细胞的细菌、真菌污染及排除
细胞培养污染拯救及预防方法
细胞培养污染拯救及预防方法概论污染是细胞培养的大敌。
预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。
(一)污染的类型细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。
1、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。
最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2、真菌污染真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
丝状菌污染3、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。
开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。
多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。
但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
阳性阴性支原体污染4、病毒污染组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。
目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
细胞常见污染情况分析报告
细胞培养常见污染的判别及应对措施2011-01-02 10:19:04| 分类：实验| 标签：污染无菌细胞培养基灭菌|字号大中小订阅一、避免细胞培养污染的措施：污染是细胞培养中一个大敌，一旦污染，前功尽弃！决定要进行细胞培养，首先一定要有强烈的无菌意识！操作中要遵守严格的操作规程，不要怕麻烦，越细心越好！注意以下几点，大部份的污染是可以避免的：1. 每次开始实验前，先用紫外照无菌台和实验室20分，用酒精擦手，台面和不消毒的器械（如移液枪等）；实验中，如允许，尽量多过火，开起或盖盖都靠近火焰或在无菌台深处；使用无菌台后，再用酒精擦台面，紫外照20分！2. 滴管不要接触瓶口，吸取废液及加入新鲜培养基时都要注意不要滴在瓶口上等等。
3. 凡是接触瓶口后都要用酒精灯烧烧。
4. 提取组织时，往往头会距离组织很近，所以带口罩很重要！还要换无菌衣（紫外照过的白大褂）。
5. 注意配制完全培养基时不要发生污染，在使用前一定要做无菌培养，因为一般应用污染后的培养基培养细胞后，很快就会发生特别严重的污染。
6. 操作时一定按照实验室的要求，切忌粗心大意。
7. 使用完的东西尽快移出无菌台！另外无菌台上的器械，试剂摆放，也尽量遵循一定的顺序！依污染可能程度依次向外摆。
二、常见的细胞培养污染：下面是几种细胞培养过程中常见的污染：1. 支原体污染：传说中的黑焦虫，长得暴快。
24小时就满视野都是了。
污染源大多数情况下是培养用血清。
图1 支原体污染的光镜检测（圆圈所示，×10倍）图2 支原体污染的光镜检测（×20倍）图3 支原体污染的荧光检测图4 支原体污染的电镜检测（×30k，煎蛋状和其他形状）图5 支原体污染的电镜检测2. 念珠菌污染：似乎无处不在，而且顽固得很。
长得暴快（12h就能在细胞上面密布）。
培养液澄清。
低倍显微镜下像黑色的沙子铺在细胞上，高倍镜下呈树枝状或葡萄状。
图6 念珠菌污染的光镜检测（低倍镜）图7 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图8 念珠菌污染的光镜检测（高倍镜）图9 念珠菌污染的检测（革兰氏染色阳性）这么大面积的污染，你可以看看是不是操作上出了问题，要不然就是培养基的问题。
细胞培养中常见的污染及处理@麦粒
常见细胞污染及其处理方法麦~粒（2012级生物化学与分子生物学专业）摘要：细胞培养是生命科学实验及生物医药产业化中的一项关键技术，细胞污染问题一直是细胞培养中的大敌。
本文综述了细胞培养中污染的类型、处理方法和预防措施等，以期为实验室细胞培养中遇到的细胞污染的解决提供参考。
关键词：细胞培养，细胞污染，支原体污染细胞培养技术是现代生命科学研究中不可缺少的一项基本实验技术，同时也是细胞工程中的核心技术之一。
细胞培养的质量好坏直接关系到实验结果的可靠性与否以及产品质量的合格与否。
在细胞培养中，最基本的原则就是无菌操作，污染是细胞培养最致命的大敌，预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。
特别是对于一些珍贵的细胞株，一旦污染对实验可能就是毁灭性的。
1 污染的类型细胞污染的类型可分为物理、化学、生物三类。
其中化学、生物因素最为常见，物理因素最易被忽视。
1.1物理污染物理性污染通过影响细胞培养体系中的组分，从而影响了细胞的代谢。
最为常见的是温度和辐射（紫外线照射）。
过冷或过热的温度对细胞可引起细胞生理状态的改变，如从冰箱中取出的培养液直接加至37℃培养的细胞中可能会造成细胞应激，影响某些实验现象的观察。
在生物安全柜紫外灭菌时，应当遮蔽对紫外线敏感的试剂，同时普通操作中也要注意对见光易分解的物质进行避光处理。
对于需要使用同位素标记的某些实验，应当注意细胞、试剂周围不能放同位素。
除此之外，有时操作过程中偶尔有异物落入，极易造成污染。
一些小的颗粒状异物作为是微生物污染的载体进入培养液中造成细胞污染。
另外，实验过程中酒精棉球的棉絮、移液器枪头上的某些塑料碎屑等都有可能增加染菌的概率。
1.2化学污染细胞培养中的化学污染大多是由于实验准备或实验过程中造作不当造成的。
在实验准备阶段，细胞培养室中的器皿应做到专用，避免与常用器皿混用。
此外，细胞用器皿洗刷过程中要注意洗刷彻底，不可有洗涤剂等残留。
高压灭菌时应灭菌彻底，并在灭菌后的生物安全柜中打开使用。
细胞无菌检测总结
细胞无菌检测总结背景介绍在细胞培养实验中，细胞的无菌性是一个十分重要的指标。
细胞的无菌性检测可以帮助我们确定培养过程中是否发生了细菌、真菌或其他微生物的污染。
若发生了污染，可能会对实验结果产生严重的影响。
因此，进行细胞无菌检测是非常必要的。
常用的细胞无菌检测方法1.培养基菌落法：将培养基均匀地涂布在含有细胞的培养皿上，然后在适当的温度下孵育一段时间。
观察培养皿上是否有菌落的生长。
若出现了菌落，则说明细胞培养中存在细菌或真菌的污染。
2.DNA分子检测法：通过提取细胞培养物的DNA，使用示踪探针或荧光染料进行PCR反应，扩增并检测常见的细菌和真菌的DNA序列。
若检测到了目标DNA序列，则说明细胞培养物中存在细菌或真菌的污染。
3.常规培养法与生化法：将细胞培养物接种到适合生长的培养基中，并观察是否有菌落的形成。
如果菌落形成了，可通过进一步的生化试验来确定菌落的类型，从而确认是否存在细菌或真菌的污染。
细胞无菌检测的步骤与注意事项1.实验前准备：•实验器材和培养基的消毒：使用高温高压灭菌器或消毒液对实验所需的培养皿、培养液和其他器材进行消毒处理，确保其无菌性。
•实验操作区域的清洁：对实验操作区域进行彻底的清洁，包括试验台面、操作工具和周围环境。
•严密控制环境：保持实验室尽量干燥、无尘、无霉，确保实验环境的无菌性。
2.细胞培养无菌检测步骤：•提取样品：将要进行无菌检测的细胞样品轻轻地收集到一个无菌的容器中，注意避免任何可能的污染。
•培养基的制备：根据实验需要选择适当的培养基，并按照操作指导书的要求制备。
•培养基划线法：将培养基均匀涂布在培养皿中，然后将细胞样品均匀涂布在培养皿上。
•孵育：将培养皿放置在适当的温度和湿度下，孵育一段时间。
这段时间要根据细胞的生长特点和培养基的要求来确定。
•观察结果：在培养基上观察是否有细菌或真菌的生长。
若出现菌落，则可能存在细菌或真菌的污染。
3.注意事项：•注意无菌操作：在进行细胞无菌检测的过程中，保持无菌操作是非常重要的。
如何正确判别细胞培养中的细菌与真菌污染
如何正确判别细胞培养中的细菌与真菌污染在进行细胞培养实验的过程中，细菌与真菌污染是一个常见但也十分令人头疼的问题。
当我们在观察和分析细胞时，准确判断细胞培养中的细菌与真菌污染是至关重要的。
本文将从不同的角度探讨如何正确判断细胞培养中的细菌与真菌污染。
一、观察细胞形态观察细胞形态是判断细胞培养中是否存在细菌与真菌污染的一种重要方式。
细菌和真菌的形态和生长方式有很大的差异。
细菌在培养皿中呈现为小圆点状或线状的结构，而真菌则可能形成大而明显的菌落或菌丝。
此外，真菌会产生孢子，看起来像是一串串小颗粒。
通过观察细胞周围的结构，可以初步判断是否存在细菌与真菌污染。
二、检测培养基上的生长情况细胞培养中的细菌与真菌污染通常会导致培养基上的生长情况发生变化。
如果培养基上有细菌或真菌的存在，通常可以观察到菌落的形成。
在培养过程中，我们可以观察细胞生长的速度、密度和均匀性等指标，如果存在污染，这些指标可能会出现异常情况。
在评估培养基上的生长情况时，需要结合细胞培养的实际要求进行综合判断。
三、使用染色试剂染色试剂在细胞培养中的细菌与真菌污染判别中发挥着至关重要的作用。
常用的染色试剂有格拉姆染色和甲苯胺蓝染色等。
通过染色试剂的使用，细菌和真菌会呈现不同的颜色和形态。
细菌会呈现出紫色或蓝色，而真菌则通常呈现为绿色或红色。
通过对样品进行染色和观察，可以明确判断是否存在细菌与真菌污染。
四、利用PCR技术PCR技术是一种高灵敏度和高特异性的基因检测技术，可以用于检测和鉴定细菌和真菌。
通过PCR技术，可以对细胞培养样品中的DNA进行扩增和分析，从而确定是否存在细菌与真菌污染。
PCR技术可以选择合适的引物，针对不同的细菌和真菌进行特异性扩增，提高判断污染的准确性。
五、更加严格的无菌操作在细胞培养实验中，更加严格的无菌操作是避免细菌与真菌污染的关键。
在实验过程中，我们应该始终保持实验室台面、培养皿、试管等工作区域的清洁。
在进行细胞培养前，用酒精或其他消毒液对操作台面进行清洁和消毒，避免细菌的传播。
细胞培养中霉菌污染问题讲解学习
细胞培养中霉菌污染问题Julius：我的细胞被污染了，表现为培养液内有浑浊，可见很多白色粉末的东西悬浮，之前发现一瓶有，就丢了，剩下的及时换液，清洗，可在传代后的第二天就又见浑浊，仍有部分细胞是贴壁的，可以看到很多”细胞“首尾相连成一条条的线状，可细胞怎会是线状生长呢？（抱歉没有拍下照片）请问是霉菌还是细菌污染呢？如何区分细菌，霉菌及真菌的污染。
现在如何处理呢？污染控制区大家所说的用甲醛熏蒸，碘伏擦拭，或75％酒精擦拭，是用那种呢？时间要多长呢？因培养箱内还有别人的细胞，现在消毒处理时剩余的细胞该怎么办呀？还应注意什么呢？liyq_1：应该是霉菌污染.其特点正是肉眼可见白色悬浮,形态呈线状.qxlbljys：1.细菌污染液体混浊,霉菌污染可看见霉苔但液体不混,所以你的细菌和霉菌同时污染处理:扔掉,以免污染其他细胞2.你说的线状生长实际上细胞已经接近死亡3.可以将培养箱用75%的酒精擦拭,并停止细胞培养,然后用紫外消毒房间sunandsuny：由于细菌的生长分裂呈指数级的生长方式,所以细菌污染后,培养瓶很快就是浑浊的了,但一般不像霉菌污染,霉菌有菌丝,往往呈絮状漂浮,甚至有丝状突起.因此霉菌污染和细菌污染在肉眼上有时可以大体上区分,这只是一些常规的经验,如果要具体确定,还要通过涂片染色,看看是球菌或杆菌或是弧菌．叶知秋：原代培养的软骨细胞，贴壁良好，长势旺盛，可霉菌悄然而至，大有疯长之势。
不想放弃，该如何处理，敬请指点。
ratman：配制以下5X抗生素培养液：AMP:100ug/ml, gentamycin 100ug/ml, 两性霉素B 2ug/ml, 制霉菌素1.5ug/ml, 脱氧胆酸钠10ug/ml，进行冲击，培养时间为8小时后换液，改用1X抗生素培养液进行培养，以上配方为1x配方。
每天换液。
icesugar75：别救了。
霉菌是抗拒不了地，别让这瓶细胞把其它的污染了最重要。
eming43：同意楼上的，如果细胞不是珍贵的没有了，最好是放弃。
细胞培养中常见污染
最近看到不少问有关细胞培养污染的事，正好我看到了一个有关这方面的总结，很全很好很强大，跟大家分享下细胞培养中常见的污染情况总结如下:常见的污染如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。
或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。
CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。
并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。
待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。
孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。
其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。
，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
细胞培养污染问题及解决方案
一、细菌污染状态：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
预防和补救：1.仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间和压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要检查培养液是否存在浑浊现象！2.可在培养液或血清中加支原体预防剂。
3.若细胞一旦污染，建议加支原体清除剂，能清楚常见的革兰氏阴性和阳性菌。
二、霉菌及真菌污染状态：肉眼观察培养基发现培养基颜色基本无变化，不浑浊，但是培养基中由絮状漂浮物，显微镜下观察，若感染真菌可看到分叉细丝状的结构（不同种类结构不同），若感染霉菌显微镜下可看到片状的结构，不透明，真菌及霉菌对影响细胞的生长影响不大。
预防和补救：1.保证细胞房的干净整洁，干燥的环境(潮湿的环境利于霉菌及真菌的生长)。
2.控制外来人员进出实验室。
3.对实验室及培养箱进行彻底消毒。
4.若细胞非常珍贵，且不易获得，可以对污染的细胞采取如下操作。
悬浮细胞：收集细胞并离心，用PBS漂洗，重复此操作数次。
贴壁细胞：用PBS轻轻冲洗细胞，丢弃，重复此操作数次。
三、支原体感染状态：镜下黑色，多为多形，培养液一般会浑浊，国内血清很多没做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
而且它不能用过滤的办法除去。
支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
预防和补救：预防：实验室新购买的血清及培养基需检测是否含有支原体，引进的新品种细胞需做支原体检测，向培养基中添加预防支原体的抗生素。
补救：向培养基中添加抗生素，（如氧氟沙星10 μg/ml、环丙沙星10 μg/ml、卡那霉素20~50 μg/ml、四环素10~50 μg/ml、庆大霉素200μg/ml等抗生素），或者向培养基中添加支原体清除剂清除支原体数天。
四、黑蛟虫状态：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去，培养液不浑浊，一般不会太影响，细胞还可以用。
细胞污染的种类有哪些
细胞污染的种类有哪些1. 异物污染细胞培养的一个常见问题是异物污染。
异物污染是指在细胞培养过程中，由于一些外部因素导致培养器具或培养介质中出现的异物。
这些异物可能包括灰尘、纤维、酵母、细菌、真菌、病毒等。
这些异物不仅会干扰细胞的生长和功能，还可能引起未知的变化和不确定的结果。
因此，在进行细胞培养实验时，要特别注意避免异物污染。
2. 细胞污染细胞污染是指在细胞培养的过程中，细胞本身受到一些外部因素的污染，从而导致细胞的变异、功能受损甚至细胞死亡。
细胞污染可以由以下几种常见的污染源引起：a. 细菌污染细菌污染是细胞培养中最常见的污染之一。
常见的细菌污染源包括实验环境中的空气、实验器具、培养介质等。
细菌污染会导致细胞生长受阻、感染和细胞凋亡等，严重时甚至会使细胞无法继续培养和使用。
b. 真菌污染真菌污染是指一些真菌，如酵母菌等进入细胞培养环境中并污染细胞。
真菌污染会引起细胞外观的改变、生长受阻、功能受损等问题。
在细胞培养实验中，应特别注意真菌污染的防控。
c. 病毒污染病毒污染在细胞培养中较为罕见，但一旦发生，对细胞的影响极大。
病毒污染会导致细胞的变异、功能失调甚至细胞死亡。
因此，进行细胞培养实验时，必须定期进行病毒检测，并采取相应的防控措施以避免病毒污染的发生。
d. 交叉污染交叉污染是指在细胞培养过程中，细胞株之间或批次之间发生的互相污染。
细胞培养实验室中经常同时进行多个细胞系的培养，因此，交叉污染的风险也相应增加。
交叉污染会导致细胞株的混杂和受污染细胞株的功能异常。
为了避免交叉污染，实验室应有严格的实验室操作流程，并定期检测细胞株的纯度。
3. 其他污染除了以上几种常见的细胞污染，还有一些其他类型的污染也可能影响到细胞培养实验的结果，例如：•化学物质污染：来自培养介质、溶液、培养基等中的化学物质可能对细胞产生毒性影响，导致细胞的变异或死亡。
•辐射污染：细胞培养过程中可能存在来自辐射源的污染，这可能会对细胞的遗传物质和生理功能产生不可逆的损害。
CELL-污染与排除
3.操作过程中的预防 3.操作过程中的预防
不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立， ① 不宜过早开瓶；开瓶后瓶口不能与风向相逆，保持斜立， 不再使用的培养液应立即封闭瓶口, 不再使用的培养液应立即封闭瓶口,不允许触及器皿的 无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）； 无菌部分（瓶口及瓶塞内侧）； ② 开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作； 开启及关闭瓶口时注意火焰烧灼及火焰附近工作； 应专管专用； ③ 应专管专用； 培养的细胞勿过早暴露于空气中； ④ 培养的细胞勿过早暴露于空气中； 操作时不准交谈、咳嗽； ⑤ 操作时不准交谈、咳嗽； 操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面， ⑥ 操作完毕应整理好工作台面，并消毒擦拭工作面，关闭超 净工作台。 净工作台。
三.操作 器材和溶液使用前未仔细检查是否污染过 ； 吸管、刀、剪沾染微生物； 瓶口封不严； 培养两种以上细胞，使用同一吸管或营养液。 四.血清 被支原体和病毒污染。
五. 组织
手术中污染； 组织本身带菌； 用碘酒后擦拭不净造成碘污染。
第二节 污染对细胞的影缓慢、分裂相减少、粗糙、轮廓增强。 停止增殖，分裂相消失， 停止增殖，分裂相消失，胞质中出现大量堆 积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 积物，变圆或崩溃从瓶壁脱落。 污染物不同，对细胞的影响不同。 污染物不同，对细胞的影响不同。
真菌污染
（二）细菌污染
培养液变黄，混浊； 以内很明显; 培养液变黄，混浊；48h以内很明显 细胞很快 以内很明显 崩解死亡。 崩解死亡。 镜下可见菌体。 镜下可见菌体。 污染后细胞发生病理改变， 胞内颗粒增多、 污染后细胞发生病理改变 ， 胞内颗粒增多 、 增 最后变圆脱落死亡， 粗 ， 最后变圆脱落死亡 ， 造成试验失败和细胞 株(系)丢失。 系 丢失。 丢失
常用的细胞培养方法、污染及污染处理
常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。
通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。
本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。
通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。
二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。
以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。
细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。
这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。
悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。
这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。
微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。
细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。
三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。
它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。
共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。
在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。
三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。
污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。
细胞污染的检测与去除
第二章 动物细胞培养第四节 细胞污染的检测与去除细胞培养最怕的就是细胞污染。
一旦细胞发生污染，轻的，导致实验无法正常进行，严重的，可能会导致细胞株的丢失。
细胞污染：是指细胞培养物中混入培养环境中的对细胞生存有害的成分或造成细胞不纯的异物。
细胞污染的主要途径有：1）空气因素：空气是微生物传播的最主要途径。
在超净工作台、细胞培养室工作时，不戴口罩，不带头套，面对操作间大声讲话、咳嗽等均可能造成细胞污染。
2）器材因素：主要是细胞培养用器材清洗消毒不彻底，致使污染物残留；培养箱没有定期消毒，易使细菌、霉菌孽生，形成污染。
3）操作因素：实验操作者无菌观念不强、操作不规范、甚至使用污染的器具等。
培养两种以上细胞时，交叉使用吸管或培养液瓶等导致细胞交叉污染。
4）血清或培养基：有些血清生产时已被支原体或病毒等污染，有的在培养基配制过程中已经污染，或者在培养基的存放过程中导致了污染。
5）组织样本：尤其在进行原代培养时，组织样本可能带菌，导致污染。
细胞污染的主要类型有（图1）：图1 细胞污染的主要类型第一，细菌污染：细菌是细胞培养中最常见的污染。
细菌种类繁多，形态多样，可呈球状、杆状和螺旋状。
因为细菌的繁殖速度快，被污染后，往往一天内即可通过肉眼观察发现，pH值也会突然降低，培养基的颜色也会很快变化，培养液会变浑浊。
轻微细菌污染的去除: 可使用5-10倍常用抗生素剂量的冲击法，加抗生素作用24-28 h，再换成常规培养液，有时可排除污染，但大部分细胞培养的细菌污染发现时就已经很严重了，无法挽救，最好直接丢弃，防止污染的扩大。
细胞培养细菌污染的主要检测方法有：肉眼观察法；培养检查法；显微镜观察法；PCR检测法等。
1）肉眼观察法：（图2），如图，这是正常生长细胞在不同时间的培养基的颜色，污染细胞培养基会变得浑浊，培养基会快速变黄（因大量细菌繁殖会导致pH 快速下降）。
刚传代细细胞培养中需要传代的细图2 正常生长细胞培养基的颜2）培养检查法：就是用细胞培养上清在无菌琼脂糖培养基平板上划线培养，37℃培养箱中培养过夜，看是否有细菌菌落长出（图3）。
细胞培养技术中常见的细胞污染问题及处理方法
细胞培养技术中常见的细胞污染问题及处理方法细胞培养是生物学研究中经常使用的一种重要技术手段。
然而，随着研究的深入，细胞培养中常常会遇到细胞污染的问题，这给实验结果的可靠性和准确性带来了很大的影响。
细胞污染主要包括细菌、真菌、酵母、病毒以及其他的微生物污染。
在细胞培养中，如何及时发现和处理细胞污染问题，是每个实验室都需要面对的重要课题。
细菌污染是细胞培养中最常见的问题之一。
造成细菌污染的原因有很多，比如培养器具不洁净、操作不规范等。
当出现细菌污染时，可以通过观察培养物的外观变化来初步判断是否受到污染，比如培养物颜色的改变、气泡的形成等。
如果存在细菌污染的症状，可以通过将培养物进行细菌培养或细菌PCR检测以确认。
一旦确认细菌污染，需要立即更换培养器具，重做培养基，并对培养箱等设备进行彻底清洁和消毒。
真菌和酵母的污染在细胞培养中也是相对较常见的问题。
真菌和酵母污染一般表现为培养物的颜色变化、膜片上出现菌丝等。
当怀疑存在真菌和酵母的污染时，可以将培养物进行不同培养基上的转接和形态学观察，也可以通过真菌和酵母的特异性培养基进行检测确认。
处理真菌和酵母污染的方法包括体外灭菌、常规抗生素处理、加入抗真菌和酵母的药物等。
另外，病毒是一种较为严重的细胞污染问题。
病毒感染可以导致细胞凋亡、细胞功能紊乱甚至细胞死亡。
常见的病毒污染有常见冷感冒病毒、乙肝病毒等。
病毒污染的判断往往需要通过病毒培养、PCR或ELISA等技术进行鉴定。
处理病毒污染可以采用病毒灭活剂或直接更换细胞系等方法。
除了微生物污染外，还存在一些其他的细胞污染问题。
比如，细胞交叉污染是指来自其他细胞系的细胞误将自己的培养物中。
为了避免细胞交叉污染，可以采用细胞系的DNA指纹鉴定技术，或者使用经过认证的培养物，同时加强无菌操作的培养。
总结起来，细胞培养中的细胞污染问题多种多样，但我们可以通过细心观察培养物的变化、培养基的转接和不同培养基的形态学观察、特异性培养基的检测以及分子生物学方法的应用等，及时发现和处理细胞污染问题，确保实验的可靠性和准确性。
养细胞中有小黑点,是碎片or污染,如何防范处理
养细胞中有小黑点，是碎片or污染，如何防范处理养细胞中有小黑点，是碎片or污染？如何防范处理相信很多养细胞的新手都遇到过，在养细胞中，细胞在显微镜下观察小黑点，背景比较脏。
遇到这样的问题又不知道怎么去辨别细胞情况！！！如果在显微镜下观察到了小黑点，基本上可以将范围缩小到是细菌污染还是细胞碎片。
到底是污染还是碎片，可从以下几个方面进行判断：1、运动性：很多会动的小黑点，只是发生布朗运动的细胞碎片。
从运动性上比较，浮躁的细菌活跃的多。
2、培养基的浑浊度：如果在显微镜下无法辨认，那就交给时间吧。
细胞培养基对于细菌来说是非常营养的大餐。
一旦发生污染，细菌就会大量繁殖。
培养基PH值迅速下降，培养基变黄且会变浑浊。
通常在12小时内就可以发现，而在48小时内就非常明显。
被污染的细胞培养基变黄且浑浊、未被污染的细胞培养基偏红且澄清。
3、接种平板：将怀疑污染物接种在微生物培养平板中，观察菌落形成情况。
碎片？细菌？一目了然。
对于养细胞的小伙伴，污染是避之唯恐不及，防范于未然更重要。
哪些步骤最容易发生污染？最容易导致细菌污染的一个步骤就是细胞在水浴锅解冻后没有彻底消毒。
如果这个步骤发生污染的话，细胞接种24小时之内就会明显观察到细胞污染。
另外几个可能导致污染的操作是：放培养基的瓶子或者管子在用水浴锅预热后，没有彻底消毒。
实验员在操作过程中枪头有可能接触到被污染的部分而导致细胞污染。
为了防止这种情况，容器外表面包括帽子应喷洒75%乙醇彻底消毒，然后用无菌棉垫擦干。
实验员在操作过程中，移液器的枪尖可能会碰到超菌台内壁或者超菌台内放置的其他瓶子或设备，有时可能会碰到包含细胞的细胞培养瓶外表面，甚至会碰到手套，或者实验操作服的袖口。
以上所提到的任何一项操作失误，都会导致细菌污染。
保持无菌工作区是防止细胞污染的最佳方式：1、使用前和使用后，用75%乙醇对所有工作表面进行消毒。
如果操作过程发生液体溢出的情况，这一项特别重要；2、保持一个整洁的工作空间；工作区应该只包含必须的实验设备；3、在实验之前确保已经准备好所有需要的试剂和耗材，避免反复进出操作区；4、保证整个实验操作在经过彻底消毒的超菌工作台或者生物安全柜中进行。
细胞污染
细胞污染常见有三种：即真菌污染、细菌污染和支原体污染。
细菌污染可见培养液明显混浊，细菌产生的毒素等使细胞崩解、死亡，孔或皿底部常有沉淀物出现，用光学显微镜或倒置相差显微镜观察可见视野内有均匀的点状颗粒，瑞氏或革兰氏染色镜下检查即可确定。
真菌污染这在细胞培养中是比较常见的，尤其是在炎热、潮湿的季节。
此种污染容易发现，肉眼观察大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错于细胞之间。
支原体污染这是目前细胞培养中最常见、不易被察觉、干扰实验结果的一种污染。
支原体在镜下呈暗色微小颗粒，并有类似布朗运动的表现，多位于细胞表面和细胞之间。
但值得注意的是该污染要与血清灭活当中产生的黑色小颗粒或细胞破碎后溢出的内容物如线粒体等进行区别。
细菌过滤器细菌都有一定的大小，如果过滤器的滤膜，或者滤柱，（或者其他的），孔径小于细菌的直径，那么当液体或者气体通过的时候，细菌就被挡住，过不去，那么过去的液体或者气体，就是无菌的。
一般小于0.22微米的孔，应该就可以滤菌了。
然而病毒因为其结构微小，数量级为纳米，所以可以通过细菌过滤器除菌过滤器主要是采用大比表面积，过滤精度为0.22μm以上的微滤滤芯，主要用于防止空气中的杂质和有害细菌、微生物等进入罐体、生产线、无菌室等，引起水质、产品和无菌室环境的变化，满足食品、生化、饮料、啤酒、医药、电子等行业的工艺需要。
用于水处理的罐体的罐内环境保护防止罐体内水体来自空气的污染时，也叫呼吸器。
微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物，个体微小，结构简单，通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚的生物，统称为微生物。
微生物包括细菌、病毒、霉菌、酵母菌等。
（但有些微生物是肉眼可以看见的，像属于真菌的蘑菇、灵芝等。
）病毒是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”，但是它的生存必须依赖于活细胞。
根据存在的不同环境分为原核微生物、空间微生物、真菌微生物、酵母微生物、海洋微生物等。
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细胞的细菌、真菌污染及排除
Edit By Waiting.D
真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。
污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。
霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。
一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。
很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。
镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
真菌污染
细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米（μm）计。
常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。
一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。
倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。
必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h可得结果。
污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
细菌污染
细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多再发生污染48h以内就已明显。
在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有利于及时采取措施予以补救或排除。
培养细胞一经污染，多数较难处理。
如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染，可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理)（具体操作方法可参考细胞培养污染的预
防），复苏或重新购置细胞，再培养。
若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采用5～10倍于常用量的抗生素冲击，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养液，有时可能奏效。
细胞培养中常用的抗生素及用量见下表。
常用抗生素用量和效应
+表示效应程度
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。
这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。
下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。
在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。
例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。
5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
6.重复步骤4。
7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。