牛奶尿素氮测定方法研究

表 5 简化方法与原方法的比较
前处理方法 平均值/(mg·dL-1) n sd 95％置信区间 P
A
12.61±0.29 36
1.55 －0.48～0.56 0.88
D
12.57±0.22 36
2.4 精密度 3 种不同浓度样品的变异系数都较 小，见表 6。平均变异系数为 4.68％，随 MUN 含量增 加，变异系数逐渐减小。
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2009 年 第 45 卷 第 9 期
牛奶尿素氮测定方法研究
黄文明 1,2，李胜利 1，曹志军 1*，王之盛 2* （1.中国农业大学动物科技学院，北京 100193； 2.四川农业大学动物营养研究所，四川雅安 625014）
摘 要：本试验结合二乙酰 - 肟试剂盒法探讨牛奶尿素氮的测定方法。结果表明：对牛奶样品进行 1 500×g
加标试样浓度－原试样浓度 标准物质量÷试样体积
×100％[3]。
表 2 二乙酰－肟试剂盒加样方法
mL
加入物
空白管
标准管
测定管
蒸馏水
0.05
-
-
尿素氮标准液
-
0.05
-
样本
-
-
0.05
肟溶液
2.5
2.5
2.5
酸溶液
2.5
2.5
2.5
1.6 数据处理 试 验 数 据 经 Excel 2007 处 理 后 用 SPSS 13.0 做配对统计分析，结果表示为 x±sd。
2.2 脱 蛋 白 时 间 对 MUN 测 定 结 果 的 影 响 见 表 4。在不脱脂的前提下，方法 C 与方法 D 和方法 E 间 都没有显著差异，但方法 C 与方法 E 间配对检验的 标准差较大，且 95％置信区间未包括 0，表明方法 E 的测定结果没有方法 D 稳定，变异较大，故选择 离 心 15 min。
2 结果与分析
2.1 脱脂和脱蛋白离心速度对 MUN 测定结果的影 响 见表 3。方法 A 比方法 B 测定的 MUN 含量高 25.97%，差异极显著（P < 0.01）；但与方法 C 没有显 著性差异。表明在不脱脂的情况下，经 3 500×g 离 心脱蛋白的前处理方法会显著降低 MUN 的测定结 果，但当脱蛋白离心速度增加到 5 000×g 时，可以 消除乳脂对测定结果的影响，因此，脱蛋白离心速度 增加到 5 000×g 时可以省掉脱脂步骤。
外光谱法操作简单，速度快，国外测定 DHI 就包括 奶中乳脂和真蛋白含量较高，在测定 MUN 时要先
MUN 指标，国内使用较少。二乙酰－肟法对仪器设 脱 掉 乳 脂 和 真 蛋 白 ，翟 少 伟 [1]详 细 介 绍 了 MUN 的
—— —— ———— —— ———— —— —— —— —— —— —— — 收稿日期：2008- 11- 18；修回日期：2009- 01- 15 基金项目：中国农业大学－南京农业大学青年教师开放基金资助 （CN2007008）; 公益性行业 （农业） 科研专项经费资助（nyhyzx07036- 17） 作者简介：黄文明（1983-），男，四川自贡人，硕士
表 3 脱脂和脱蛋白离心速度对 MUN 测定结果的影响
前处理方法 平均值/(mg·dL-1) n sd 95％置信区间 P
A
12.61±0.29 36
1.55 －3.12～－2.08 <0.0001
B
10.01±0.33 36
A
12.61±0.29 36
1.1 －0.74～0.007 0.054
C
12.24±0.29 36
牛奶尿素氮测定值差异不显著（P > 0.05），但离心 10 min 的牛奶尿素氮测定值不稳定。研究结果表明，牛奶样
品可以不脱脂，经 5 000×g 离心 15 min 脱蛋白后测定牛奶尿素氮含量。
关键词：尿素氮；二乙酰－肟法；测定方法；牛奶
中图分类号：S816.401.7
文献标识码：A
文章编号：0258- 7033（2009）09- 0054- 03
测定方法，其前处理方法是先离心 10 min 脱脂肪， 再离 心 20 min 脱真蛋白。赵秀英[2]在测定 MUN 时 也没有脱脂。本试验结合二乙酰－肟试剂盒法研 究脱脂步骤和脱蛋白离心速度对 MUN 测定值的影 响，以寻找更为简便、实用的牛奶样品前处理方
* 通讯作者
法。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
学研究的热 点，而且牛奶取样方便，不会对 奶 牛 造 色的二嗪化合物 ，其 颜 色 的 深 浅 与 尿 素 氮 含 量 成
成应激 。测 定 MUN 的 方 法 主 要 有 二 乙 酰 － 肟 法 、 正比，与同样处理的尿素氮标 准管比较，可 计 算 出
脲酶－波 氏比色法、酶联速率法、红外光 谱 法 。红 尿素氮含量。二乙酰－肟法有商用的试剂盒。因牛
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2.3 简化方法与原方法间的比较 本研究的简化 方 法 比 翟 少 伟 [1] 的 方 法 得 出 的 MUN 平 均 含 量 低 0.32%，没有显著差异（表 5）。这表明，在牛奶样品前 处理过程中，可以不经过脱脂步骤，经 5 000×g 离 心15 min 脱蛋白测定 MUN 含量。
离心 10 min 脱脂，再 3 500×g 离心 20 min 脱蛋白的前处理与不脱脂，3 500×g 离心 20 min 脱蛋白的前处理
相比，牛奶尿素氮测定值差异极显著（P < 0.01），与不脱脂，5 000×g 离心 20 min 脱蛋白的前处理相比，牛奶
尿素氮测定值差异不显著（P > 0.05）。牛奶样品不经过脱脂过程，5 000×g 离心 10 min 和 15 min 与离心 20 min
表 4 脱蛋白时间对 MUN 测定结果的影响
前处理方法 平均值/(mg·dL-1) n sd 95％置信区间 P
C
12.4±0.24 36
0.95 －0.49～0.15 0.277
D
12.57±0.22 36
C
12.4±0.24 36
1.46 －0.71～－0.29 0.396
E
12.61±0.27 36
Abstr act : The appropriate dosage of cycloheximide in determination of lactobacillus in corn silage was studied with 5 experiments by adding 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 and 640 mg/L cycloheximide into MRS culture medium and Martin culture medium. The results showed that growth of mold was inhibited significantly ( P ＜ 0.01) when the dosage of cycloheximide was equal to or above 40 mg/L. Therefore, 40 mg/L could be regarded as the appropriate dosage of cycloheximide when determining or culturing lactobacillus of corn silage. And what's more, the contamination of fungi would be avoided by increasing dilutions of inoculated microorganism, as the amount of lactobacillus was 100 times more than fungi in corn silage. Key wor ds: silage; lactobacillus; cycloheximide; microorganism
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1 材料与方法
1.1 奶样 牛奶样品取自北京三元绿荷第一牧场， 未加防腐剂，4℃保存。 1.2 试剂 三氯乙酸，尿素标准品，二乙酰－肟试 剂 盒 （3 瓶 100 mL 的 酸 溶 液 ，1 瓶 100 mL 的 二 乙 酰－肟溶液，1 mL 尿素氮标准品，南京建成生物技 术公司）。 1.3 仪器 紫外可见分光光度计 （752S），离心机 （LD5- 2A），移液器（5 mL 和 100 μL），三用恒温水浴 锅（DK- 600S）。 1.4 MUN 含量测定 1.4.1 测定参数 分光光度计波长为 520 nm，1 cm 光径玻璃比色皿，温度为室温。 1.4.2 测定方法 牛奶样品前处理方法共 5 种，表 1。取 5 mL 奶样，经过（或不经过）离心脱脂后，取下 清液 3 mL，加入等体积 24％三氯乙酸溶液，再进行 不同离心速度脱蛋白的样品处理。前处理后按照表 2 的方法加样，置沸水浴中水浴 15 min，立即用自来 水冷却，测定 OD 值。
平均 值/%
94.91
3讨论 因乳脂密度低于牛奶密度，蛋白密度高于牛奶
密度，在不脱脂的情况下，3 500×g 离心脱蛋白时， 乳脂不能完全沉淀到离心管底部，分层现象比较明 显，下部是沉淀的真蛋白，沉淀蛋白上部是澄清液 体 ，最 上 层 是 油 状 液 体 ，液 面 有 少 许 结 块 的 乳 脂 ，中 间部分有少许悬浮乳脂。当转速达到 5 000×g 时， 中间层澄清液体高度明显比 3 500×g 离心的高，液 面没有结块的乳脂，但个别有少量乳脂，这可能与乳 脂含量有关。因此，在未脱脂的情况下取样时，枪头 一定要放到澄清液体段。本试验中，未脱脂样品 MUN 含量低于脱脂样品，这可能是因为脱脂减少了 样品总体积，从而提高了 MUN 测定值。
表 6 不同浓度样品的变异系数
样品 1 2 3
测定值/(mg·dL-1) 95％置信区间
7.77±0.41
7.5～8.03Байду номын сангаас
13.7±0.64
13.29～14.1
19.54±0.78 19.04～20.03
CV/% 5.34 4.67 4.01
平 均 值 /% 4.68
2.5 回收率 3 种不同浓度样品的回收率都较高 （表 7），平均回收率为 94.91％，随 MUN 含量增加， 回收率逐渐升高。
表 7 不同浓度样品的回收率
加标前浓度 加标后浓度
样品 /(mg·dL-1)
/(mg·dL-1)
回 收 率 /%
95％置信 区间
1
7.77
23.53 93.86±2.44 92.3～95.41
2
13.70
29.62 94.76±2.74 93.02～96.50
3
19.54
35.69 96.12±3.77 93.72～98.51
（1. Institute of Feed Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2. Department of Animal Husbandry and Engineering, Hebei North College, Hebei Zhangjiakou 075131, China）
表 1 牛奶样品前处理方法
前处理方法
脱脂
转 速 /g
离 心 /min
脱蛋白
转 速 /g
离 心 /min
A
1 500
10
3 500
20
B
-
-
3 500
20
C
-
-
5 000
20
D
-
-
5 000
15
E
-
-
5 000
10
1.4.3 计算
尿素氮含量
(mg/dL)＝ 测定管吸光度 标准管吸光度 -
空白吸光度 空白吸光度
×标准液浓度，标准液浓度为 28 mg/dL。
1.5 精密度和回收率测定 选取一批奶样，测定
MUN 含 量 后 选 出 高 、中 、低 3 个 浓 度 梯 度 奶 样 ，对
此 3 个 不 同 浓 度 的 样 品 ，一 天 内 重 复 测 定 12 次 ，
计 算 变 异 系 数 。 称 取 3.41 g 尿 素 标 准 品 溶 解 在
100 mL 蒸馏水中配 置尿素标准溶液，尿素氮浓度
为 1594.47 mg/dL，在 样 品 离 心 脱 蛋 白 之 前 分 别 取
50 μL 尿素标准品溶液到 3 个不 同浓度的样品中，
分别测定每 个 样 品 加 标 准 溶 液 前 后 的 MUN 浓 度 ，
以此来测定回收率，每个样品 12 个重复。回收率＝
利用牛奶尿素氮（milk urea nitrogen, MUN）来评 备要求不高，一般的实验室都能测定。二乙酰－肟
价 奶 牛 日 粮 能 氮 平 衡 、蛋 白 需 要 量 、氮 利 用 率 、繁 法测定原理是，样 本 中 尿 素 氮 在 氯 化 高 铁 － 磷 酸
殖率以及诊断代谢疾病已成为世界范围内奶牛科 溶液中与二乙酰－肟和硫胺脲共煮，生成一种红