 被破坏，导致理化性质发生改变，生 物学活性丧失的现象。
复性后的蛋白质溶解度增加，有利于其在溶液中的稳 定性。
Байду номын сангаас
03 蛋白质变性与复性的应用
蛋白质结构与功能关系
蛋白质变性
通过改变蛋白质的理化条件，使其空间构象发生改变，从而改变其生物学活性。 有助于研究蛋白质的结构与功能关系，深入了解蛋白质在生物体内的生理作用。
蛋白质化学：第四部分
•
方法：① 用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理,蛋白质变性（肽链伸展） 并与SDS结合，形成SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子
均带负电（SDS带负电），且荷质比相同（蛋白质分子大，结
合SDS多；分子小，结合SDS少）； 不同蛋白质分子具有相似的构象。 ② 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图 ③ 测出待测样品的迁移率 ④ 从标准曲线上查出样品的相对分子质量
2. 蛋白质的沉淀：
如果加入适当的试剂，使蛋白质分子处于等电点状态或失去
水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就
不再稳定而出现沉淀现象。
导致蛋白质沉淀的常用方法:
① 高浓度中性盐（盐析）
② 等电点沉淀
③ 有机溶剂沉淀
④ 重金属盐类沉淀 ⑤ 生物碱试剂和某些酸类沉淀 ⑥ 加热变性沉淀
水化层
和无机盐等小分子自由通过，此方法只能将蛋白质和小分子 物质分开，不能将不同蛋白质分开。 （2）超过滤：是利用外加压或离心使水和其他分通过半 透膜，蛋白质留在膜上。
透析与超过滤简易装置
2. 密度梯度离心:
a. 蛋白质颗粒沉降不仅决定于它的大小也取决于它的密度。
b. 颗粒沉降到与自身密度相等的介质梯度时，即停止不前。
素作用下，其特定的空间构象被破坏，即有序的空间结构 变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活 性的丧失。
2.变性的本质
—— 破坏蛋白质的空间结构，不改变蛋白质的一级结构。
蛋白质变性后，由于维持溶液稳定的条件仍然存在而并不 析出，例如：在强酸碱中，变性的蛋白质在强酸碱溶液 中仍存在电荷效应，所以不表现为沉淀现象。
蛋 白 质 胶 体 溶 液 沉 淀 作 用 示 意 图
基础生物化学重点
基础生物化学重点一、名词解释1.蛋白质的空间结构：是指分子中各个原子和基团在三维空间的排列和分布。
2.蛋白质的变性与复性：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性；如果除去变性因素，在适当条件下蛋白质可恢复天然构象和生物学活性。
3.氨基酸的等电点：在一定的PH条件下，氨基酸分子所带的正电荷和负电荷数相同，即净电荷为零，此时溶液的PH称为氨基酸的等电点4.肽平面：多肽链中从一个Cａ到相邻Cａ之间的结构。
5.DNA的变性与复性：DNA在一定外界条件（变性因素）作用下，氢键断裂，双螺旋解开，形成单链的无规卷曲，这一现象称为变性；缓慢恢复原始条件，变性DNA重新配对恢复正常双螺旋结构的过程。
6.增色效应与减色效应：当DNA从双螺旋结构变为单链的无规则卷曲状态时，它在260nm处的吸收便增加，这叫“增色效应”；当核苷酸单链重新缔合形成双螺旋结构时，其A260降低，称减色效应。
7.熔解温度：核酸加热变性过程中，增色效应达到最大值的50%时的温度称为核酸的熔解温度(Tm)或熔点。
8.同工酶：是指催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子结构及理化性质等不同的一组酶。
9.多酶体系：由几个功能相关的酶嵌合而成的复合物，有利于化学反应的进行，提高酶的催化效率。
10.全酶：由蛋白质和非蛋白的小分子有机物或金属离子组成的有催化活性的酶。
11.酶的活性中心：酶分子中直接与底物结合并催化底物发生反应的区域。
12.亲核催化：酶分子的亲核基团攻击底物的亲电基团而进行的催化作用。
13.诱导契合学说：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。
14.糖异生作用：以非糖物质(如丙酮酸、甘油、乳酸和绝大多数氨基酸、脂肪酸等)为前体合成为葡萄糖的作用。
15.回补反应：由于中间产物的离开，引起中间产物浓度的下降，从而引起循环反应的运转，因此必须不断补充中间产物才能维持循环正常进行，这种补充称为回补反应16.底物水平磷酸化：高能化合物将高能磷酰基转移给ADP形成ATP的过程。
蛋白质的理化性质及分离分析
食品加工，消毒灭菌等； 非蛋白生物物质提取纯化，终止酶促反应；
生产生活中不利的一面：
活性蛋白制品（酶、抗体）的分离提取和保存；
四、蛋白质的沉淀作用
1. What’s precipitation of protein?
外加一些因素去除蛋白质胶体的稳定因素后，使蛋 白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀 （precipitation）。 变性后的蛋白质由于疏水 基团的暴露而易于沉淀， 但沉淀的蛋白质不一定都 是变性后的蛋白质。
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein?
盐溶作用 盐析作用
蛋白质仍能保持生物活性的沉淀方法
（1）盐析—中性盐沉淀
What’s salt precipitation of protein? 定义：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以 破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中 沉淀析出，称为盐析（salt precipitation）。 作用机制: 中和电荷的同时破坏水化膜;
蛋白质的理化性质 及分离分析
蛋白质的理化性质
一、两性性质及等电点 二、胶体性质 三、变性与复性作用 四、蛋白质的沉淀作用 五、沉降作用 六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的紫外吸收性质
一、蛋白质的两性解离与等电点
蛋白质分子中氨基酸残基的侧链上存在游离的 氨基和羧基，因此蛋白质与氨基酸一样具有两 性解离性质，具有特定的等电点（pI）。
沉降速度法测定分子量的原理； 梯度离心分离蛋白质（氯化铯）；
六、蛋白质的颜色反应
1. 双缩脲反应 2. 茚三酮反应 3. 考马斯亮蓝G250 4. 福林酚试剂反应 5. 黄色反应--芳香族氨基酸的特有反应 6. 米伦氏反应—酪氨酸的特有反应 7. 乙醛酸反应—色氨酸的特有反应 8. 坂口反应—精氨酸特有的反应
生物化学名词解释
增色效应与减色效应：一般天然DNA的ε(P)为~6600，RNA为7700~7800。
核酸的ε(P)值较所含核苷酸单位的ε(P)要低40%~45%。
单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多核苷酸的ε(P)要高，所以核酸发生变性时，ε(P)值升高约25%,此现象称为增色效应。
复性后ε(P)值又降低，这现象称为减色效应。
蛋白质的变性与复性：天然蛋白质受到某些物理因素如热、紫外线照射等或化学因素如有机溶剂、酸、碱等的影响时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化学常数发生改变，这种过程称为蛋白质变性。
当变性因素除去后，变性蛋白质又可重新回复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性。
活性中心：特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域称为酶的活性部位或活性中心。
Chargaff’规则：(1)腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即A=T。
(2)鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数相等，即G=C。
(3)含氨基的碱基(腺嘌呤和胞嘧啶)总数等于含酮基的碱基(鸟嘌呤和胸腺嘧啶)总数，即A+C=G+T。
(4)嘌呤总数等于嘧啶总数，即A+G=C+T。
等电点：对某一种蛋白质来说，在某一pH，它所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，这一pH称为蛋白质的等电点。
熔解温度：DNA的变性从开始解链到完全解链，是在一个相当小的温度内完成，在这一范围内，紫外光吸收值达到最大值的50%时的解链温度，由于这一现象和结晶的融解过程类似，又称熔解温度，即DNA 分子的熔点(Tm)。
单顺反子：真核基因转录产物为单顺反子，即一条mRNA模板只含有一个翻译起始点和一个终止点，因而一个基因编码一条多肽链或RNA链，每个基因转录有各自的调节元件。
多顺反子见于原核生物意指一个mRNA分子编码多个多肽链。
这些多肽链对应的DNA片断则位于同一转录单位内，享用同一对起点和终点。
结构域：多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的紧密球状实体，称为结构域或域。
生化名词解释
DNA的变性和复性：（1）变性：DNA双链之间以氢键连接，氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏，在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。
（2）复性：变性DNA在适当条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象，这种现象称为复性。
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程也叫退火，一般认为，比Tm值低25℃的温度是DNA复性的最佳条件。
分子杂交：两条来源不同但有碱基互补关系的DNA单链分子，或DNA单链分子与RNA分子，在去掉变性条件后互补的区段能够退火复性形成双链DNA分子或DNA／RNA异质双链分子，这一过程叫分子杂交。
增色效应和减色效应：（1）增色效应：将DNA的稀盐酸溶液加热到80~100度时，双螺旋结构解体，两条链分开形成单链，由于双螺旋分子内部的碱基暴露，260nm紫外线吸收值升高，这种现象称为增色效应。
（2）减色效应：核酸的光吸收值通常比各个核苷酸成分的光吸收值之和小30%~40%，这是由于在有规律的双螺旋结构中碱基紧密的堆积在一起造成的，这种现象称为减色效应。
回文结构：指DNA序列中，以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同的双螺旋结构，即对称轴一侧的片段旋转180℃后，与另一侧片段对称重复。
Tm值：通常把增色效应达到一半时的温度或DNA双螺旋结构失去一半时的温度叫该DNA 的熔点或熔解温度，用Tm表示。
Chargaff定律：所有DNA中腺嘌呤与胸腺嘧啶的摩尔含量相等（A＝T），鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔含量相等（G＝C），即嘌呤的总含量与嘧啶的总含量相等（A＋G＝T＋C）。
DNA 的碱基组成具有种的特异性，但没有组织和器官的特异性。
另外生长发育阶段、营养状态和环境的改变都不影响DNA的碱基组成。
碱基配对：由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，这就是A（腺嘌呤）一定与T（胸腺嘧啶）配对，G（鸟嘌呤）一定与C（胞嘧啶）配对，反之亦然。
第3章(2) 蛋白质变性与复性
其他——反胶束萃取复性法
反胶束萃取复性与稀释复性相比较
提高复性率的策略
1、二硫键的形成 拥有多重二硫键的蛋白，需要更复杂的再折叠过程， 要求氧化剂和还原剂都在最佳的浓度下，以便于二硫 键的形成。 2、小分子添加物
降低蛋白聚集的策略是使用小分子添加剂，如丙酮、乙 酰、尿素、去污剂、蔗糖、短链醇、DMSO和PEG等。 最常用的是Ｌ－精氨酸、低浓度（1-2M）尿素或盐 酸胍以及去污剂（SDS）。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。
最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理：
• 稳定正确折叠蛋白质的天然结构， • 降低错误折叠蛋白质的稳定性， • 增加折叠复性中间体的溶解度， • 增加非折叠蛋白质的溶解度， • 减少复性中间体接触发生聚集反应。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
第二节 蛋白质变性与 复性
Unfolding and Refolding
变性与复性
• 1931年吴宪教授提出蛋白质变性理论。 若溶液中存在变性剂（酸、碱、盐酸胍、 尿素、重金属、某些有机试剂等）能引起蛋白 质变性。 弱变性条件下，蛋白质部分变性，肽链保 持一定构型；强变性条件下，蛋白质完全变性 肽链伸展成无序随机状态。
包涵体
在E.coli细胞质内高水平表达的外源蛋白质， 尤其是来自真核生物的蛋白质聚集，会形成不溶 性、无生物活性的聚合物---包涵体。
E.coli包涵体
大肠杆菌中的胰乳酶原包含体电镜照片
包涵体
包涵体形成原因：
• 使用高计量基因和强启动子；
• 大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原 电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象条件；
亲合色谱复性
分子伴侣亲合色谱，又称为“折叠色谱”。 为变性蛋白质提供一个中空环状的疏水腔，当 变性蛋白质进入空腔后，可部分避免或完全消 除变性蛋白质分子间的聚集作用，使蛋白质在 疏水环境中进行“结合-释放-再结合”的循环 过程，直到恢复其天然的构象状态。
生物化学名词解释
练习题一、名词解释1.复性:蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性2. 等电点（pI）当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（isoelectric point，pI）。
3. 同工酶存在于同一种属或不同种属，同一个体的不同组织或同一组织、同一细胞，具有不同分子形式但却能催化相同的化学反应的一组酶，称之为同工酶（isoenzyme）4. 诱导契合：诱导契合学说：酶的活性中心在结构上具柔性，底物接近活性中心时，可诱导酶蛋白构象发生变化，这样就使使酶活性中心有关基团正确排列和定向，使之与底物成互补形状有机的结合而催化反应进行。
5. 变构效应:有些酶分子表面除了具有活性中心外，还存在被称为调节位点（或变构位点）的调节物特异结合位点，调节物结合到调节位点上引起酶的构象发生变化，导致酶的活性提高或下降，这种现象称为别构效应6. 糖酵解:糖酵解是将葡萄糖降解为丙酮酸并伴随着ATP生成的一系列反应，是生物体内普遍存在的葡萄糖降解的途径。
该途径也称作Embden-Meyethof-Parnas途径，简称ＥＭＰ途径。
8. β－氧化脂肪酸在体内氧化时在羧基端的β-碳原子上进行氧化，碳链逐次断裂，每次断下一个二碳单位，即乙酰CoA，该过程称作β-氧化。
9. 半保留复制DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。
这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。
由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制10. 转录转录是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照碱基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程。
变性蛋白的复性PPT课件
06 结论
变性蛋白复性的研究意义和价值
生物医学应用
变性蛋白的复性研究有助于理解蛋白质结构和功能的关系，对于疾病诊断和治疗具有重 要意义。例如，某些蛋白质的异常折叠与阿尔茨海默症、帕金森症等神经退行性疾病的 发生密切相关。通过变性蛋白的复性，可以深入探究这些疾病的发病机制，为药物研发
和治疗方法提供新的思路。
复性机理的深入研究
目前对变性蛋白复性的机理仍不完全清楚，需要进一步深入研究。例如，研究不同变性条件对蛋白质 结构的影响、蛋白质复性过程中的动力学行为等，有助于深入理解变性蛋白的复性机理，为复性方法 的改进提供理论支持。
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详细描述
在酸性或碱性环境中，变性蛋白的复性效果较差。而在中性pH值条件下，变性 蛋白的复性效果最佳。这是因为蛋白质在等电点附近的pH值下，其分子间的静 电作用力最小，有利于蛋白质分子的重新折叠和复性。
离子强度
总结词
离子强度对变性蛋白的复性具有重要影响。
详细描述
在低离子强度下，蛋白质分子间的电荷相互作用较强，容易形成聚集物，不利于 复性。而在高离子强度下，蛋白质分子间的电荷相互作用被屏蔽，蛋白质分子更 容易展开和复性。因此，选择适当的离子强度是变性蛋白复性的关键。
变性蛋白的复性ppt课件
contents
目录
• 引言 • 变性蛋白的形成 • 变性蛋白的复性方法 • 变性蛋白复性的影响因素 • 变性蛋白复性的应用 • 结论
01 引言
目的和背景
介绍变性蛋白复性的研究意义
蛋白质变性后，其结构和功能受到严重影响，导致许多生物 过程紊乱。因此，研究变性蛋白的复性具有重要意义。
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生化重点
蛋白质变性denaturation of protein ：理化作用下，空间空间结构破坏，即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失。
DNA变性与复性: DNA变性：某些理化因素导致DNA双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，使双链DNA解离成单链。
DNA复性：当变性条件慢慢除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构。
增色效应 hyperchromic effect :在DNA解链过程中，由于更多的共轭双键得以暴露，DNA在260nm处的吸光度增加。
酶的活性中心active center：酶的必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能使底物稳定结合，并使底物转化为产物的区域。
竞争性抑制作用 competitive inhibition：抑制剂可与底物竞争酶活性中心，从而阻断酶与底物结合成中间产物。
变构调节 allosteric effect：体内的代谢物与关键酶分子活性中心外的某个部位可逆的结合，使酶发生变构，而改变其催化活性，对酶催化活性的调节方式称为变构调节。
糖酵解及糖酵解途径（glycolysis or glycolytic pathway）：在机体缺氧条件下，葡萄糖经一系列酶促反应生成丙酮酸进而还原生成乳酸的过程。
第一阶段是由葡萄糖分解为丙酮酸，即糖酵解途径，第二阶段是由丙酮酸还原成乳酸，均在胞质中进行。
糖异生(glyconeogenesis)：从非糖化合物（乳酸、甘油、生糖氨基酸）转变为葡萄糖或糖原的过程。
底物水平磷酸化（substrate levephosphorylation）ADP或其他核苷二磷酸的磷酸化作用与底物的脱氢作用直接相偶联的反应过程。
脂肪动员(fat mobilization)：储存在脂肪细胞中的甘油三脂，被酯酶逐步水解为游离脂酸和甘油并释放入血，通过血液运输至其他组织氧化利用的过程激素敏感性脂肪酶(hormone sensitive triglyceride lipase)：是脂肪分解的限速酶。
变性蛋白的复性
包含体的优势：
富集目标蛋白：包含体具有高密度，易于分离纯化的优势； 抗蛋白酶：重组蛋白以包含体的形式存在有效地抵御了大肠杆菌中的蛋白酶对目的蛋白的降解； 对宿主毒性小：生产那些处于天然构象对宿主细胞有毒害的蛋白有优势。
一、包含体形成的原因
主要是高水平表达的结果。 在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白的正确折叠的速率就会导致包含体的形成。 重组蛋白在大肠杆菌中表达时，缺乏一些蛋白折叠过程中需要的酶和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等。
第十一节 变性蛋白的复性
以大肠杆菌作为表达系统生产基因工程药物时,药物蛋白通常会形成无活性的蛋白聚体即包含体,它们的一级结构即氨基酸序列是正确的,但空间结构错误,没有生物学活性。需要一个复性过程才能得到生物活性蛋白。
包含体是无定形的蛋白质的聚集,不被任何膜所包围。细胞破碎后,包含体呈颗粒状,致密,低速离心就可获得。欲获得天然活性态的目标产物,必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。
加20％PEG4000至终浓度为0.2％，加50mM的氧化型谷胱甘肽至终浓度为１mM,加100mM的还原型谷胱甘肽至终浓度为２mM,静置30min至２h（亦可４℃复性过夜）。 以PBS（pH8.0)或TE（pH8.0)透析，取出-20℃保存备用。 .检验复性是否成功。 Buffer A配方： Tris-base 50mM,EDTA 0.5mM,NaCl 50mM, 甘油5% ,DTT 5mM
PART ONE
复性缓冲液的pH要远离等电点；离子强度不易过高，10-50mmol/L，离子强度太高蛋白质易发生沉淀，也不利于离子交换层析的分离；复性液温度不易过高在4℃-10℃较合适，对于耐热蛋白也可以室温复性；复性时间，以天然表达的重组蛋白复性应在6hr以上。
12 蛋白质复性
复性有关理论
两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分 子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的 疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构 的蛋白质分子。 按拓扑学观点认为：虽然蛋白质内部基团相互作 用复杂，使得不同蛋白质的折叠复性过程不相同，但 不同蛋白质多肽链穿越空间的形式可能会是相同或类 似。实验中也发现，蛋白质拓扑结构的氨基酸序列不 改变对蛋白质的折叠速度等参数影响很很少。因此， 该理论认为，蛋白质的折叠过程的许多参数及其折叠 机理可能与蛋白质的拓扑结构有密切关系。
包涵体加工流程
机械破碎法
包涵体提 取
离
心
去除细胞碎片 （ 膜蛋白和脂类等）
如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化 的一个难题
包涵体的洗涤
• 为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 • 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如 2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍 会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。 • 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA
• 3）变性剂浓度和复性时间
• 在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L 盐酸胍、 8mol/L Urea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐酸胍和 Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的疏水相互作 用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用的形成。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一 段时间，I就可以慢慢地向N转化
包涵体形成的几种可能性
研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成 包涵体。 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其 在细胞内溶解度时沉淀； 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫 键不能正确配对； 3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译 后修饰酶及分子伴侣等)不足； 4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro 含量越高越容易形成包涵体。 5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。 6）丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不 佳时，容易形成包涵体。
蛋白质变性与复性
3、变性剂的影响
尿素、盐酸胍， 甲基乙酰胺、 尿素、盐酸胍，N-甲基乙酰胺、甲基胺等 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 有些蛋白质还发生凝集和沉淀 变性机制：破坏氢键？？？ 变性机制：破坏氢键？？？ 用途？ 用途？
牛胰核糖核酸酶的变性与复性 （rancreatic ribonuclease)
不少蛋白质的变性之所以不可逆, 不少蛋白质的变性之所以不可逆,主要是所需 条件复杂. 条件复杂. 折叠所需的辅因子 解离与缔合条件的掌握 巯基的保护
(二)蛋白质变性和复性的动力学模型 二 蛋白质变性和复性的动力学模型
二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 可逆体系, 可逆体系,存在平衡
（五）变性蛋白质经过的构象
1、经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 2、经过酸、碱以及热变性的蛋白质，肽链不 经过酸、碱以及热变性的蛋白质， 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 3、由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 变性的蛋白质，螺旋增加， 变性的蛋白质，螺旋增加，不存在疏水键
（二）变性概念
涉及构象变化， 涉及构象变化，二硫键的断裂及侧链基团的化学修饰 吴宪： 吴宪： 天然蛋白质分子从紧密有序的结构 松散无序结构的过程。 松散无序结构的过程。 缺点： 缺点：没有与生物活性的变化联系
由于外界因素的作用， 由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子 构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的丧失以及物理、化学性质的异常变化 ， 的丧失以及物理、 以及物理 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation 。 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。
120 第十九章 蛋白质变性与复性
效价 x1000 0.1 0.2 0.5 1 2 5
8.5
9
10
5
3
3
粘稠剂对SCF复性的影响
尿素(M) 效价 x1000 0 7 0.5 8 1 8 1.5 10 2 10 2.5 9
PEG％
效价 X1000 环糊精 ％ 效价 X1000 甘油％
0.1
6
0.2
6
0.5
10
1
10
如果将还原剂和脲同时除去，并且 稀释还原的蛋白并将它于生理pH条件下 暴露在空气中，Rnase A会自发地获得 它的天然构象，恢复正确的二硫键和充 分的酶活性。实验表明正确的二硫键只 有当蛋白质折叠成它的天然构象后才能 形成。
疯牛病是由于蛋白变性引起的
一种名叫Prion（朊病毒 ）的蛋白质 （28KD）已经被证实是疯牛病以及其它相关 疾病，如羊的搔痒症以及人类的海绵状脑病的 致病介质。
2
10
5
8
0.1
8 0.1
0.2
8.5 0.2
0.5
10 0.5
1
10 1
2
9 2
5
9 5
效价 X1000
8.5
8.5
10.
10
9
9
缓冲液浓度对SCF复性的影响
浓度 mmol/ L 效价 x1000
20
50
100
200
500
1000
10
10
10
9
5
3
复性时间和温度对SCF活性的影响
复性时间 （h） 效价 x1000 24 9 48 10 72 10
加脲和 巯基乙醇
核糖核酸酶A变性，酶的三级结 构和活性完全丧失，生成含有8 个巯基的多肽链。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
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蛋白的变性和复性
变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.
蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.
变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：
（一）生物活性丧失
蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变
蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变
蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。
天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白
质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。
所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。
复性：如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的。
如果变性条件不剧烈，这种变性作用是可逆的，说明蛋白质分子内部结构的变化不大。
这时，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。
外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低, 一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。
包涵体：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很
高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等
一般的水溶液很难溶解包涵体，只有在变性剂溶液中才能很好溶解，这时，溶解的包涵体蛋白获得完全变性，即除一级结构和共价件保留外，所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链全暴露。
然后，在一定条件下除去变性剂促使产物蛋白完成正确的蛋白折叠过程，获得天然结构，该过程称为复性。
主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键,经过多个中间折叠最终形成天然三维结构，包涵体很可能就是表达蛋白不适当的中间折叠高浓度积聚在一起的不溶物。
由于包涵体中的重组蛋白缺乏生物学活性，加上剧烈的处理条件，使蛋白的高级结构破坏，因此重组蛋白的复性特别必要。
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。
一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。
对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。
包涵体蛋白复性方法
1稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制。
目前稀释法主要有一次稀释、分段稀释和连续稀释三种方式。
2透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，有人称易形成无活性蛋白质聚体，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
3超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。
4柱上复性：是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法，包涵体蛋白变性后，在色谱柱上复性，大致可分成疏水柱复性及凝胶柱复性两类。
其中的凝胶柱复性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子筛填料，柱较长（40cm-100cm不等）。
相比稀释和透析两种方法，色谱柱复性回收率高（高达90%以上）、快速、易放大，样品稀释倍数小（一般五倍左右）[5]
5高蛋白质浓度下的复性：通常有两种方法，一是缓慢地连续或不连续地将变性蛋白加入到复性缓冲液中，使得蛋白质在加入过程中或加入阶段之间有足
够的时间进行折叠复性；二是采用温度跳跃式复性，即让蛋白质先在低温下折叠复性以减少蛋白质聚集的形成，当形成聚集体的中间体已经减少时，迅速提高温度以促进蛋白质折叠复性。
此外，吸附法、反胶束法和双水相萃取法等都可用蛋白质的复性。
复性效果的检测：
根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，
4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，
值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
[11]
防止包涵体的形成：包涵体很少是100％的，有一部分的可溶蛋白存在，一部分是包涵体，通过增加可溶性蛋白的比例为策略，改变折叠中间体的形成速率，降低中间体相互作用，加快正确折叠形成天然结构的速率。
1：降低细胞生长温度：正在折叠的中间体聚集主要是通过疏水表面相互作用产生，在较低温度下疏水表面的相互作用减弱，
2：共表达分子伴侣：分子伴侣是一些蛋白质，他们可利用水解ATP释放的能量维持一些折叠蛋白的溶解状态，
3：改变渗透压：大肠杆菌表达农用菌转移酶时，有90％以上形成包涵体，但是存在山梨醇和甘氨酰甜菜碱，时，该酶几乎完全以可溶的形式表达其机理。
其
机理可能是山梨醇促进细胞摄取甘氨酰甜菜碱，后者通过优先水合作用稳定蛋白结构。
4：融合蛋白：目的蛋白基因与特定的基因融合表达可能会减少包涵体的形成。